MikroRNA oblikuju društveni imunitet: potencijalna meta za biološku kontrolu Termit Reticulitermes Chinensis

Abstract

Eusocijalni insekti mogu koristiti različite bihevioralne i fiziološke obrane od bolesti kako bi izbjegli, oduprli se i tolerirali patogene infekcije u svojim blisko povezanim i zbijenim kolonijama, nazvanim društvenim imunitetom. Nedavne studije su pokazale da nekoliko molekula služi društvenom imunitetu insekata, uključujući hemijske mirise, otrove insekata, proteine ​​povezane s imunitetom, itd. Međutim, da li i kako mikroRNA (miRNA), čije prekursore obrađuje Dicer-1, pokreću društvene imunitet u kolonijama insekata još uvijek nije poznat. Ovdje smo koristili sistem 'domaćin-patogen' (domaćin: Reticulitermes chinensis; patogen: Metarhizium anisopliae) da istražimo utjecaj miRNA na društveni imunitet u kolonijama termita. Otkrili smo da RNAi posredovano utišavanje Dicer-1 dovodi do smanjene koncentracije miRNA značajno inhibira metabolizam ugljikohidrata i energije, te utječe na druge životne procese, kao što su imuni odgovor i reakcije oksidacije-redukcije, u cijelom tijelu termita. . U odbrani ponašanja, utišavanje Dicer-1 značajno je umanjilo odbrambeno društveno ponašanje kao što su kretanje, dotjerivanje, kanibalizam i sahranjivanje u grupama termita kada se susreću s gljivičnom kontaminacijom. U fiziološkoj odbrani, utišavanje Dicer-1 i stimulacija miR- 71-5 rezultiralo je značajno smanjenim antifungalnim aktivnostima termita. Nadalje, i grupe termita koje su utišale Dicer-1- i miR-71-5 tretirane stimulansima pokazale su visok nivo mortaliteta tokom kontaminacije gljivama. Naši nalazi su pokazali važnu ulogu miRNA u oblikovanju socijalnog imuniteta u kolonijama termita, pružajući uvid neophodan za razumijevanje potencijalnih mehanizama koji leže u osnovi bihejvioralne i fiziološke odbrane bolesti kod insekata i stoga postavljaju temelje za kontrolu štetočina baziranu na miRNA.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Ključne riječi Eusocijalni insekt · Entomopatogene gljive · Odbrana od bolesti · Dicer-1 · miR-71-5

Ključna poruka

• miRNA posreduju u ekspresiji gena u vezi sa društvenim imunološkim sistemom.

• miRNA su uticale na odbranu od bolesti u ponašanju u grupama termita.

• miRNA su uticale na fiziološku odbranu od bolesti kod termitnih pojedinaca.

• Termiticidi na bazi miRNA mogu se smatrati novim pristupima biološkoj kontroli štetočina.

Uvod

Termiti su ekonomski važne štetočine, koštaju 30 milijardi dolara širom svijeta i nanose globalnu štetu usjevima, drveću, drvenim konstrukcijama i celuloznim materijalima. Hemijski pesticidi pružaju efikasan put za kontrolu štetočina termita, ali također stvaraju ozbiljne probleme, ugrožavajući zdravlje ljudi i okoliš. Biološka kontrola je vrijedna alternativa koja može riješiti ove probleme. Nekoliko entomopatogena, kao što su Metarhizium i Beauveria, uspješno je primijenjeno za biološku kontrolu štetočina, što je razumno i efikasno (Verma et al. 2009; Kumar i Upadhyay 2021). Međutim, biološka kontrola termita je nezadovoljavajuća, uglavnom zbog jedinstvene odbrane od bolesti u kolonijama termita. Termiti, kao eusocijalni insekti, razvili su kolektivnu bihevioralno i individualnu fiziološku odbranu kako bi se suprotstavili visokom riziku od širenja infektivnih patogena među usko zbijenim i blisko srodnim gnijezdima (nazvanim 'socijalni imunitet') (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. 2019a). Dobro je dokumentovano da termiti koriste širok repertoar bihevioralnih odbrana: izbjegavanje je prva linija odbrane i pomaže u sprečavanju ulaska termita u zagađena područja (Yanagawa et al. 2015); alarmno ponašanje se ispoljava brzim uzdužnim oscilatornim kretanjem kako bi se upozorilo sugrađane na prisustvo patogena (Rosengaus et al. 1999); njegovanje prema gnijezdi kontaminiranim patogenima može efikasno ukloniti patogene iz zanoktica gnijezda (Liu et al. 2019b); sahranjivanje i kanibalističko ponašanje ograničavaju prijenos patogena s leševa na osjetljive srodnike iz gnijezda (Sun et al. 2016). Fiziološki odgovori kao što su imuni odgovori i oksidaciono-redukcijske reakcije također služe odbrani od bolesti termita. Imuni odgovori uključuju humoralne antimikrobne peptide posredovane imunitetom (AMP) i fagocitozu i inkapsulaciju posredovanu ćelijskom imunitetom, koji su u stanju da inhibiraju replikaciju i diseminaciju patogena u tjelesnoj šupljini insekata (Hussain et al. 2013; Liu201 et al.; Lopez-Uribe i ostali 2016; Hong i ostali 2018). Reakcije oksidacije-redukcije ublažavaju štetu uzrokovanu toksinima i reaktivnim vrstama kiseonika (ROS) tokom infekcija patogenima, doprinoseći toleranciji insekata (Liu et al. 2015; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Osim toga, prethodne studije o odbrani od bolesti termita pokazale su da su neki crijevni simbionti bili važna komponenta fiziološke odbrane domaćina (Rosengaus et al. 2014). Neki AMP bi se mogli koristiti kao vanjski dezinficijensi na površini zanoktice i u materijalima za gnijezdo kada su u sprezi s ponašanjem kao što je njegovanje i gniježđenje (Bulmer et al. 2009; Hamilton i Bulmer 2012). Stoga, slabljenje bihevioralne i fiziološke odbrane termita može biti ključni korak za poboljšanje efekta biokontrole termita.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Molekularna osnova socijalnog imuniteta prijavljena je u sve većem broju studija. Nekoliko molekula, uključujući hemijske mirise, vanjske izlučevine, antibiotike, imune proteine ​​i hemoreceptore koji služe ponašajnoj i fiziološkoj odbrani insekata, identificirano je višestrukim tehnikama omike i plinskom/tečnom hromatografijom-masenom spektrometrijom (Seipke et al. 2011; Hussain et al. 2013; Terrapon et al. 2014; Liu et al. 2015; Sun et al. 2016; He et al. 2018). U grupama termita, miris plijesni od patogena izaziva poboljšano ponašanje u njezi (Yanagawa et al. 2011). Znakovi smrti od leševa termita izazivaju ili kanibalizam ili ponašanje ukopa (Sun et al. 2016). Vanjski sekret iz prednjih i pljuvačnih žlijezda i antimikrobna aktivnost posredovana korisnim mikroorganizmima pomažu termitima da zaštite sebe, gnijezda, pa čak i kolonije (Bulmer et al. 2009; Rosengaus et al. 2000, 2014; Chouvenc et al. 2013). Za genetske i biohemijske mehanizme koji pokreću društveni imunitet insekata, mogu se koristiti RNAi i tehnologije za uređivanje gena. Kod termita, RNAi posredovano utišavanje gena termicina, gram-negativnog vezujućeg proteina 2 (GNBP2), proteina koji veže selen i transglutaminaze (TG) značajno smanjuje antifungalnu aktivnost termita i time povećava smrtnost od infekcije (Hamilton i Bulmer 2012; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Izocitrat dehidrogenaza (IDH) može uticati na metabolizam termita, a njena disregulacija izaziva povećane apoptotske lezije, što dovodi do visokog nivoa infekcija i smrtnosti (Liu et al. 2020). Osim toga, GNBP2 i TG također služe odbrani ponašanja termita, utječući na kanibalističko i njegovano ponašanje (Zhao et al. 2020; Esparza-Mora et al. 2020). Međutim, molekularna osnova socijalnog imuniteta tek treba biti jasno shvaćena, posebno molekularni mehanizam koji pokreće složena društvena ponašanja kao odgovor na infektivne patogene. Nadalje, genetski i biohemijski mehanizam društvenog imuniteta fokusira se na kodirajuću RNK koja pokreće društveni imunitet insekata, ali još uvijek nije jasno da li nekodirajuće RNK kao što su miRNA učestvuju u regulaciji društvenog imuniteta insekata.

