Nestrukturni protein 4B virusa Zika u interakciji s DHCR7 kako bi olakšao virusnu infekciju

SAŽETAK

Zika virus (ZIKV) razvija nestrukturne proteine ​​kako bi izbjegao imunološki odgovor i osigurao efikasnu replikaciju u stanicama domaćina. Nedavno je objavljeno da metabolički enzim holesterola 7-dehidrokholesterol reduktaza (DHCR7) utiče na urođeni imuni odgovor kod ZIKV infekcije. Međutim, vitalni nestrukturni protein i mehanizmi uključeni u evaziju virusa posredovanu DHCR7- nisu dobro razjašnjeni. U ovoj studiji smo pokazali da ZIKV infekcija olakšava ekspresiju DHCR7. Značajno je da je povećani DHCR7 zauzvrat olakšao ZIKV infekciju, a blokiranje DHCR7 potisnulo je ZIKV infekciju. Mehanički, ZIKV nestrukturni protein 4B (NS4B) stupio je u interakciju sa DHCR7 kako bi inducirao ekspresiju DHCR7. Štaviše, DHCR7 je inhibirao fosforilaciju TANK-vezujuće kinaze 1 (TBK1) i regulatornog faktora 3 interferona (IRF3), što je rezultiralo smanjenjem proizvodnje interferon-beta (IFN-) i interferonom stimulisanih gena (ISG). Stoga predlažemo da se ZIKV NS4B veže za DHCR7 kako bi potisnuo aktivaciju TBK1 i IRF3, što zauzvrat inhibira IFN- i ISGs, čime se olakšava izbjegavanje ZIKV-a. Ova studija proširuje uvid u to kako virusni nestrukturni proteini antagoniziraju urođeni imunitet kako bi olakšali virusnu infekciju putem metaboličkih enzima kolesterola i međuproizvoda.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

1. Uvod

Kao flavivirus koji prenose komarci, Zika virus (ZIKV) je prvobitno identificiran iz rezus makaka u Ugandi 1947. godine. Doživjela nekoliko izbijanja širom svijeta, ZIKV epidemija je postala kumulativna globalna prijetnja zdravlju zbog eksplozivne ekspanzije puteva komaraca širom svijeta asimptomatski transporteri i seksualni prijenos. Većina ZIKV infekcija u prošlim epidemijama bila je asimptomatska ili blaga (Wang et al., 2016), međutim, u posljednjih nekoliko epidemija, ZIKV infekcija je dovela do razornih bolesti, uključujući neurološke posljedice tijekom trudnoće (mikrocefalija i smrt fetusa) i neurološki poremećaj (Guillain-Barreov sindrom) kod odraslih (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson i Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Urođeni imuni sistem je prva i kritična linija imunološke odbrane domaćina protiv virusne infekcije. Nakon ZIKV infekcije, virusna RNK prepoznata je intracelularnim genom I induciranim retinojskom kiselinom (RIG-I) (Chazal et al., 2018; Hertzog et al., 2018; Kato et al., 2006), koji je pokrenuo nizvodni urođeni imunitet odgovori, uključujući aktivaciju TANK vezujuće kinaze 1 (TBK1), fosforilaciju regulatornog faktora 3 interferona (IRF3), a zatim dovode do proizvodnje interferona tipa I (IFN-I) (Fitzgerald et al., 2003; Grant et al., 2016; Xia et al., 2018) i ekspresija desetina interferonom stimuliranih gena (ISG) s različitim antivirusnim efektima (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Imuni sistem domaćina proizvodi IFN i ISG kako bi ograničio virusnu infekciju, međutim, sam ZIKV je razvio niz mehanizama za bijeg kako bi osigurao uspješno preživljavanje i replikaciju u ćeliji domaćina, kao što je kodiranje specifičnih nestrukturnih (NS) proteina. ZIKV genomska RNK stvara sedam nestrukturnih proteina, uključujući NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5 (Berthoux, 2020.). ZIKV NS1 regrutuje deubikvitinazu USP8 domaćina da stabilizuje kaspazu-1 i oslabi signalizaciju IFN tipa I u korist ZIKV infekcije (Zheng et al., 2018). Prijavljeno je da se mutant NS1 vezuje za TBK1 i smanjuje fosforilaciju TBK1, što dovodi do smanjene proizvodnje IFN (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 se vezuje za i sekvestrira proteine ​​ljudske skele (14-3-3ε i 14-3-3η) (Riedl et al., 2019), dok NS4A stupa u interakciju sa MAVS-om kako bi ublažio RIG-I- i MDA{{50} }posredovani urođeni imuni odgovori (Ma et al., 2018). Značajno je da ZIKV NS5 veže i degradira transduktor signala i aktivator transkripcije 2 (STAT2) kako bi ublažio signalizaciju tipa I IFN (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016). Štaviše, dokazano je da NS5 stupa u interakciju sa RIG-I i potiskuje K{59}}povezanu poliubikvitinaciju RIG-I, čime potiskuje proizvodnju IFN (Li et al., 2020). Osim toga, pokazalo se da ZIKV NS2A, NS2B, NS4A i NS4B nadjačavaju proizvodnju IFN ciljanjem na diskretne elemente u RIG-I putu (Xia et al., 2018). Da bi se postigla efikasna replikacija u ćelijama sisara, ZIKV se takođe oslanja na metaboličke komponente lipida domaćina kako bi formirao omotač i kompletan sklop virusnih čestica (Chen et al., 2020; Leier et al., 2020). Kolesterol je jedna od lipidnih komponenti ćelijskih membrana i učestvuje u više bioloških funkcija (Ikonen, 2008). Homeostaza ćelijskog holesterola je usko modulisana sintezom holesterola, uključujući apsorpciju iz čestica lipoproteina i otpuštanje u ekstracelularne akceptore. Gotovo sve stanice sisara ovise o metabolizmu kolesterola (Luo et al., 2020). Nagomilani dokazi ukazuju na to da metabolizam holesterola učestvuje u urođenom imunološkom odgovoru na virusnu infekciju (Blanc et al., 2013; Petersen et al., 2014; York et al., 2015). Nakon virusne infekcije, sinteza kolesterola je značajno promijenjena i praćena pojačanom ekspresijom IFN-I i ISG u makrofagima (Li et al., 2017; Liu et al., 2008; York et al., 2015). Kao ključni enzim u metabolizmu holesterola, holesterol-25-hidroksilaza (CH25H) pretvara holesterol u 25-hidroksiholesterol (25HC), koji je identifikovan kao biološki proizvod koji doprinosi urođenom imunološkom odgovoru protiv velike većine virusa, uključujući virus humane imunodeficijencije 1 (HIV-1), virus vezikularnog stomatitisa (VSV), herpes simplex virus 1 (HSV-1), virus ebole (EBOV), ZIKV, mišji gama herpes virus ( MHV68), virus groznice doline Rift (RVFV) i virus ruskog proljetno-ljetnog encefalitisa (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Trenutne studije su ograničene u istraživanju kako metabolički proizvodi holesterola (npr. 25HC) mogu manipulisati transdukcijom signala i učestvovati u urođenom imunitetu. Do danas, enzimi ili intermedijeri uzvodno od biosinteze holesterola još uvek nisu dobro razjašnjeni. Kao vitalni metabolički enzim holesterola, 7-dehidroholesterol reduktaza (DHCR7) može izbrisati C (7-8) dvostruku vezu u B prstenu sterola i katalizirati holesterol iz 7-dehidrokolesterola ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC je također preteča vitamina D, a mutacije DHCR7 su povezane s višim vitaminom D, što sugerira da DHCR7 pokazuje komplikovane biološke efekte u konverziji kolesterola i vitamina D (Kuan et al., 2013; Prabhu et al. , 2016a). Dobro predstavljena studija je pokazala da tišina DHCR7 može aktivirati put PI3K-AKT3, što dovodi do fosforilacije IRF3 Ser385 i promovira proizvodnju IFN-a za inhibiranje više virusnih infekcija in vitro i in vivo (Xiao et al., 2020). Međutim, razumijevanje metabolizma holesterola posredovanog DHCR7-u imunološkoj evaziji posredovanoj proteinima ZIKV NS je slabo definirano. Ovdje razjašnjavamo poseban mehanizam koji ZIKV NS4B cilja na DHCR7, ključni enzim u sintezi kolesterola, da bi ublažio IFN-I odgovor i olakšao ZIKV infekciju. Otkrili smo da ZIKV infekcija povećava ekspresiju DHCR7. Zanimljivo je da poboljšani DHCR7 promovira ZIKV infekciju, dok uništavanje ili ciljanje DHCR7 inhibitorima može potisnuti ZIKV infekciju. Štaviše, ZIKV NS4B bi mogao da veže DHCR7 i na taj način indukuje ekspresiju DHCR7, što je inhibiralo aktivaciju TBK1 i IRF3 i dovelo do smanjene proizvodnje IFN- i ISG. Stoga predlažemo da ZIKV NS4B vezivanje za DHCR7 smanjuje aktivaciju IRF3, što zauzvrat inhibira IFN- i ISGs kako bi se olakšalo izbjegavanje ZIKV-a. Ova studija proširuje nove uvide o tome kako ZIKV nestrukturni protein ukida urođeni imunitet kako bi olakšao virusnu infekciju kroz interakciju s metaboličkim enzimima kolesterola.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Materijali i metode