Dicer-1, endonukleaza RNase III, neophodna je za završni korak biosinteze miRNA. miRNA su endogene, 18-25 nt, nekodirajuće RNK koje negativno reguliraju ekspresiju gena na posttranskripcijskom nivou uparivanje baza između regije sjemena u miRNA i podudarne regije u ciljnoj mRNA (Gomez-Orte i Belles 2009; Wang et al. 2013; Yang i drugi 2014; Lucas i drugi 2015). Kako proizvodnja miRNA zavisi od Dicer-1, funkcije miRNA u moduliranju bioloških procesa insekata mogu se proučavati funkcionalnim gubicima Dicer-1. Korištenjem Dicer-1 mutanata voćnih mušica, dokazano je da miRNA funkcioniraju u embriogenezi i morfogenezi olfaktornih neurona (Lee et al. 2004; Berdnik et al. 2008). Utišavanjem Dicer-1 posredovanim RNAi, istraživači su potvrdili da miRNA igraju ključnu ulogu u regulaciji razvojnih procesa u metamorfozi insekata, kao što su oni kod žohara i skakavaca (Gomez-Orte et al. 2009; Wang et al. 2013). Štaviše, miRNA su također uključene u modulaciju ponašanja insekata. miR-8 i miR-429 regulišu ponašanje penjanja izazvano virusom kod pamučnih buba direktno kontrolišući ekspresiju BrZ2 (Zhang et al. 2018). miR-133 reguliše sintezu dopamina i stoga inhibira agregaciju ponašanja kod skakavaca (Yang et al. 2014). Na osnovu takvih dokaza o funkciji miRNA u fiziologiji i ponašanju insekata, imali smo za cilj utvrditi učinak miRNA na fiziologiju termita i ponašanje uključeno u društveni imunitet korištenjem sistema 'domaćin-patogen' (domaćin: Reticulitermes chinensis; patogen: Metarhizium anisopliae). Naša studija je uglavnom uključivala tri aspekta istraživanja socijalnog imuniteta: efekat miRNA na (1) in vivo molekule koji pokreću društveni imunitet; (2) bihevioralni odbrambeni odgovor, kao što je kretanje u područjima kontaminiranim gljivama, dotjerivanje prema gljivicama kontaminiranim gnijezdama i kanibalizam/sahranjivanje prema leševima kontaminiranim gljivama; i (3) fiziološki odbrambeni odgovor, kao što je antifungalna aktivnost. Nadalje, testirali smo učinak miRNA disregulacije na smrtnost termita kontaminiranih gljivama kako bismo procijenili učinak miRNA na biološku kontrolu termita. Naša studija je otkrila potencijalni mehanizam koji leži u osnovi bihevioralne i fiziološke odbrane bolesti i nove mete za kontrolu štetočina.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Materijal i metode

Termiti

Svi eksperimentalni termiti u našem istraživanju bili su radnici termita R. chinensis. Sakupljeni su sa brda Shizi u gradu Wuhan, provincija Hubei, Kina. Termiti su uzgajani u plastičnim posudama (40×20×20 cm) koje su sadržavale male borove blokove u laboratoriji na temperaturi od 25±1 stepen, 80% relativne vlažnosti i 24 h mraka.

Entomopatogeni, kontaminirani termiti i leševi

Entomopatogena gljiva M. anisopliae (soj IBCCM321.93) kultivisana je na krompir dekstroznom agaru (PDA) 2 sedmice na 25±1 stepen, 80% relativne vlažnosti i 24 h tame. Gljivične konidije su suspendovane upotrebom 1% Tween 80 i čuvane na temperaturi od 4 stepena maksimalno 3-4 sedmice. Prije svakog eksperimenta konidijalna suspenzija je testirana na klijavost. Otkrili smo da je konidijalna suspenzija korištena za kontaminaciju termita imala stopu klijanja veću od 90%. Za pripremu termita kontaminiranih gljivama, abdomeni termita su kontaminirani kapljicom konidijalne suspenzije od 0,3 μL (108 konidija/mL) pomoću pipete (0,1–2,5 μL, Transferpette). Zatim su termiti kontaminirani gljivicama odmah hlađeni na 4 stepena na jedan sat kako bi se spriječilo njihovo kretanje i taložili gljivične konidije na njihovim kutikulama (Liu et al. 2015). Za pripremu leševa kontaminiranih gljivama, termiti su sakupljeni u epruvetu za centrifugiranje od 1,5 mL, a zatim zamrznuti u tekućem dušiku na 20 sekundi kako bi se ubili termiti. Leševi su uronjeni u konidijalnu suspenziju (108 konidija/mL), a zatim stavljeni u sterilnu petrijevu posudu sa vlažnim filter papirom za 0 i 2 d kultivacije (Sun et al. 2016).

Sinteza dsRNA i simulanta miRNA

Dicer-1 fragment (1697 bp; Dodatni materijal 1-Tekst S1) je amplificiran specifičnim prajmerima (naprijed: 5′-CTG CGA CAG ATC ATT GCA CG-3′; revers: 5′ -CAC TGG CTG TTT TGG CAC TC-3′), a njihovi PCR proizvodi su pročišćeni pomoću AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Scientific, SAD), klonirani u pMD 18-T vektor (TaKaRa, Japan) i zatim transformisan pomoću DH5 hemijski kompetentne ćelije (Tsingke Biotechnology, Kina). Jedna kolonija iz medijuma lizogene bujone (LB) sa ampicilinom poslata je u Tsingke Biotechnology Co. Ltd. na sekvencioniranje. Poravnanje sekvence je pokazalo da je naš fragment Dicer-1. T7 promotorska sekvenca (5′-GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3′) dodata je na 5′ kraj amplifikacije prajmera Dicer-1 (519 bp; naprijed: 5′ -GTG ATG CTG GAG TTG GGT TT-3′; Revers: 5′-AGA ATG AGT CGC CCA ATG TC-3′) i GFP (467 bp; Naprijed: 5′-CTT GAA GTT GAC CTT GAT GCC-3′; Revers: 5′-TGG TCC CAA TTC TCG TGG AAC- 3′) dsRNA šabloni (Dopunski materijal 1-Tekst S1). PCR proizvodi dsRNA šablona su ekstrahovani sa hidroksibenzen/hloroform/izoamil alkoholom (25:24:1) (Solarbio, Kina). dsRNA je generisana korišćenjem kompleta za transkripciju T7 RNAi (Vazyme Biotech, Kina), a zatim prečišćena hidroksibenzen/hloroform/izoamil alkoholom (50:49:1) (Solarbio). Konačno, dsRNA je procijenjena pomoću elektroforeze u agaroznom gelu i NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, SAD) i pohranjena na 80 stepeni.