2.1. Ćelijske linije

U251 ćelije su kupljene od Kineskog centra za kolekciju tipskih kultura (CCTCC) (Wuhan, Kina). Ćelije bubrega Cercopithecus aethiops (Vero), ćelije ljudskog embrionalnog bubrega (HEK 293T) i ćelije humanog adenokarcinoma pluća (A549) kupljene su od Američke zbirke kultura tkiva (ATCC). Ćelije su održavane u Dulbecco-ovom modificiranom mediju Eagle (DMEM) (Gibco) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Gibco), penicilina (100 U/mL) i streptomicin sulfata (100 ug/mL) na 37 C i 5 % CO2. Ćelije Aedes albopictus (C6/36) su uzgajane u minimalnom esencijalnom mediju (MEM) sa dodatkom 10% FBS, penicilina (100 U/mL) i streptomicin sulfata (100 ug/mL) na 28 C sa 5% CO2.

2.2. ZIKV amplifikacija, titracija i infekcija

ZIKV izolat z16006 (GenBank pristupni broj, KU955589.1) je kultivisan u ćelijama C6/36, a ZIKV je alikvot u bočicama za zamrzavanje i čuvan na 80 C. Titri ZIKV-a su mereni testom plaka. Ćelije su inficirane ZIKV-om pri naznačenoj multipliciteti infekcije (MOI) tokom 2 h, nakon čega je slijedilo ispiranje fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera (PBS), a zatim uzgajane, sakupljene i pregledane.

2.3. Plazmidi i reagensi

Ekspresioni plazmid pcDNA3.1(þ)-3 Flag je korišten za kloniranje pojedinačnih ZIKV gena iz odgovarajućih fragmenata ZIKV cDNK. Da bi se konstruisao pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B je subkloniran u pGEX6p-1 vektor koristeći ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme Biotech, Nanjing, Kina). cDNK koji kodiraju humani DHCR7, RIG-I, TBK1 i IRF3 klonirani u pCAGGS-HA vektor ili pcDNA3.1 (þ)-3 Flag vektor konstruisan je standardnom metodom molekularnog kloniranja. Misens mutacija G410S DHCR7 konstruisana je metodom mutageneze usmjerene na mjesto. Monoklonska zečja anti-ZIKV omotnica (GTX133314) kupljena je od GeneTex-a (Irvine, Kalifornija, SAD). Zečji poliklonski anti-DHCR7 (A8049), zečji monoklonski anti-ISG15 (A2416), zečji monoklonski anti-TBK1 (A3458), zečji monoklonski anti-P-TBK1 na Ser172 (AP1026), zečji poliklonski anti-11IRF18 -zečji IgG (ac005) i anti-mišji IgG (ac011) kupljeni su od ABclonal Technology (Wuhan, Kina). Antimišja FITC i anti-zečja Cy3 sekundarna antitijela su kupljena od Abbkine-a (Wuhan, Kina). Zečji monoklonski anti-P-IRF3 na Ser396 (29047S) i zečji monoklonski anti-ISG56 (14769S) kupljeni su od Cell Signaling Technology (CST, Boston, MA, SAD). Mišji monoklonski anti-Flag (F3165), zečji monoklonski anti-HA (H6908) i mišji monoklonski anti-GAPDH (G9295) kupljeni su od Sigme (St Louis, MO, SAD). Mišja monoklonska antiFlavivirus grupa antigen-antitijela (MAB10216) kupljena je od Milliporea (Mass, SAD). Lipofectamine 2000 (11668-027) i Trizol (15596018) su kupljeni od Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA). Poly(I:C) je kupljen od InvivoGen-a (San Diego, CA, SAD).

2.4. Test plaka

Supernatant koji sadrži ZIKV razrijeđen je DMEM-om bez seruma i inficirao Vero ćelije u ploči sa 12-jažicom 2 h, nakon čega je dva puta ispran sa 1 mL PBS. DMEM koji sadrži 2% FBS i 2% agaroze niske tačke topljenja je dobro izmiješan u volumnom omjeru 1:1, a u svaku jažicu je dodato 1 mL smjese. Inficirane ćelije su uzgajane na 37 C sa 5% CO2 tokom 5-7 dana. Ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida tokom 1 h i obojene sa 0.5% kristalno ljubičastom tokom 30 minuta. 12-Ploča za bunar je isprana vodom i izračunati su plakovi.

2.5. Proizvodnja i infekcija lentivirusa

Ciljane sekvence shRNA za ljudski DHCR7 bile su sljedeće: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Vektor pLKO.1 koji nosi kodiranu shRNA za negativnu kontrolu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) ili specifičnu ciljnu sekvencu transficiran je u HEK293T ćelije zajedno sa psPAX2 i pMD2.G sa lipofektaminom 2{{19} }00. Virusne čestice koje sadrže supernatante su sakupljene 36 h nakon transfekcije i zatim centrifugirane na 210 g 10 minuta. Supernatantna faza bez ćelija je filtrirana kroz filter od 0,45 μm da bi se uklonili ćelijski ostaci. U251 ćelije su inficirane lentivirusnim česticama u prisustvu 8 ug/mL polibrena. Nakon 48 h kulture, ćelije U251 su odabrane sa puromicinom (2 ug/mL, Sigma). Efikasnost uništavanja sh-DHCR7 određena je RT-PCR i Western blot analizom.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

2.6. Western blot

Ćelije su lizirane RIPA puferom dopunjenim inhibitorima proteaze i inhibitorima fosfataze na ledu 1 h, zatim centrifugirane na 4 C, 13,000 g 1{{10}} min da bi se sakupila stanica lizat. Koncentracija proteina u ćelijskom lizatu mjerena je testom proteina bicinhoninske kiseline (BCA). Protein je odvojen pomoću SDS-PAGE i zatim prebačen na polivinil difluoridnu (PVDF) membranu. PVDF membrana je blokirana puferom za blokiranje imunoblotinga TBST (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 0,15 mol/L NaCl i 0,05% Tween-20) koji sadrži 5% BSA tokom 1 h. Nakon ispiranja sa TBST, membrana je inkubirana sa primarnim antitelima i drugim antitelima i naknadno detektovana korišćenjem hemiluminiscentnog sistema za snimanje (Bio-Rad).