MiR-71-5 simulant je bila mala dvolančana RNK dizajnirana prema miR-71-5 sekvenci (21 nt, Dodatni materijal 1-Tekst S1). Šablon miR-71-5 simulanta sastojao se od dvije dvolančane DNK koje sadrže T7 promotor: jedan je generiran oligonukleotidom A1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GAA AGA CAT GGG TAA TGA GAA A -3′) i oligonukleotid A2 (5′-TTT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) koristeći touchdown PCR; drugi je generiran oligonukleotidom B1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CTC ATT ACC CAT GTC TTT CAA A-3′) i oligonukleotidom B2 (5′-TTT GAA AGA CAT GGG TAA CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGT GAT C-3′) koristeći touchdown PCR. Kontrolni simulant je dizajniran prema GFP sekvenci (19 nt, Dodatni materijal 1-Tekst S1). Šablon kontrolnog simulanta je također nabavljen sa dvije dvolančane DNK koje sadrže T7 promotor: jedan je generiran oligonukleotidom C1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG CAA GCT GAC CCT GAA GTT AA{{33} }′) i oligonukleotid C2 (5′-TTA ACT TCA GGG TCA GCT TGC CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) koristeći touchdown PCR; drugi je generiran oligonukleotidom D1 (5′-GAT CAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ACT TCA GGG TCA GCT TGC AA-3′) i oligonukleotidom D2 (5′-TTG CAA GCT GAC CCC TCA GTT GTT AGT GAG TCG TAT TAG TGA TC-3′) koristeći touchdown PCR. MiR-71-5 i kontrolni simulanti su generisani korišćenjem kompleta za transkripciju T7 RNAi, a zatim ekstrahovani hidroksibenzenom/hloroformom/izoamil alkoholom (50:49:1). Ekstrakt je procenjen pomoću elektroforeze u agaroznom gelu i NanoDrop 2000 i čuvan na -80 stepeni.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

dsRNA hranjenje

Termiti su gladovani 12 sati prije nego što su hranjeni (Zhou et al. 2008; Hamilton i Bulmer 2012). Ukupno 18 termita stavljeno je u ćelijsku petrijevu zdjelu (D =35 mm) s komadom filter papira (D =18 mm) koji je navlažen sa 60 μL vode bez RNase koja sadrži 80 ug dsDicer-1, 80 ug dsGFP, 60 ug miRNA simulant, ili 60 ug kontrolni simulant. Za biotestove hranjenja Dicer-1 dsRNA, termitima je bilo dozvoljeno da gutaju navlaženi papir 24 sata prije eksperimenata. Termiti tretirani GFP smatrani su kontrolom. Za biotestove hranjenja simulantom miRNA, termitima je dozvoljeno da progutaju navlaženi papir 48 sati prije eksperimenata. Termiti tretirani kontrolnim simulantom smatrani su kontrolom.

RT‑qPCR

Pet ili šest replika iz tri kolonije korišteno je za ekspresiju gena korištenjem RT-qPCR. Tri termita po repliku po tretmanu su spojena za totalnu ekstrakciju RNK koristeći Direct-zol™ RNA Miniprep Kit (Zymo Research, SAD). Čistoća i koncentracija ekstrahovane RNK određene su pomoću NanoDrop 2000. RNK je konvertovana u cDNK korišćenjem PrimeScript™ RT Reagent Kit-a sa gDNA Eraser-om (Perfect Real Time) (Takara, Japan). RT-qPCR je izveden sa QuantStudio™ 3 PCR sistemom u realnom vremenu (Thermo Scientific) koristeći ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme Biotech). Specifični prajmeri su navedeni u Dodatnom materijalu 2-Tabela S1.

koncentracija miRNA

Šest replika iz tri kolonije korišteno je za određivanje koncentracije miRNA koristeći MiPure Cell/Tissue miRNA Kit (Vazyme Biotech, Kina). Tri termita po ponavljanju po tretmanu su objedinjena za miRNA. Čistoća i koncentracija ekstrahiranih miRNA određivani su pomoću NanoDrop 2000.

De novo sekvenciranje i analiza transkriptoma za

Fifteen termites from three colonies per treatment were pooled for total RNA extraction using TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies, USA). The concentration, quality, and integrity of the total RNA were determined using a NanoDrop spectrophotometer (Thermo Scientific). Sequencing libraries were generated using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina, USA) and sequenced on a HiSeq platform (Illumina) by Shanghai Personal Biotechnology Cp. Ltd. (China). Sequencing data were filtered by Cutadapt (v1.15) software. For the transcriptome sequencing project without a reference genome, Trinity (v2.5.1) software was used to montage clean reads for the transcripts for later analysis. NR (NCBI non-redundant protein sequences), GO (Gene Ontology), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome), Egg NOG (Evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous Groups), and Swiss-Prot databases were used for gene functional annotation. Furthermore, DESeq (1.30.0) was used to analyze the differentially expressed genes under the condition of |log2FoldChange(FC)|>1 i str<0.05. The genes were then mapped to GO terms, and the terms with significant enrichment were calculated by hypergeometric distribution under the condition of p<0.05 to reveal the possible functions of the candidate genes. Additionally, the genes were mapped to KEGG pathways to determine their possible functions. 

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Locomotion

Analizirano je devet replika iz tri kolonije kako bi se uporedila udaljenost kretanja Dicer{0}}utihnutih u odnosu na termita tretiranih GFP. Nakon jednog dana oralnog hranjenja dsDicer-1 ili dsGFP, jedan termit po repliku po tretmanu je stavljen u novu ćelijsku petrijevu zdjelu (D =90 mm) s komadom filter papira navlaženog konidijalnom suspenzijom (108 konidija/mL). Zatim smo crnim markerom pratili kretanje termita na prozirnom poklopcu 10 sekundi. Udaljenost kretanja mjerena je pomoću rešetkastog papira (1×1 mm).

Grooming

Analizirano je devet replika iz tri kolonije kako bi se uporedio broj ponašanja za njegu između termita koji su utišali Dicer{0}} i termita tretiranih GFP-om. Nakon jednog dana oralnog hranjenja dsDicer-1 ili dsGFP, tri termita po ponavljanju po tretmanu stavljena su u novu ćelijsku petrijevu posudu (D =35 mm) sa komadom navlaženog filter papira (D{{ 4}} mm), a zatim kontaminiran gljivičnim konidijama (108 konidija/mL). Ponašanje je snimano 15 minuta pomoću HD digitalne kamere (SONY, Japan). Video snimci su skenirani svakih 10 s kako bi se uočilo da li se među termitima kontaminiranim gljivama pojavilo ponašanje (usta termita prema tijelima srodnih gnijezda).