2.7. Analiza ukupnog holesterola

Ukupni holesterol u ćelijama je detektovan korišćenjem kompleta za analizu ukupnog holesterola u tkivima kompanije Applygen Technologies Inc. (Peking, Kina). Standard holesterola od 5 mmol/L podvrgnut je serijskom razblaženju sa bezvodnim etanolom da bi se nacrtala standardna kriva, a količine ukupnog ćelijskog holesterola su izračunate prema standardnim krivuljama. Eksperiment je sproveden prema proceduri koju je dao proizvođač.

2.8. Ko-imunoprecipitacijski testovi

HEK293T ćelije su transfektovane sa naznačenim plazmidima. Ćelije su sakupljene i lizirane RIPA puferom za lizu sa dodatkom inhibitora proteaze. Nakon centrifugiranja na 18,000 g 15 min na 4°C, ćelijski lizati su sakupljeni i imunoprecipitirani pomoću Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Milwaukee, WI, SAD) 4 h na 4°C. Vezani proteini su eluirani sa 2 pufera za punjenje i analizirani imunoblotiranjem.

2.9. PCR u realnom vremenu

Ukupne RNK su ekstrahovane iz ćelija korišćenjem TRIzol reagensa (Invitrogen Life Technologies), a cDNK je proizvedena sa kompletom M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, SAD). RT-PCR je izveden pomoću SYBR RT-PCR kompleta (DBI Bio-science) na Roche LC480. mRNA gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) je postavljena kao endogena referenca za normalizaciju mRNA, a nivoi ekspresije gena su izračunati korištenjem 2 ΔΔCT metode. Sekvence RT-PCR prajmera prikazane su u dodatnoj tabeli S1. 2.10. Konfokalna mikroskopija

U251 ćelije su transfektovane plazmidom i kultivisane 30 h, a zatim tri puta isprane sa PBS. Ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida tokom 15 minuta i prožete PBS-om koji sadrži 0,1% TritonX-100 tokom 5 minuta. Nakon ispiranja sa PBS-om, ćelije su zatvorene sa PBS-om koji sadrži 5% BSA u trajanju od 30 minuta. Ćelije su isprane tri puta sa PBS-om i inkubirane sa anti-HA, anti-FLAG i anti-flavivirusom, zatim inkubirane sa anti-mišjim FITC i anti-zečjim Cy3 sekundarnim antitelima. Ćelije su obojene sa 40,6-Diamidino-2-fenilindol dihidrokloridom (DAPI) i izvedene pomoću Olympus konfokalnog mikroskopa.

2.11. GST pull-down testovi

Plazmid pGEX6p-1-NS4B je transficiran u Escherichia coli (E. coli) soj BL21. GST i GST-NS4B su inducirani IPTG sa konačnom koncentracijom od 0.5 mmol/L, a kulture su uzgajane dodatnih 6-8 sati na 37 C. A zatim GST protein i GST- NS4B protein je pročišćen od bakterije E. coli. GST ili GST-NS4B protein je inkubiran sa zrncima glutation Sepharose (Novagen) i ispran tri puta sa PBS. GST i GST-NS4B protein su inkubirani sa eukariotskim fuzionim proteinom HA-DHCR7, koji potiče od plazmida koji kodiraju HA-DHCR7-ekspresirane ćelijske lizate HEK293T tokom 4 h na 4 C. Precipitati su isprani pet puta, prokuvani u 2 SDS pufer za punjenje i detektovan Western blot sa anti-GST i anti-HA antitelima.

2.12. HA-DHCR7 mutageneza usmjerena na mjesto

Odgovarajući parovi mutagenih prajmera (dodatna tabela S1) su sintetizirani i korišteni za generiranje mutiranog konstrukta pomoću PCR-a. HA-DHCR7 je korišten kao šablon za PrimeSTAR® HS Premix (Takara). Nakon PCR-a, plazmid divljeg tipa koji je ostao u PCR proizvodu selektivno je digestirao DpnI (New England Biolabs). Digestivni PCR proizvod je transficiran u E. coli soj DH5. Željeni mutant je potvrđen analizom Sangerove sekvence.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

2.13. Statistička analiza

Svi eksperimenti su ponovljeni najmanje tri puta sa sličnim rezultatima. Podaci su izraženi kao srednja standardna devijacija (SD). Značaj varijabilnosti određen je Studentovim dvostranim nesparenim t-testom za dvogrupnu ili jednosmjernu ANOVA-u s Dunnettovim testom višestrukih poređenja ili dvosmjernom ANOVA-om sa Sidakovim testom višestrukih poređenja za višestruka poređenja koristeći softver GraphPad Prism (verzija 8.0.1). Vrijednost P < 0.{{10}}5 se smatra statistički značajnom, a P > 0.05 je identificirana kao statistički neznatna. Za sve podatke, značajnost je prikazana kao *P < 0,05, **P < 0,01 i ***P < 0,001.

3. Rezultati

3.1. ZIKV infekcija izaziva ekspresiju DHCR7

Akumulirani dokazi su pokazali da metabolizam holesterola utiče na urođeni imuni odgovor domaćina na infekciju flavivirusom, kao što su ZIKV i virus Denga (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 kodira enzim koji transformiše 7-DHC u holesterol, poslednji korak u biosintezi holesterola (Moebius et al., 1998). Prvo smo otkrili ekspresiju DHCR7 nakon ZIKV infekcije. Ljudski astrocit U251 bio je inficiran ZIKV-om, koji je ovisno o dozi povećao ekspresiju DHCR7 i na mRNA i na proteinu (Slika 1A-C). Da bismo potvrdili ovaj fenomen, zatim smo ispitali ekspresiju DHCR7 u Vero ćelijama i otkrili da ZIKV infekcija značajno inducira ekspresiju DHCR7 (Slika 1D-F), što je bilo u skladu sa rezultatima u U251 ćelijama.

cistanche koristi - jača imuni sistem

3.2. Ciljanje DHCR7 izaziva kritičnu anti-ZIKV aktivnost

Da bi se procijenili efekti DHCR7 protiv ZIKV infekcije, ćelije U251 i A549 su transficirane sa plazmidom koji kodira HA-DHCR7, a zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1). Rezultati su pokazali da prekomjerna ekspresija DHCR7 značajno povećava ekspresiju ZIKV mRNA (slike 2A i B). Značajno, sa akumulacijom proteina DHCR7, ekspresija ZIKV strukturnog proteina E je takođe povećana (sl. 2C i D). Dodatno, dalje smo sproveli analizu plaka koristeći supernatant sa slike 2C i otkrili da je prekomjerna ekspresija DHCR7 značajno porasla jedinicama koje formiraju plak, u poređenju sa kontrolnom grupom (slike 2E i F). Prijavljeno je da missense mutacija G410S DHCR7 ukida aktivnost enzima (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). Da bismo dalje odredili efekte DHCR7 na ZIKV infekciju, zatim smo konstruirali neaktivni mutant DHCR7 (G410S). U poređenju sa divljim tipom DHCR7, mutant G410S bi mogao značajno inhibirati ZIKV infekciju (slika 2G). Također smo izvršili konfokalni mikroskopski test kako bismo potvrdili zapažanje. Kao što je prikazano na slici 2H, prekomjerna ekspresija DHCR7 je povećala infekciju ZIKV-om. Da bismo utvrdili da li je aktivnost endogenog DHCR7 enzima kritična za infekciju ZIKV-om, dizajnirali smo dvije kratke RNA ukosnice (shDHCR7-1 i sh-DHCR7-2) koje specifično ciljaju DHCR7 i generirale DHCR7-utišanu U251 ćeliju linije sa shRNA sistemom (slika 3A). Konačno, odabrali smo sh-DHCR7-1 zbog njegove veće efikasnosti utišavanja. U poređenju sa kontrolnom shRNA transdukovanom ćelijskom linijom, ove DHCR7 knockdown ćelije pokazale su nižu osetljivost na ZIKV infekciju (sl. 3B i C). Zatim smo koristili selektivni inhibitor DHCR7 AY9944 koji sprečava 7-DHC pretvorbu u holesterol (Xu et al., 2011), za koji je pokazano da inhibira DHCR7 enzimsku aktivnost (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). U poređenju sa kontrolom, primena AY9944 dozno-ovisno je inhibirala ZIKV infekciju u U251 ćelijama (slika 3D-F). Test plaka je takođe izveden u Vero ćelijama kako bi se dalje procijenili efekti DHCR7 i pokazao da AY9944 može značajno suzbiti ZIKV infekciju (sl. 3G i H). Konfokalna mikroskopija je pokazala da je protein ZIKV E značajno smanjen u prisustvu AY9944 (slika 3I). Ovi nalazi su pokazali da ciljanje DHCR7 može inhibirati ZIKV infekciju.

Slika 1. ZIKV infekcija izaziva ekspresiju DHCR7. A–F U251 i Vero ćelije su inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 0, 1 i 2) tokom 24 h, a intracelularni nivoi RNK ZIKV (A, D) i DHCR7 (B, E) su određeni pomoću RT-PCR sa GAPDH kao internom kontrolom. Relativni nivoi proteina DHCR7 i ZIKV omotača detektovani su Western blotom (C, F). Podaci su iz najmanje tri nezavisna eksperimenta (srednja SD) ili reprezentativnih podataka (C, F). Statistička značajnost je izračunata korištenjem jednosmjerne ANOVA sa Dunettovim testom višestrukih poređenja (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, standardna devijacija.

3.3. DHCR7 inhibira aktivaciju TBK1 i IRF3 kako bi smanjio proizvodnju IFN-a i ISG-a

Pošto je DHCR7 vitalni enzim za pretvaranje 7-DHC u holesterol (Moebius et al., 1998) i ZIKV infekcija može povećati ekspresiju DHCR7, tako smo izmjerili nivo holesterola nakon ZIKV infekcije. Otkrili smo da ZIKV infekcija ima mali uticaj na sintezu holesterola u U251 i Vero ćelijama (sl. 4A i B), iako je DHCR7 povećan (sl. 1A-D). S obzirom na pojačani DHCR7 nakon ZIKV infekcije i ključnu ulogu IFN-a u suočavanju sa ZIKV infekcijom, zatim smo utvrdili učinak DHCR7 na signalni put IFN-I. Kontrolne i DHCR7-utišajuće U251 ćelije su inficirane ZIKV-om ili transficirane poli(I:C), a istražena je ekspresija IFN-a. U poređenju sa kontrolnom grupom, ZIKV infekcija ili tretman poli(I:C) je značajno povećao ekspresiju IFN-a u DHCR7-utišavajućim U251 ćelijama (sl. 4C i D). ISG su efektori djelovanja interferona i igraju glavnu ulogu u urođenoj imunološkoj odbrani od ZIKV infekcije. Takođe smo pokazali da blokiranje DHCR7 može značajno pojačati ekspresiju ISG15 i ISG56 na nivou mRNA i proteina (Slika 4E–J). Konzistentno, tretman AY9944 inhibitorom DHCR7 mogao bi izazvati ekspresiju IFN-, ISG15 i ISG56 (slika 4K, L). Važno je da neaktivni mutant G410S može djelimično da preokrene inhibitorne efekte DHCR7 na ekspresiju IFN- i ISG (Slika 4M, N). Aktivacija TBK1 i IRF3 je od suštinskog značaja za indukciju IFNs-ISGs, stoga smo zatim ispitali efekat DHCR7 na ekspresiju i aktivaciju TBK1 i IRF3. Pokazali smo da DHCR7 ne samo da je zavisno od doze inhibirao nivo proteina, već je takođe potisnuo nivo fosforilacije TBK1 i IRF3 (Slika 5A-C). Štaviše, neaktivni mutant G410S je nepotpuno preokrenuo inhibitorne efekte DHCR7 na fosforilaciju IRF3 i TBK1 (slika 5D). U suprotnosti sa nalazima prekomerne ekspresije DHCR7, tretman AY9944 mogao bi da izazove aktivaciju IRF3 i TBK1 u U251 ćeliji (slika 5E).

3.4. ZIKV NS4B stupa u interakciju s DHCR7 kako bi inhibirao fosforilaciju TBK1 i IRF3

Sve veći dokazi su otkrili da je ZIKV evoluirao specifične NS proteine ​​kako bi olakšao efikasnu replikaciju u ćelijama domaćina direktnim izbjegavanjem urođenog i adaptivnog imuniteta domaćina putem mnoštva diskretnih mehanizama. Izvršili smo co-IP test za skrining za pojedinačni ZIKV NS protein koji bi mogao stupiti u interakciju sa DHCR7. HEK293T ćelije su ko-transficirane sa pCMV-DHCR7-HA i plazmidom koji ekspresira pojedinačni NS protein spojen sa Flag-tagom. Kao što je prikazano na slici 6A, DHCR7 se vezuje samo za NS4B, ali ne uspeva da stupi u interakciju sa drugim NS proteinima. Dalje su sprovedeni recipročni ko-IP testovi i pokazali su da NS4B protein interaguje sa DHCR7 u ćelijama HEK293T (sl. 6B i C). Da bismo potvrdili interakciju NS4B i DHCR7, zatim smo izveli konfokalni mikroskop i otkrili da su NS4B protein i DHCR7 protein kolokalizirani u citoplazmi (slika 6D). GST pull-down test dalje je pokazao interakciju NS4B i DHCR7 (slika 6E). Štaviše, prolazna transfekcija NS4B u U251 ćelijama mogla bi dramatično da izazove ekspresiju DHCR7 (slika 6F). Važno je da NS4B može ovisno o dozi blokirati fosforilaciju i TBK1 i IRF3, što je u pozitivnoj korelaciji sa pojačanom aktivacijom TBK1 i IRF3 kao odgovor na DHCR7 (Slika 6G i H). Međutim, prekomerna ekspresija NS4B u ćelijama HEK293T značajno je smanjila nivo proteina TBK1, ali je imala mali uticaj na IRF3 protein (sl. 6G i H). Da bi se dodatno potvrdila ova zapažanja, NS4B je transficiran u DHCR7 oborene U251 ćelije i pokazao je inhibitorne efekte na endogeni protein i nivoe fosforilacije TBK1 i IRF3 (slika 6I). Uzeti zajedno, ovi rezultati su pokazali da je ZIKV NS4B stupio u interakciju sa DHCR7 i poboljšao ekspresiju DHCR7 kako bi blokirao aktivaciju TBK1 i IRF3, a zatim olakšao ZIKV infekciju.