Kanibalizam

Devet replika iz tri kolonije je analizirano na efekat Dicer{{0}} u odnosu na GFP na kanibalističko ponašanje prema leševima kontaminiranim gljivama. Šest termita po ponavljanju po tretmanu stavljeno je u ćelijsku petrijevu posudu (D=35 mm) sa komadom vlažnog filter papira (D=18 mm) koji sadrži dsDicer-1 ili dsGFP. Omogućeno im je jednodnevno oralno hranjenje dsRNA, a zatim je jedan leš kontaminiran gljivicama inkubiran 0 dana stavljen u ćelijsku petrijevu posudu u kojoj je uzgajano šest tretiranih termita. Nakon jednog dana zajedničkog uzgoja, leš kontaminiran gljivama je ili potpuno pojeden (visok rezultat testa=2), djelomično pojeden (nizak rezultat testa=1), ili nije pojeden (bez rezultata testa{{10 }}) (Dopunski materijal 1-Sl. S1) od strane šest termita.

Pogreb

Devet replika iz dvije kolonije je analizirano na efekat Dicer-1 u odnosu na GFP na ponašanje ukopa leševa kontaminiranih gljivama. Šest termita po ponavljanju po tretmanu stavljeno je u ćelijsku petrijevu posudu (D=35 mm) sa komadom vlažnog filter papira (D=18 mm) koji sadrži dsDicer-1 ili dsGFP. Dozvoljen im je jedan dan oralnog hranjenja dsRNA. Zatim je jedan leš kontaminiran gljivama inkubiran 2 dana, a zemlja je dodana u petrijevu posudu u kojoj je uzgajano šest tretiranih termita. Nakon jednog dana zajedničkog uzgoja, leš kontaminiran gljivama je ili potpuno zakopan (visok rezultat testa=2), djelimično zakopan (nizak rezultat testa=1), ili nije zakopan (bez rezultata testa{{10 }}) (Dopunski materijal 1-Sl. S2) od strane šest termita.

Antifungalna aktivnost

Šest replika iz tri kolonije je analizirano na uticaj Dicer{0}} i miR-71-5 na sposobnost termita da inhibiraju rast gljivica. Pet termita po ponavljanju po tretmanu je spojeno i smrvljeno tečnim azotom, a zatim otopljeno u 100 μL 0,9% fiziološkog rastvora. Homogenat je centrifugiran na 6000×g pet minuta na 4 stepena da bi se dobilo 80 μL supernatanta. Zatim je supernatant ponovo centrifugiran da bi se dobilo 50 μL supernatanta. Za djelovanje protiv gljivica, 96-mikroploča s bunarom je korištena za mjerenje apsorpcije uzoraka, kontrola rasta i standardnih slijepih uzoraka za izračunavanje smanjenja rasta gljivica: (1) 50 μL krompirove dekstroze (PD), 2 μL konidije gljivice (108 konidije/mL) i 5 μL supernatanta po jažici su pomiješani za uzorak; (2) 50 μL krompirove dekstroze (PD), 2 μL konidija gljivica (108konidije/mL) i 5 μL 0,9% fiziološkog rastvora po jažici pomešano je za kontrolu rasta gljivica; (3) 50 μL krompirove dekstroze (PD) i 7 μL 0,9% fiziološkog rastvora po jažici je pomešano za standardni slepi uzorak. Nakon 24 h kultivacije u šejkeru s konstantnom temperaturom (150 rpm na 25 ± 1 stepen), mjerenje je izvršeno na spektrofotometru za mikroploče (600 nm; Thermo Scientific).

Preživljavanje

Da bi se utvrdio efekat oralnog hranjenja dsDicer-1 na preživljavanje termita, termiti iz tri kolonije su raspoređeni da bi se utvrdilo preživljavanje Dicer-1-utišanog (ukupno 42 termita, 14 termita po koloniji) i GFP- tretirani (ukupno 42 termita, 14 termita po koloniji) termiti tokom kontaminacije gljivicom. Za kontrole, 56 termita iz dvije kolonije je raspoređeno kako bi se utvrdilo preživljavanje Dicer-1-utišanih (ukupno 28 termita, 14 termita po koloniji) i termita tretiranih GFP-om (ukupno 28 termita, 14 termita po koloniji). Prilikom izvođenja eksperimenata, sedam termita je uzgojeno u ćelijskoj petrijevoj posudi (D =35 mm) sa komadom filter papira (D =18 mm) navlaženim vodom bez RNase koja sadrži dsDicer{{17} } ili dsGFP, dok su termiti kontaminirani gljivicama i potom uzgajani deset dana radi svakodnevnog posmatranja njihovog preživljavanja. Da bi se utvrdio učinak oralnog hranjenja miR-71-5 simulantom na preživljavanje termita, termiti iz tri kolonije su raspoređeni kako bi se utvrdilo preživljavanje miR-71-5 (ukupno 42 termita, 14 termita po koloniji) i kontrole ( 42 termita ukupno, 14 termita po koloniji) termiti tretirani simulantom tokom gljivične kontaminacije. Dodatno, 56 termita iz dvije kolonije je raspoređeno kako bi se utvrdilo preživljavanje miR- 71-5 (ukupno 28 termita, 14 termita po koloniji) i kontrola (ukupno 28 termita, 14 termita po koloniji) termita tretiranih simulantom. Prilikom izvođenja eksperimenata, sedam termita je uzgojeno u ćelijskoj petrijevoj zdjelici (D=35 mm) sa komadom filter papira (D=18 mm) navlaženim vodom bez RNase koja sadrži miR{{35} } simulant ili kontrolni simulant. Nakon dva dana oralnog hranjenja, termiti su kontaminirani gljivicama i potom uzgajani deset dana radi svakodnevnog promatranja njihovog preživljavanja. Mrtvi termiti su na vrijeme uklonjeni.

Statistička analiza

Sve analize podataka obavljene su u IBM SPSS, verzija 19. Shapiro-Wilkov test je korišten za otkrivanje da li su skupovi podataka normalno distribuirani. S obzirom da su podaci o ekspresiji gena, kanibalizmu i sahranjivanju bili abnormalno raspoređeni, korišten je Wilcoxonov test. Alternativno, podaci o koncentraciji miRNA, kretanju, njezi i antifungalnoj aktivnosti bili su normalno raspoređeni, a korišten je upareni t-test. Preživljavanje je analizirano Kaplan–Meier metodom za životni vijek u različitim uvjetima liječenja. Nivo značajnosti je bio str<0.05 in this study.

Rezultati

Profil ekspresije mRNA Dicer-1-utihnutih termita

Da bi se odredio efekat Dicer{{0}} na profil ekspresije gena termita, izvršeno je sekvenciranje mRNA Dicer-1-utišanih termita. Nakon 1 dana oralnog hranjenja ekspresije dsDicer-1, Dicer-1 (slika 1A; n=6, p < 0,05; Wilcoxon test) i stoga koncentracije miRNA (slika 1B; df =5, str<0.05; paired t-test) were significantly decreased in termites. A total of 1262 mRNAs were significantly altered in the whole bodies of Dicer-1-silenced termites (upregulated: 562 mRNAs; downregulated: 700 mRNAs; Fig. 1C and Supplementary material 2-Table S2). The differentially expressed genes (DEGs) were mapped to the salivary secretion, glycolysis, citrate cycle, and 29 other KEGG pathways (Fig. 1D–F and Supplementary material 2-Table S3). In addition, the DEGs were clustered into the ATP generation from ADP, structural constituent of the cuticle, defense response, glutathione transferase activity, oxidation–reduction process, and 171 other GO terms (Fig. 2 and Supplementary material 2-Table S4).

Slika 1 Profil ekspresije gena u cijelim tijelima termita s licencom Dicer{1}}. Dicer-1 izraz. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost±SEM. *str<0.05. B The concentration of miRNAs. The data are shown as the mean±SEM. *p<0.05. C The number of diferentially expressed genes (DEGs). D The DEGs mapped to salivary secretion. ATP1B, Sodium/potassium-transporting ATPase subunit beta; ATP2B, Plasma membrane calcium-transporting ATPase 1; PKC, Protein kinase C alpha type; CALM, Calmodulin-like protein; LYZ, Lysozyme C. E The DEGs mapped to glycolysis. GPI, Glucose-6-phosphate isomerase; PFKC, ATP-dependent 6-phosphor fructokinase; TIM, Triosephosphate isomerase; GAPDH, Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; PGK, Phosphoglycerate kinase; MINPP1, Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1; GPMA, 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase; ENO, Enolase. F DEGs mapped to citrate cycle. PCK, phosphoenolpyru vate carboxykinase [GTP]; PYC, pyruvate carboxylase; MDH1, malate dehydrogenase; SUCD, succinate–CoA ligase [ADP-forming]. Red letters indicate upregulation; blue letters indicate downregulation

Slika 2 Toplotne mape DEG-ova grupisanih u GO termine vezane za odbranu. ATP generacija iz ADP-a. B Strukturni sastojak kutikule. C Odgovor odbrane. D Aktivnost glutation transferaze. E Oksidaciono-redukcioni proces

RT–qPCR verifikacija DEG-ova iz mRNA-sekv

Glikoliza, ciklus citrata i stvaranje ATP-a iz ADP-a bili su povezani s metabolizmom ugljikohidrata i energije, u kojem je osam DEG (gliceraldehid{{0}}fosfat dehidrogenaza, 2,3-fosfoglicerat zavisan od fosfoglicerata, muta enolaza, triosefosfat izomeraza, ATP zavisna 6-fosfofruktokinaza, fosfoenolpiruvat karboksikinaza [GTP], sukcinat-CoA ligaza [podjedinica koja formira ADP] alfa-2 i malatregula dehidrogenaza) su potvrđene nakon značajnog smanjenja dicerogeneze -1 utišavanje (sl. 3A–H; n=6, p < 0,05; Wilcoxon test), što ukazuje na poremećaje glikolize, ciklusa citrata, stvaranja ATP-a, a time i metabolizma ugljikohidrata i energije u cijelom tijelu Dicer{12}}utišanih termita. DEG (defenzin i terminicin) u odbrambenom odgovoru kodiranim AMP. Ekspresija ovih gena je značajno povećana kod Dicer-1-utišanih termita u poređenju sa onim kod termita tretiranih GFP-om (slika 3I, J; n=5 ili 6, p<0.05; Wilcoxon test). In the oxidation–reduction process, cytochrome P450 9e2 and peroxiredoxin-4 were significantly altered after Dicer-1 silencing in termites (Fig. 3K, L; n = 6, p<0.05; Wilcoxon test). These results implied an important effect of Dicer-1 on the immune response and oxidation–reduction reaction in whole-body of the termites. The effect of Dicer‑1 on behavioural disease defences in termite groups 

Da bismo odredili učinak Dicer-1 na bihevioralni odgovor na gljivičnu kontaminaciju, testirali smo četiri važne bihevioralne odbrane, kretanje, dotjerivanje, kanibalizam i sahranu, kod Dicer-1-utišanih termita. Naši rezultati su pokazali da je lokomocija (slika 4A, t=7.013, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S3 and Video S1), grooming (Fig. 4B, t=5.949, df=8, p<0.01; paired t-test; Supplementary material 1-Fig. S4 and Video S2), cannibalistic (Fig. 4C, n =9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S1 and Video S3) and burial (Fig. 4D; n=9, p<0.05; Wilcoxon test; Supplementary material 1-Fig. S2 and Video S4) behaviors were significantly reduced in Dicer-1-silenced termites compared to GFP-treated termites, suggesting an important role of Dicer-1 in driving behavioral disease defenses in termite colonies.

Slika 3 RT-qPCR verifikacija DEG-a iz mRNA-seq. A-H geni povezani s metabolizmom ugljikohidrata i energije. I-J geni povezani sa imunološkim odgovorom. K-L geni povezani sa oksidaciono-redukcionim reakcijama. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost±SEM. *str<0.05

Učinak Dicer-1 i miR-71-5 na antifungalne sposobnosti termita

Da bismo odredili efekat miRNA na fiziološki odgovor na kontaminaciju gljivicom, testirali smo ukupne antifungalne aktivnosti Dicer{0}}utihnutih termita. Naši rezultati su pokazali da je antifungalna aktivnost značajno smanjena (slika 5A; t=−3,046, df=5, p<0.05; paired t-test) in Dicer-1-silenced termites. Furthermore, miR-71-5 was selected for further testing to determine its role in physiological defense, which was chosen according to the comparative profiling of miRNAs and mRNAs in fungus-contaminated versus naive termites and miRNA-mRNA analysis (data unpublished). We found that the antifungal activity (Fig. 5B; t=−4.000, df=5, p<0.05; paired t-test) was significantly reduced in termites treated with miR-71-5 simulants compared to those treated with simulant controls. These results suggested that miRNAs played an important role in driving physiological disease defenses in termites.

Slika 4. Utjecaj disregulacije miRNA na odbrambeno društveno ponašanje u grupama termita. A lokomocija, B dotjerivanje, C kanibalističko i D ponašanje ukopa utišanih Dicer-1-nasuprot grupa termita tretiranih GFP-om. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost±SEM. *str<0.05, **p<0.01

Slika 5. Utjecaj disregulacije miRNA na fiziološku odbranu kod termita. Antifungalna aktivnost Dicer{1}}utihnutih u odnosu na termite tretirane GFP. B Antifungalna aktivnost miR-71-5 u odnosu na kontrolne termite tretirane simulantom. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost±SEM. *str<0.05

Dicer‑1 i miR‑71‑5 utjecali su na preživljavanje termita kontaminiranih gljivama

Kako su simulanti dsDicer-1 i miR-71-5 doveli do smanjene antifungalne aktivnosti termita, testirali smo njihov potencijal za biološku kontrolu termita. Otkrili smo da su Dicer-1-utišani termiti kontaminirani gljivicama pokazali značajno smanjeno preživljavanje u poređenju sa ostalim tretiranim termitima (dsDicer-1+gljivica naspram dsGFP+gljivica: χ2=81.839, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsDicer-1+Tween 80: χ2=63.070, p<0.001; dsDicer-1+fungus vs dsGFP+Tween 80: χ2=65.474, p<0.001). GFP-treated termites contaminated with fungus showed significantly decreased survival compared to the termites without fungal contamination (dsGFP+fungus versus dsDicer-1+Tween 80: χ2=58.636, p<0.001; dsGFP+fungus versus dsGFP+Tween 80: χ2=68.849, p<0.001). There was no significant difference between dsDicer-1- and dsGFP-treated termites without fungal contamination (χ2=2.037, p=0.154) (Fig. 6A). Additionally, the survival of fungus-contaminated termites treated with the miR- 71-5 simulant was signifcantly decreased compared to that of other treated termites (miR-71-5+fungus vs. control+fungus: χ2=63.593, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. miR- 71–5+Tween 80: χ2=60.585, p<0.001; miR-71-5+fungus vs. control+Tween 80: χ2=67.129, p<0.001). The survival of fungus-contaminated termites treated with the simulant control was significantly decreased compared to that of the termites without fungal contamination (control+fungus vs. miR-71-5+Tween 80: χ2=61.065, p<0.001; control+fungus vs. control+Tween 80: χ2=68.064, p<0.001). There was no significant difference in survival between termites treated with the miR-71-5 simulant and simulant control without fungal contamination (miR-71-5+Tween 80 vs. control+Tween 80: χ2=1.000, p=0.317) (Fig. 6B). These results suggested a good effect of miRNAs coupled with entomopathogens in biologically controlling termites.