Slika 2. Prekomjerna ekspresija DHCR7 promoviše replikaciju ZIKV. A-D U251 i A549 ćelije su transfektovane sa HA-vektorom ili HA-DHCR7 u naznačenim koncentracijama tokom 12 h, a zatim inficirane sa ZIKV-om narednih 36 h. Nivoi ZIKV RNK detektovani su RT-PCR sa GAPDH kao internom kontrolom (A, B), a nivoi proteina ZIKV omotača, HA-DHCR7 i GAPDH detektovani su Western blotom (C, D). E, F Vero ćelije su inficirane supernatantom koji sadrži ZIKV sa slike 2C tokom 48 h da bi se odredile kopije ZIKV-a analizom plaka. G U251 ćelije su transficirane sa HA-vektorom, HA-DHCR7 ili HA-DHCR7 (G410S) tokom 12 sati i inficirane sa ZIKV tokom 36 sati, a nivoi proteina u ovojnici ZIKV, HA-DHCR7 i GAPDH je detektovan Western blot-om. H U251 ćelije su transficirane HA-vektorom ili HA-DHCR7 (1 ug) 12 h, inficirane ZIKV-om 36 h, a zatim inkubirane s mišjim anti-flavivirusom i zečjim anti-HA antitelima, nakon bojenja sa FITC-konjugiranim antimišjem i Cy{36}}konjugirana anti-zečja sekundarna antitijela. Jezgra su obojena DAPI. Slike su vizualizirane konfokalnom mikroskopijom. Skalirana traka ¼ 100 μm. Podaci su iz najmanje tri nezavisna eksperimenta (srednja SD) ili reprezentativni podaci (C, D, E, G, H). Statistička značajnost je izračunata korišćenjem Studentovog dvosmernog neuparenog t-testa (F) ili jednosmerne ANOVA sa Dunettovim testom višestrukih poređenja (A, B). *P < 0,05, ***P < 0,001. SD, standardna devijacija.

4. Diskusija

IFN tipa I i njihovi nizvodni ISG se suočavaju s velikim nizom patogena i igraju ključnu ulogu u imunološkoj odbrani domaćina protiv ZIKV-a (Lazear et al., 2016). Kako bi izbjegao nadzor posredovan IFN-om i postigao dovoljnu replikaciju, ZIKV razvija NS proteine ​​koji ciljaju različite tačke signalnog puta IFN-a kako bi pobjegli od ćelijskog urođenog imunološkog sistema (Lee et al., 2021). Studije su ilustrovale da ZIKV NS1, NS3, NS4A i NS5 inhibiraju različite module RIG-I/IFN-I puta i olakšavaju virusnu infekciju koristeći nezavisne i različite mehanizme (Grant et al., 2016; Kumar et al., 2016. ; Ma i sur., 2018; Riedl i sur., 2019; Xia i sur., 2018; Zheng et al., 2018). Međutim, specifični mehanizam ZIKV NS4B koji djeluje protiv imunološke restrikcije je slabo definiran. ZIKV NS4B je izuzetno hidrofobni protein koji se sastoji od 251 aminokiseline i nalazi se u membrani endoplazmatskog retikuluma sa N-terminalom (Zou et al., 2014). NS4B inhibicija signalnog puta IFN-I identificirana je u različitim flavivirusima (Ding et al., 2013.; Munoz-Jordan et al., 2003., 2005.; Shan et al., 2021.; Yi et al., 2016.; Zhang et al. al., 2021). Nedavna studija je objavila da soj ZIKV INMI1 izolovan u Brazilu koristi NS4B da antagonizuje nizvodno od signalnog puta IFN-I tako što uništava fosforilaciju STAT1 i posljedično prekida STAT1 nuklearni transport (Fanunza et al., 2021.). U ovoj studiji smo pronašli poseban mehanizam u kojem ZIKV NS4B ukida proizvodnju IFN-a potiskivanjem fosforilacije TBK1 i IRF3, uzvodne komponente signalnog puta IFN-I. Značajno je da je supstitucija aminokiselina (G18R) otkrivena u ZIKV NS4B, što je doprinijelo smanjenoj proizvodnji IFN-a i oslabljenoj ekspresiji ISG, a time i olakšalo virusnu infekciju kod miševa, što ukazuje na značaj NS4B kao determinante patogeneze (Gorman et al. ., 2018.). Novi dokazi ukazuju na kritičnu važnost metabolizma holesterola koji učestvuje u urođenom imunološkom odgovoru (Akula et al., 2016; Dang et al., 2017; Reboldi et al., 2014; York et al., 2015). Iako je dokumentovano da nekoliko međuprodukata u metabolizmu holesterola imaju široke antivirusne efekte (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013; Xiao et al., 2020), naša studija je ilustrovala novi mehanizam da je metabolički enzim kolesterola DHCR7 bio uključen u ZIKV infekciju tako što je smanjio aktivaciju TBK1 i IRF3 kako bi se olakšala virusna infekcija. Kao ključni enzim uključen u metabolizam desmosterola i kolesterola, DHCR7 predstavlja prekidač pretvaranja 7-DHC u vitamin D u ćelijama kože izloženim UVB (Prabhu et al., 2016b). Štaviše, DHCR7 je pozicioniran ne samo na kapiji Blochovog puta već i na kraju Kandutsch-Russell puta (Prabhu et al., 2016a, 2016b), koji igra vitalnu ulogu u kontroli sinteze holesterola. Preslušavanje DHCR7 i njegova interakcija s drugim enzimima na nekoliko puteva mogu osnažiti višestruke funkcije u različitim tipovima stanica ili organima. Prethodna studija je otkrila da blokiranje DHCR7 može smanjiti desmosterol, neposredni prethodnik biosinteze holesterola, nudeći na taj način dovoljnu zaštitu od HCV infekcije (Luu et al., 2015; Rodgers et al., 2012). Važno je da Xiao et al. su pokazali da VSV infekcija smanjuje ekspresiju DHCR7, što dovodi do smanjenja holesterola, ali mnogo više 7-akumulacije DHC-a u makrofagima i jetri (Xiao et al., 2020). Makrofagi tretirani 7-DHC-om dali su pojačan antivirusni odgovor; dok je dodatak holesterola pokazao manju zaštitu. Inhibitori DHCR7 i primjena 7-DHC-a mogu biti korisni pristupi u borbi protiv virusnih infekcija kao što su HIN1, HSV i VSV. U ovoj studiji smo otkrili da inhibitor DHCR7 AY9944 može suzbiti ZIKV infekciju. Međutim, naša studija je otkrila da ZIKV infekcija izaziva ekspresiju DHCR7, ali ima mali učinak na biosintezu kolesterola u glijalnim stanicama. Nismo ispitivali nivo ekspresije 7-DHC nakon ZIKV infekcije, ali je vrijedno dalje istražiti da li 7-DHC i AY9944 imaju sinergijski terapeutsku efikasnost u liječenju pacijenata koji su inficirani ZIKV-om infekcija u mozgu. Prekomjerna ekspresija DHCR7 je promovirala ZIKV infekciju, dok je liječenje selektivnim inhibitorom DHCR7 (AY9944) snažno povećalo proizvodnju IFN-a protiv ZIKV infekcije. Aktivacija TBK1 i IRF3 je vitalna za primanje signala IFN-I. Prethodno istraživanje je pokazalo da je utišavanje DHCR7 ili 7-DHC tretman aktivirao put PI3K-AKT3 za fosforilaciju IRF3, ali ne i TBK1 u makrofagima (Xiao et al., 2020). Ipak, naši nalazi su pokazali da DHCR7 ovisno o dozi smanjuje ekspresiju IRF3 i TBK1, kao i fosforilaciju IRF3 i TBK1. Ova istraživanja su pokazala da DHCR7 može doprinijeti ZIKV infekciji u mehanizmu u mozgu neovisnom o metabolizmu kolesterola. Dobro je razjašnjeno da je ZIKV koristio NS proteine ​​za direktnu interakciju s različitim komponentama RIG-I/IFN-I puta kako bi izbjegao imunološki odgovor i olakšao replikaciju virusa. Ranije smo izvijestili o interakciji ZIKV NS5 sa RIG-I kako bi se smanjila proizvodnja IFN (Li et al., 2020). Drugi su pokazali da su ZIKV NS1 i NS2B ciljali na TBK1, NS3 ciljali na RIG-I i MDA5 kako bi smanjili proizvodnju IFN-I i ISG (Lee et al., 2021; Riedl et al., 2019). Međutim, funkcija ZIKV NS proteina koji cilja na metabolizam holesterola ostaje uglavnom neuhvatljiva. U ovoj studiji, takođe smo ilustrovali neprijavljenu interakciju između metaboličkog enzima holesterola DHCR7 i ZIKV NS proteina. Pokazali smo da je DHCR7 specifično vezan za NS4B, a ne za druge NS proteine. Dali smo kritične dokaze da je ZIKV NS4B stupio u interakciju sa DHCR7 i značajno inducirao njegovu ekspresiju, što je bilo u skladu s rezultatima u U251 ćelijama nakon ZIKV infekcije. Važno je da osim što direktno demonstriramo angažman DHCR7 i ZIKV NS4B, također smo otkrili da je ZIKV NS4B povećao ekspresiju DHCR7 kako bi inhibirao fosforilaciju TBK1 i IRF3 i olakšao infekciju ZIKV-om. U skladu s našim rezultatima, nedavna studija je otkrila da nedostatak DHCR7 može aktivirati IRF3 i IFN-signalizaciju da inhibira VSV i druge viruse u makrofagima.