Diskusija

miRNA obavljaju višestruke funkcije, kao što su regulacija metabolizma ugljikohidrata i energije, imunološki odgovor, oksidaciono-redukcijske reakcije i drugi životni procesi u cijelim tijelima termita. Kao što se očekivalo, gutanje dsDicer-1 u termitima dovelo je do utišavanja Dicer-1, a zatim smanjilo koncentraciju miRNA, što sugerira uspješnu indukciju miRNA disregulacije. Analiza transkripcije je pokazala da je utišavanje Dicer-1 povezano sa 32 KEGG puta i 175 GO termina. U kolonijama društvenih insekata, lučenje pljuvačke može funkcionirati kao vanjsko dezinfekcijsko sredstvo i djelovati u sprezi sa društvenim ponašanjem kao što je trofalaksija, njegovanje i gniježđenje za brigu o potomcima, gnijezdima i kolonijama (Bulmer et al. 2009; Hamilton et al. 2011. Hamilton i Bulmer 2012). Glikoliza, citratni ciklus i stvaranje ATP-a iz ADP-a su uključeni u metabolizam ugljikohidrata i energije. S obzirom na to da su jačanje imunoloških odgovora i izvođenje društvenog ponašanja energetski skupi, poremećaji metabolizma ugljikohidrata i energije imaju negativan utjecaj na ove procese (Liu et al. 2020; Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). Strukturni sastojak kutikule povezuje se s kutikulama insekata, tvoreći prvu barijeru koja sprečava da patogeni invaziju na hemocoel (Syazwan et al. 2021). Nekoliko DEG-ova uključenih u odbrambeni odgovor, aktivnost glutation transferaze i proces oksidacije-redukcije mogu kodirati antimikrobne peptide (AMP), proteine ​​za detoksikaciju i antioksidativne enzime kako bi povećali otpornost i toleranciju insekata na patogene (Liu et al. 2015, 2019a). Ove funkcije vezane za odbranu vjerovatno će doprinijeti socijalnom imunitetu u kolonijama termita. Ostali KEGG putevi i termini GO bili su uključeni u nervni sistem, probavni sistem, dugovječnost, razvoj, itd. (Dodatni materijal 2-Tabela S3 i S4). Osim toga, neki od DEG-ova (npr. geni za metabolizam ugljikohidrata i energije) u Dicer-1 utišanim termitima bili su od mikroba (Dopunski materijal 2-Tabela S2), koji su vjerovatno bili simbionti crijeva i mogli bi biti važne komponente učestvovanje u životnim procesima domaćina. Stoga je vjerovatno da će miRNA imati globalni utjecaj na cijelo tijelo termita.

Slika 6. Utjecaj miRNA dys regulacije na preživljavanje grupa termita kontaminiranih gljivama. Opstanak Dicer{2}}utihnutih u odnosu na termita tretiranih GFP-om sa ili bez gljivične kontaminacije; B Preživljavanje miR-71-5 u odnosu na kontrolne termite tretirane simulantom sa ili bez gljivične kontaminacije. Različita slova ukazuju na značajne razlike, str<0.05

Metabolizam ugljikohidrata i energije, imunološki odgovor i reakcije oksidacije-redukcije važni su za miRNA u pokretanju društvenog imuniteta. Ponašanje životinja je energetski ovisan proces, pa stoga neki energetski inhibitori uzrokuju da se životinje kreću polako, pa čak i uginu (Davidson 1930; Schuler i Casida 2001). U kolonijama termita, poremećaji glikolize ili ciklusa citrata dovode do sniženih nivoa ATP-a i inhibiraju lokomotorno ponašanje (Hassan et al. 2021a, b; Xu et al. 2021a, b). Poremećaji citratnog ciklusa također smanjuju antifungalnu aktivnost termita, što dovodi do povećane infekcije i smrtnosti (Liu et al. 2020). Osim toga, kako je prijavljeno da simbionti u crijevima termita sudjeluju u odbrani od bolesti domaćina osiguravajući enzime (Rosengaus et al. 2014) i metabolite (Inagaki i Matsuura 2018), metabolički poremećaji u crijevnim simbiontima vjerovatno će smanjiti imunokompetentnost uzrokovanu simbiontima. a time i smanjena odbrana od bolesti termita. U našoj studiji, potvrđeno je da je osam metaboličkih gena značajno smanjeno, što ukazuje na poremećaje glikolize i citratnog ciklusa u cijelim tijelima Dicer{9}}utihnutih termita. Sugerirali smo da je metabolizam ugljikohidrata i energije posredovan miRNA važan biokemijski mehanizam u pokretanju društvenog imuniteta i da bi poremećaj ovog procesa vjerovatno umanjio bihevioralne i fiziološke obrane od bolesti u kolonijama termita. Imuni sistem insekata izaziva veliki broj efektorskih molekula za borbu protiv patogena in vivo. Defenzini su kompaktni AMP, bogati cisteinom i otporni na proteaze, širokog spektra djelovanja protiv bakterija, gljivica i drugih parazita (Weber 2021). Termicin je antifungalni defenzin specifičan za termite čije utišavanje rezultira smanjenom antifungalnom aktivnošću, a time i povećanom smrtnošću termita kontaminiranih gljivama (Hamilton i Bulmer 2012). Sistemi za detoksikaciju insekata i antioksidansi često funkcionišu zajedno sa imunološkim sistemom, što efikasno smanjuje rizik od toksina i ROS-a tokom interakcija domaćin-patogen (Syazwan et al. 2021). Citokrom P450 monooksigenaze su odgovorne za katalizaciju oksidacije i metabolizma patogenih toksina i proizvodnju slobodnih radikala ili ROS (Shankar i Mehendale 2014). Porodica peroksiredoksina uključuje antioksidativne enzime koji katalizuju redukciju ROS (Xu et al. 2021a; b). Naši rezultati su potvrdili da je utišavanje Dicer-1 značajno promijenilo ekspresiju gena defenzina, tricina, citokroma P450 9e2 i peroksiredoksina-4, što ukazuje da su miRNA igrale važnu ulogu u regulaciji imunološkog odgovora i oksidaciono-redukcijske reakcije u cijelom tijelu termita. Stoga predlažemo da metabolizam ugljikohidrata i energije, imunološki odgovor i reakcije oksidacije-redukcije mogu sudjelovati u pokretačkom mehanizmu socijalnog imuniteta u obliku miRNA, a njihov poremećaj može negativno utjecati na socijalni imunitet u kolonijama termita.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Zaista, disregulacija miRNA ima negativan utjecaj na kretanje, a time i odbranu ponašanja u kolonijama termita. Za razliku od pojedinačnih insekata, društveni insekti razvili su bogat repertoar bihevioralnih odbrana, kolektivno otkrivajući prisustvo patogena, ograničavajući širenje patogena i smanjujući rizik od infekcije pojedinaca (Van Meyel et al. 2018; Liu et al. 2019a). Stariji radnici obavljaju opasne poslove izvan gnijezda i lako se kontaminiraju. Kada su kontaminirani, prijatelji iz gnijezda imaju tendenciju da se spajaju i dotjeruju kontaminirane radnike (Liu et al. 2019b). I kontaminirani radnici i njihovi njegovatelji povećavaju udaljenost od ostalih naivnih gnijezda. Medicinske sestre odvode leglo dublje u dubinu kolonije kako bi povećale udaljenost od kontaminiranih radnika (Stroeymeyt et al. 2018). Ovi rezultati pokazuju da je povećanje fizičke udaljenosti između članova kolonije efikasna strategija za ograničavanje prijenosa patogena [koji se naziva 'organizacijski imunitet' (Liu et al. 2019a)], a lokomocija bi trebala biti važno društveno ponašanje, jer adaptivno prilagođava udaljenost između kontaminiranih jedinki i naivnih gnezda. Hassan i kolege su otkrili da su termiti značajno poboljšali svoju lokomociju tokom gljivične kontaminacije, dodatno demonstrirajući kretanje kao odgovor na patogene (Hassan et al. 2021a, b). Osim toga, njegovanje, ljudožderstvo i sahranjivanje su dobro poznati u zbrinjavanju kontaminiranih pojedinaca i leševa u kolonijama društvenih insekata. Kod termita kontaminiranih gljivama, njegovanje se javlja neposredno, prije klijanja (Liu et al. 2019b). Nasuprot tome, kanibalističko ponašanje se javlja tek nakon što kontaminirane osobe postanu vidljivo bolesni (Davis et al. 2018). Za zbrinjavanje leševa, svježi leševi se često smatraju nutritivnom nagradom i izazivaju kanibalizam stvarajući rani znak smrti. Nasuprot tome, raspadnuti leševi se smatraju rizikom od infekcije i izazivaju sahranu tako što proizvode kasne znakove smrti (Sun et al. 2016). Ovdje smo otkrili da Dicer{12}} utišavanje značajno inhibira lokomociju i druge pokrete, kao što su dotjerivanje, kanibalističko ponašanje i ponašanje ukopa, što sugerira da je disregulacija miRNA pokazala opći učinak na kretanje termita i posljedično utjecala na odbranu ponašanja od patogena, patogena. kontaminiranih gnijezda i leševa kontaminiranih patogenima u kolonijama termita. Za pokretački mehanizam, metabolizam ugljikohidrata i energije posredovan miRNA može se smatrati jednim od najvažnijih biohemijskih faktora (vidi gornju diskusiju). Stoga bi miRNA mogle oblikovati bihevioralne odbrane termita.