Slika 3. Nokdaun DHCR7 smanjuje ZIKV infekciju u U251 ćelijama. U251 ćelije su transducirane lentivirusnim česticama koje sadrže shRNA protiv DHCR7 (shDHCR7-1 i sh-DHCR7-2) ili neciljne sekvence (sh-NTC), nakon čega je slijedila selekcija puromicina tokom 14 dana. Efikasnost obaranja je određena RT-PCR. B, C DHCR7-utišavajući U251 (sh-DHCR7) i sh-NTC U251 ćelije su lažno inficirane ili ZIKV inficirane (MOI ¼ 1) tokom 36 h. Intracelularni nivo ZIKV RNK detektovan je pomoću RT-PCR sa GAPDH kao internom kontrolom (B), a nivoi proteina u ovojnici ZIKV, DHCR7 i GAPDH su detektovani Western blotom (C). D, E U251 ćelije su tretirane DHCR7 inhibitorom AY9944 u naznačenoj koncentraciji 2 h, a zatim infekcijom ZIKV-om (MOI ¼ 1) 48 h. Ćelije su podvrgnute RT-PCR da bi se otkrila ZIKV RNA (D). Nivoi proteina u ovojnici ZIKV, DHCR7 i GAPDH detektovani su Western blotom (E). F U251 ćelije su tretirane DHCR7 inhibitorom AY9944 u naznačenoj koncentraciji tokom 36 h, a DHCR7 i GAPDH su detektovani Western blotom. G, H Vero ćelije su inficirane supernatantom koji sadrži ZIKV sa slike 3E tokom 48 sati da bi se odredile kopije ZIKV testom plaka. I U251 ćelije su tretirane sa AY9944 u naznačenoj koncentraciji tokom 2 h, a zatim infekcijom sa ZIKV-om na MOI ¼ 1 tokom 36 h. Slike su vizualizirane konfokalnom mikroskopijom. Skalirana traka ¼ 100 μm. Podaci su iz najmanje tri nezavisna eksperimenta (srednja SD) ili reprezentativni podaci (C, E, F, G i I). Statistička značajnost se izračunava korištenjem jednosmjerne ANOVA sa Dunnettovim testom višestrukih poređenja (A, D, H) ili dvosmjernom ANOVA sa Sidakovim testom višestrukih poređenja (B). ***P < 0,001. SD, standardna devijacija.

Slika 4. DHCR7 inhibira proizvodnju IFN-a i ISG-a. A, B U251 i Vero ćelije su inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 i 1) tokom 24 h, a ćelijski holesterol je mjeren kompletom za analizu ukupnog holesterola u tkivu. C–H DHCR7-utišavajući U251 (sh-DHCR7) i sh-NTC U251 ćelije su inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) ili tretirane sa Poly(I: C) (1 ug/mL) tokom 6 h. Ukupna ćelijska RNK je ekstrahovana i podvrgnuta RT-PCR za ekspresiju mRNA sa GAPDH kao internom kontrolom. Relativna ekspresija IFN- i ISG-a je normalizovana u odnosu na one sh-NTC uzoraka u lažnoj grupi, a promene nabora su prikazane kao nenormalne. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) i ISG56 (G, H). I, J DHCR7-utišavajući U251 (sh-DHCR7) i sh-NTC U251 ćelije su inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) ili transficirane sa Poly(I: C) (1 ug/mL) tokom 24 h, a nivoi proteina ISG15, ISG56 i GAPDH su detektovani Western blot-om. Ćelije K U251 su tretirane naznačenom dozom AY9944 tokom 2 h, a zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) tokom 6 h. Nivo IFN-RNA detektovan je RT-PCR sa GAPDH kao internom kontrolom. L U251 ćelije su tretirane naznačenom dozom AY9944 tokom 2 sata, a zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) tokom 24 sata. Nivoi proteina ISG15, ISG56 i GAPDH detektovani su Western blotom. M U251 ćelije su transficirane sa HA-vektorom, HA-DHCR7 ili HA-DHCR7 (G410S) tokom 24 sata i inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) tokom 6 sati. Nivoi IFN-RNA su detektovani RT-PCR sa GAPDH kao internom kontrolom. N U251 ćelije su transficirane sa HA-vektorom, HA-DHCR7 ili HA-DHCR7 (G410S) tokom 24 sata, a zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) tokom 24 sata. Nivoi proteina ISG15, ISG56 i GAPDH detektovani su Western blotom. Podaci su iz najmanje tri nezavisna eksperimenta (srednja SD) ili reprezentativni podaci (I, J, L, N). Statistička značajnost se izračunava korišćenjem jednosmerne ANOVA sa Dunnettovim testom višestrukih poređenja (A, B, K, M) ili dvosmernom ANOVA sa Sidakovim testom višestrukih poređenja (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, standardna devijacija.

Slika 5. DHCR7 inhibira aktivaciju TBK1 i IRF3. A, B HEK293T ćelije su kotransficirane sa TBK1-kodirajućim plazmidom zajedno sa DHCR7-ekspresirajućim plazmidom ili praznim vektorom (A). HEK293T ćelije su kotransficirane sa IRF3-kodirajućim plazmidom, plazmidom koji kodira RIG-I, zajedno sa DHCR7-eksprimirajućim plazmidom ili praznim vektorom (B). Ćelije su sakupljene 24 h nakon transfekcije i podvrgnute Western blotu sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396), anti-HA i anti-GAPDH ]. C U251 ćelije su transficirane naznačenom dozom plazmida koji eksprimira DHCR7 ili praznim vektorom tokom 24 h. Ćelije su zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) sakupljenim 6 h nakon infekcije i podvrgnute Western blotu sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3( S396), anti-HA i anti-GAPDH]. D U251 ćelije su transfektovane HA-vektorom, HA-DHCR7 ili HA-DHCR7 (G410S) tokom 24 h. Ćelije su zatim inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) sakupljenim 6 h nakon infekcije i podvrgnute Western blotu sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-PIRF3(S396) , anti-HA i anti-GAPDH]. E U251 ćelije su tretirane naznačenom dozom AY9944 tokom 2 h i inficirane sa ZIKV (MOI ¼ 1) tokom 6 h, zatim podvrgnute Western blotu sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti -IRF3, anti-P-IRF3(S396) i anti-GAPDH]. Podaci su iz najmanje tri nezavisna eksperimenta i prikazani su kao reprezentativni podaci (A-E).

Slika 6. ZIKV NS4B stupa u interakciju sa DHCR7 kako bi inhibirao fosforilaciju TBK1 i IRF3. Ćelije HEK293T ko-transficirane su plazmidima koji kodiraju HA-DHCR7 i plazmidima koji kodiraju ZIKV nestrukturne proteine ​​(FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B i FLAG-NS5) ili praznim kontrolnim plazmidom za 3 0 h. Ćelijski lizati su imunoprecipitirani anti-Flag antitelima, a zatim analizirani imunoblotiranjem sa naznačenim antitelima. B, C HEK293T ćelije su kotransficirane plazmidima koji kodiraju HA-DHCR7, plazmidima koji kodiraju FLAG-NS4B ili praznim kontrolnim plazmidom tokom 30 sati. Ćelijski lizati su imunoprecipitirani sa anti-HA antitelom (B) ili anti-FLAG antitelom (C), a zatim analizirani imunoblotingom sa naznačenim antitelima. D U251 ćelije su transficirane sa FLAG-NS4B plazmidom zajedno sa plazmidima koji kodiraju sa HA-DHCR7. Lokalizacija FLAG-NS4B (zeleno), HA-DHCR7 (crvena), nukleus marker DAPI (plava) i spajanje analizirani su konfokalnom mikroskopijom. Skala bar ¼ 10 μm. E Ćelijski lizati iz ćelija HEK293T transficiranih sa HA-DHCR7 inkubirani su sa GST proteinom ili GST-NS4B proteinom koji je inkubiran sa kuglicama glutation-sepharose. Smjese su otkrivene Western blot-om s anti-HA i anti-GST antitijelima (gore). Lizati iz transficiranih ćelija HEK293T i pročišćeni proteini detektovani su Western blotom sa anti-HA i anti-GST antitelima (dole). F U251 ćelije su transficirane plazmidom koji kodira FLAG-NS4B (0, 1, 2 ug). Relativni nivoi proteina DHCR7, FLAG-NS4B i GAPDH detektovani su Western blotom. G, H HEK293T ćelije su kotransficirane sa NS4B-ekspresirajućim plazmidom ili praznim vektorom, zajedno sa TBK1-kodirajućim plazmidom (F), IRF3-ekspresirajućim plazmidom i plazmidima koji kodiraju RIG-I (G) . Ćelije su sakupljene 24 h nakon transfekcije i podvrgnute Western blot-u sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG i antiGAPDH ]. I DHCR7-utišavajući U251 (sh-DHCR7) i sh-NTC U251 ćelije su transficirane sa NS4B-ekspresirajućim plazmidom ili praznim vektorom. Ćelije su sakupljene 6 h nakon transfekcije i podvrgnute Western blot-u sa naznačenim antitelima [anti-TBK1, anti-P-TBK1(S172), anti-IRF3, anti-P-IRF3(S396), anti-FLAG i antiGAPDH ]. Podaci su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta.

5. Zaključci

Ukratko, prethodna studija je otkrila da je enzim metabolizma holesterola DHCR7 uključen u urođeni imuni odgovor na različite virusne infekcije. Naša studija je pokazala da je ZIKV NS4B stupio u interakciju sa DHCR7 i inducirao ekspresiju DHCR7. Povećani DHCR7 u velikoj mjeri inhibira aktivaciju TBK1 i IRF3 i rezultira smanjenom proizvodnjom IFN- i ISG, što na taj način olakšava ZIKV infekciju u glijalnim stanicama. Ovi nalazi su otkrili novi virusni imuni mehanizam bijega prema kojem ZIKV nadvladava imuni odgovor direktnim ciljanjem DHCR7 sa NS4B.

Reference

Akula, MK, Shi, M., Jiang, Z., Foster, CE, Miao, D., Li, AS, Zhang, X., Gavin, RM, Forde, SD, Germain, G., Carpenter, S., Rosadini, CV, Gritsman, K., Chae, JJ, Hampton, R., Silverman, N., Gravallese, EM, Kagan, JC, Fitzgerald, KA, Kastner, DL, Golenbock, DT, Bergo, MO, Wang, D ., 2016. Kontrola urođenog imunološkog odgovora mevalonatnim putem. Nat. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Restrikcija flavivirusa. Virol. Sin. 35, 363–377.

Blanc, M., Hsieh, WY, Robertson, KA, Kropp, KA, Forster, T., Shui, G., Lacaze, P., Watterson, S., Griffiths, SJ, Spann, NJ, Meljon, A., Talbot, S., Krishnan, K., Covey, DF, Wenk, MR, Craigon, M., Ruzsics, Z., Haas, J., Angulo, A., Griffiths, WJ, Glass, CK, Wang, Y. , Ghazal, P., 2013. Transkripcijski faktor STAT-1 povezuje sintezu makrofaga 25-hidroksiholesterola sa interferonskim antivirusnim odgovorom. Imunitet 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Larre, P., Vial, A.-L., Decam, C., Choumet, V., Halstead, SK, Willison, HJ, Musset, L., Manuguerra, J.-C., Despres, P., Fournier , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Izbijanje Guillain-Barreovog sindroma povezano sa infekcijom virusom Zika u Francuskoj Polineziji: slučaj -kontrolna studija. Lancet 387, 1531–1539.

Chazal, M., Beauclair, G., Gracias, S., Najburg, V., Simon-Loriere, E., Tangy, F., Komarova, AV, Jouvenet, N., 2018. RIG-I prepoznaje 5' region genoma denga i Zika virusa. Cell Rep. 24, 320–328.

Chen, Q., Gouilly, J., Ferrat, YJ, Espino, A., Glaziou, Q., Cartron, G., El Costa, H., AlDaccak, R., Jabrane-Ferrat, N., 2020. Metabolic reprogramiranje virusom Zika izaziva upalu u ljudskoj posteljici. Nat. Commun. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Oxysterol ograničavanje sinteze holesterola sprečava aktivaciju AIM2 inflamasoma. Ćelija 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Virus hepatitisa C NS4B blokira interakciju STING i TBK1 da izbjegne urođeni imunitet domaćina. J. Hepatol. 59, 52–58.

Fanunza, E., Grandi, N., Quartu, M., Carletti, F., Ermellino, L., Milia, J., Corona, A., Capobianchi, MR, Ippolito, G., Tramontano, E., 2021. INMI1 Zika virus NS4B antagonizira interferonsku signalizaciju potiskivanjem fosforilacije STAT1. Virusi 13, 2448.

Fitzgerald, KA, McWhirter, SM, Faia, KL, Rowe, DC, Latz, E., Golenbock, DT, Coyle, AJ, Liao, SM, Maniatis, T., 2003. IKKε i TBK1 su bitne komponente IRF3 signalizacije put. Nat. Immunol. 4, 491–496.

Fitzky, BU, Witsch-Baumgartner, M., Erdel, M., Lee, JN, Paik, Y.-K., Glossmann, H., Utermann, G., Moebius, FF, 1998. Mutacije u Δ{{ 3}} gen sterol reduktaze kod pacijenata sa Smith-Lemli-Opitz sindromom. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 8181–8186.