Disregulacija miRNA također je imala negativan utjecaj na fiziološku odbranu termita. Termiti obično povećavaju svoju antigljivičnu sposobnost povećanjem imunoloških gena kako bi poboljšali svoju fiziološku odbranu (Liu et al. 2015). Antifungalne supstance koje potiču iz crevnog simbionta daju termitima sposobnost da inhibiraju rast gljivica kako bi poboljšali njihovu fiziološku odbranu (Rosengaus et al. 2014). Stoga je ukupna antifungalna aktivnost bila efikasan pokazatelj fiziološke odbrane termita od bolesti. Nedavne studije su pokazale da su ne samo imunološki geni, već i metabolizam ugljikohidrata i antioksidativni geni prijavljeni kao važne komponente koje utiču na antifungalnu aktivnost termita (Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). Defaunirani termiti bili su podložniji kontaminaciji gljivama (Rosengaus et al. 2014). Iako je povećana ekspresija imunih gena kao što su defensin i tricin, disregulacija miRNA posredovana Dicerom-1- smanjila je ekspresiju metabolizma ugljikohidrata i antioksidativnih gena unutar termita ili crijevnih simbionta i stoga značajno smanjila ukupnu antifungalnu aktivnost termita. Osim toga, termiti tretirani simulantom miR-71-5 također su pokazali smanjenje ukupne antigljivične aktivnosti, što dalje ukazuje na negativan utjecaj miRNA disregulacije na fiziološku odbranu kod termita. Nadalje, grupe termita koje su hranjene ili dsDicer-1 ili miR-71-5 simulantom bile su osjetljivije na kontaminaciju gljivica, pokazujući povećanje smrtnosti od infekcije. Stoga bi miRNA mogle oblikovati društveni imunitet pokrećući i bihejvioralne i fiziološke odbrane od bolesti u kolonijama termita.

Slika 7 Potencijalni mehanizmi u osnovi socijalnog imuniteta u kolonijama termita i nove mete za biološku kontrolu štetočina. miRNA u velikoj mjeri utječu na cijelo tijelo termita, uključujući metabolizam ugljikohidrata i energije A, imunološki odgovor B, reakcije oksidacije i redukcije C, itd. D Izvještava se da metabolizam ugljikohidrata i energije igraju važnu ulogu u regulaciji ponašanja i antifungalne aktivnosti kod termita. Stoga je metabolizam ugljikohidrata i energije posredovan miRNA vjerojatno bio jedan od genetskih i biokemijskih faktora koji pokreću bihejvioralne (kao što su kretanje, dotjerivanje, kanibalizam i sahranjivanje) i fiziološke (antigljivične aktivnosti) obrane od bolesti u kolonijama termita. E Imunološki odgovor pomogao je termitima da inhibiraju replikaciju i širenje patogena u tjelesnoj šupljini. Reakcija oksidacije-redukcije štitila je termite od oštećenja uzrokovanih toksinima i ROS od interakcija "domaćin-patogen". Stoga, miRNA posredovan imuni odgovor i reakcija oksidacije-redukcije igra važnu ulogu u pokretanju fiziološke odbrane od bolesti kod termita. F miRNA su oblikovale društveni imunitet tako što su pokretale bihevioralne i fiziološke odbrane od bolesti u kolonijama termita. Ciljanjem miRNA mogli bismo umjetno povećati osjetljivost kolonija termita na entomopatogene i posljedično poboljšati biološku kontrolu termita.

Prema našim saznanjima, ovo je prvi izvještaj o potencijalnom mehanizmu miRNA koji su u osnovi socijalnog imuniteta u kolonijama termita. miRNA mogu utjecati na lučenje pljuvačke, metabolizam ugljikohidrata i energije, stvaranje zanoktica, imunološki odgovor, oksidaciono-redukcijske reakcije, itd. Među njima, metabolizam ugljikohidrata i energije je vjerovatno važan biohemijski faktor u pokretanju odbrambenog ponašanja kao što su kretanje, dotjerivanje, kanibalizam, i sahranjivanje u kolonijama termita. Osim toga, metabolizam ugljikohidrata i energije, imunološki odgovor i oksidaciono-redukcijske reakcije vjerovatno će sudjelovati u pokretanju fiziološke odbrane termita, kao što je antifungalna aktivnost.