Gorman, MJ, Caine, EA, Zaitsev, K., Begley, MC, Weger-Lucarelli, J., Uccellini, MB, Tripathi, S., Morrison, J., Yount, BL, Dinnon 3., KH, Ruckert, C ., Young, MC, Zhu, Z., Robertson, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Best, SM, Artyomov, MN, Garcia -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Imunokompetentni mišji model infekcije virusom Zika. Cell Host Microbe 23, 672–685.e6.

Grant, A., Ponia, SS, Tripathi, S., Balasubramaniam, V., Miorin, L., Sourisseau, M., Schwarz, MC, Sanchez-Seco, MP, Evans, MJ, Best, SM, Garcia-Sastre , A., 2016. Zika virus cilja ljudski STAT2 da inhibira signalizaciju interferona tipa I. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Hertzog, J., Dias Junior, AG, Rigby, RE, Donald, CL, Mayer, A., Sezgin, E., Song, C., Jin, B., Hublitz, P., Eggeling, C., Kohl, A., Rehwinkel, J., 2018. Infekcija brazilskim izolatom Zika virusa stvara RIG-I stimulacijsku RNK, a virusni protein NS5 blokira indukciju i signalizaciju IFN tipa I. EUR. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Efekat novog inhibitora biosinteze holesterola (AY 9944) na serumske i tkivne sterole kod pacova. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Ikonen, E., 2008. Promet ćelijskog holesterola i kompartmentalizacija. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 125–138.

Kato, H., Takeuchi, O., Sato, S., Yoneyama, M., Yamamoto, M., Matsui, K., Uematsu, S., Jung, A., Kawai, T., Ishii, KJ, Yamaguchi , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Različite uloge MDA5 i RIG-I helikaze u prepoznavanju RNA virusa. Nature 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypponeen, E., Walton, R., 2013. Mutacije DHCR7 povezane sa višim statusom vitamina D omogućile su ranu migraciju ljudi na sjeverne geografske širine. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Kumar, A., Hou, S., Airo, AM, Limonta, D., Mancinelli, V., Branton, W., Power, C., Hobman, TC, 2016. Zika virus inhibira proizvodnju interferona tipa I i nizvodno signalizacija. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Mišji model patogeneze Zika virusa. Cell Host Microbe 19, 720–730. Lee, LJ, Komarasamy, TV, Adnan, NAA, James, W., Rmt Balasubramaniam, V., 2021. Sakrij i traži: međuigra između Zika virusa i imunološkog odgovora domaćina. Front. Immunol. 12, 750365.

Leier, HC, Weinstein, JB, Kyle, JE, Lee, JY, Bramer, LM, Stratton, KG, Kempthorne, D., Navratil, AR, Tafesse, EG, Hornemann, T., Messer, WB, Dennis, EA, Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Globalna mapa lipida definira mrežu bitnu za replikaciju Zika virusa. Nat. Commun. 11, 3652.

Li, A., Wang, W., Wang, Y., Chen, K., Xiao, F., Hu, D., Hui, L., Liu, W., Feng, Y., Li, G., Tan, Q., Liu, Y., Wu, K., Wu, J., 2020. NS5 konzervativno mjesto je potrebno da Zika virus ograniči RIG-I signalizaciju. Front. Immunol. 11, 51.

Li, C., Deng, YQ, Wang, S., Ma, F., Aliyari, R., Huang, XY, Zhang, NN, Watanabe, M., Dong, HL, Liu, P., Li, XF, Ye, Q., Tian, ​​M., Hong, S., Fan, J., Zhao, H., Li, L., Vishlaghi, N., Buth, JE, Au, C., Liu, Y., Lu , N., Du, P., Qin, FX, Zhang, B., Gong, D., Dai, X., Sun, R., Novitch, BG, Xu, Z., Qin, CF, Cheng, G. , 2017. 25- Hidroksiholesterol štiti domaćina od infekcije virusom Zika i povezane mikrocefalije na modelu miša. Imunitet 46, 446–456.

Liu, CI, Liu, GY, Song, Y., Yin, F., Hensler, ME, Jeng, WY, Nizet, V., Wang, AH, Oldfield, E., 2008. Inhibitor biosinteze holesterola blokira virulenciju Staphylococcus aureus . Science 319, 1391–1394.

Liu, SY, Aliyari, R., Chikere, K., Li, G., Marsden, MD, Smith, JK, Pernet, O., Guo, H., Nusbaum, R., Zack, JA, Freiberg, AN, Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Interferon inducibilna kolesterol-25-hidroksilaza u velikoj mjeri inhibira ulazak virusa proizvodnjom 25- 25-hidroksiholesterola. Imunitet 38, 92–105.

Luo, J., Yang, H., Song, BL, 2020. Mehanizmi i regulacija homeostaze holesterola. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Terminalni enzimi sinteze kolesterola, DHCR24 i DHCR7, međusobno djeluju fizički i funkcionalno. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ma, J., Ketkar, H., Geng, T., Lo, E., Wang, L., Xi, J., Sun, Q., Zhu, Z., Cui, Y., Yang, L., Wang, P., 2018. Nestrukturni protein 4A virusa Zika blokira RLR-MAVS signalizaciju. Front. Microbiol. 9, 1350. Moebius, FF, Fitzky, BU, Lee, JN, Paik, YK, Glossmann, H., 1998.

Molekularno kloniranje i ekspresija ljudske delta{0}}sterol reduktaze. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Inhibicija alfa/beta interferonske signalizacije od strane NS4B proteina flavivirusa. J. Virol. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Inhibicija interferonske signalizacije virusom denge. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 100, 14333–14338.

Petersen, J., Drake, MJ, Bruce, EA, Riblett, AM, Didigu, CA, Wilen, CB, Malani, N., Male, F., Lee, FH, Bushman, FD, Cherry, S., Doms, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Za infekciju Andes virusom potreban je glavni regulatorni put ćelijskog sterola. PLoS Patog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Kontinuirana prijetnja flavivirusa u nastajanju. Nat. Microbiol. 5, 796–812. Prabhu, AV, Luu, W., Li, D., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016a. DHCR7: vitalni enzimski prekidač između proizvodnje holesterola i vitamina D. Prog. Lipid Res. 64, 138–151.

Prabhu, AV, Luu, W., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2016b. Kolesterolom posredovana degradacija 7-dehidroholesterol reduktaze mijenja ravnotežu sa holesterola na sintezu vitamina D. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Randall, G., 2018. Metabolizam lipidnih kapljica tokom infekcije virusom denga. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Rasmussen, SA, Jamieson, DJ, Honein, MA, Petersen, LR, 2016. Zika virus i urođeni defekti – pregled dokaza o uzročnosti. N. Engl. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Inflammation. 25-Hidroksiholesterol suzbija upalu izazvanu interleukinom-1- nizvodno od interferona tipa I. Science 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Zika virus NS3 oponaša ćelijski { {2}}vezujući motiv za suprotstavljanje RIG-I- i MDA5-posredovanom urođenom imunitetu. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Rodgers, MA, Villareal, VA, Schaefer, EA, Peng, LF, Corey, KE, Chung, RT, Yang, PL, 2012. Profiliranje lipidnih metabolita identificira metabolizam desmosterola kao novu antivirusnu metu za virus hepatitisa C. J. Am. Chem. Soc. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM inhibiraju replikaciju Zika virusa. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Interferonom stimulirani geni: složena mreža odbrane domaćina. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.