Stoga društveni imunitet u obliku miRNA može utjecati na osjetljivost kolonija termita na entomopatogene gljive; stoga, miRNA mogu biti efikasne mete za biološku kontrolu termita (slika 7). Brojne studije su dokazale da utišavanje ciljnih gena posredovano RNAi može dovesti do smrti insekata, sa značajnim potencijalom za kontrolu štetočina insekata. U kontroli štetočina termita, Zhou et al. (2008) prvi su ciljali gene endoglukanaze i heksamera putem hranjenja dsRNA, demonstrirajući izvodljivost termiticida na bazi RNAi. Da bi se pojačao smrtonosni učinak u kolonijama termita, korišteni su termiticidi na bazi RNAi u kombinaciji sa infektivnim entomopatogenim gljivama. RNAi posredovano utišavanje tricina, GNBP2, TG, IDH i drugih kodirajućih gena zajedno s Metarhiziumom moglo bi značajno povećati osjetljivost gnezda na društveno prenesene gljivične konidije i stoga dovesti do povećane stope smrtnosti od infekcije (Hamilton i Bulmer 2012; Liu et al. 2020; Zhao et al. 2020; Zhou et al. 2021). U našoj studiji, demonstrirali smo izvodljivost ciljanja malih nekodirajućih RNA kroz hranjenje kako bismo optimizirali biološku kontrolu termita koristeći Metarhizium. U poređenju sa dsRNA koje su specifično ciljale na gen, miRNA su bile u stanju da ciljaju niz gena sa istim ili različitim funkcijama, te stoga imaju uticaj širokog spektra na životne procese termita. Stoga, ciljanjem miRNA, grupe termita su pokazale smanjenu bihevioralno i fiziološku odbranu bolesti na grupnom i individualnom nivou, što ukazuje na inhibiciju širokog spektra socijalnog imuniteta termita. Ciljajući miRNA, grupe termita su posljedično pokazale visok nivo mortaliteta tokom gljivične kontaminacije, što sugerira da bi se miRNA mogle koristiti kao termiticidi za poboljšanje biološke kontrole termita smanjenjem njihovog socijalnog imuniteta. Stoga bi se miRNA mogle smatrati potencijalnim novim metama za kontrolu insekata.

Reference

Berdnik D, Fan AP, Potter CJ, Luo L (2008) MikroRNA procesni put reguliše morfogenezu olfaktornih neurona. Curr Biol 18:1754–1759. https://doi.org/10.1016/j.cub.2008.09.045

Bulmer MS, Bachelet I, Raman R, Rosengaus RB, Sasisekharan R (2009) Ciljanje antimikrobne funkcije efektora u imunitetu insekata kao strategija kontrole štetočina. Proc Natl Acad Sci USA 106:12652–12657. https://doi.org/10.1073/pnas.0904063106

Chouvenc T, Efstathion CA, Elliott ML, Su NY (2013) Produžena otpornost na bolesti koja se pojavljuje iz fekalnog gnijezda podzemnog termita. Proc R Soc B 280:20131885. https://doi.org/10.1098/ rspb.2013.1885

Davidson WM (1930) Rotenon kao kontaktni insekticid. J Econ Entomol 23:868–874. https://doi.org/10.1093/JEE/23.5.868

Davis HE, Meconcelli S, Radek R, McMahon DP (2018) Termiti oblikuju svoj kolektivni bihevioralni odgovor na osnovu stadijuma infekcije. Sci Rep 8:14433. https://doi.org/10.1038/ s41598-018-32721-7

Esparza-Mora MA, Davis HE, Meconcelli S, Plarre R, McMahon DP (2020) Inhibicija izlučenog imunološkog molekula ometa društveni imunitet termita. Prednji Ecol Evol 8:75. https://doi.org/10. 3389/fevo.2020.00075

Gomez-Orte E, Belles X (2009) Metamorfoza zavisna od mikroRNA kod hemimetabolanskih insekata. Proc Natl Acad Sci USA 106:21678–21682. https://doi.org/10.1073/pnas.0907391106

Hamilton C, Bulmer MS (2012) Molekularna antifungalna odbrana kod podzemnih termita: RNA interferencija otkriva in vivo uloge terminusa i GNBP-a protiv patogena koji se prirodno sreće. Dev Comp Immunol 36:372–377. https://doi.org/10.1016/j.dci. 2011.07.008

Hamilton C, Lejeune BT, Rosengaus RB (2011) Trofalaksa i profilaksa: socijalni imunitet kod mrava stolaraCamponotus pennsylvanicus. Biol Lett 7:89–92. https://doi.org/10.1098/rsbl. 2010.0466

Hassan A, Huang Q, Mehmood N, Xu H, Zhou W, Gao Y (2021a) Promjena lokomocije termita i alogrooming kao odgovor na infekciju patogenim gljivama. J Econ Entomol 114:1256–1263. https://doi.org/10.1093/jee/toab071

Hassan A, Huang Q, Xu H, Wu J, Mehmood N (2021b) Utišavanjefosfofruktokinazagen ometa glikolizu i uzrokuje abnormalnu lokomociju u podzemnim termitimaReticulitermes chinensisSnyder. Insect Mol Biol 30:57–70. https://doi.org/10. 1111/imb.12672

He S et al (2018) Termitski vojnici doprinose društvenom imunitetu sintetizirajući moćne oralne sekrecije. Insect Mol Biol 27:564-576. https://doi.org/10.1111/imb.12499

Hong M, Hwang D, Cho S (2018) Morfologija hemocita i ćelijski imuni odgovor kod termita (Reticulitermes speratus). J Insect Sci 18:46. https://doi.org/10.1093/jisesa/iey039

Hussain A, Li YF, Cheng Y, Liu Y, Chen CC, Wen SY (2013) Imunski vezan transkriptomCoptotermes formosanusRadnici Širakija: odbrambeni mehanizam. PLOS ONE 8:e69543. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069543

Inagaki T, Matsuura K (2018) Prošireni uzajamnost između termita i crijevnih mikroba: nutritivni simbionti doprinose higijeni gnijezda. Sci Nat 105:52. https://doi.org/10.1007/ s00114-018-1580-y

Kumar S, Upadhyay RK (2021) Antitermitski potencijal različitih bioorganskih sastojaka s posebnim osvrtom na porodicu Asteraceae. WJPR 10:1109–1149. https://doi.org/10.20959/wjpr2 0213-19977

Lee YS et al (2004) Različite uloge zaDrosophilaDicer-1 i Dicer-2 u putevima utišavanja siRNA/miRNA. Ćelija 117:69– 81. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00261-2

Liu L, Li GH, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2015) Eksperimentalna verifikacija i molekularna osnova aktivne imunizacije protiv gljivičnih patogena u termitima. Sci Rep 5:15106. https://doi.org/ 10.1038/srep15106

Liu L, Wang W, Liu YL, Sun PD, Lei CL, Huang QY (2019a) Utjecaj alogrooming ponašanja na individualni urođeni imunitet kod podzemnih termitaReticulitermes chinensis(Isoptera: Rhinotermitidae). J Insect Sci 19:6. https://doi.org/10.1093/jisesa/ iey119

Liu L, Zhao XY, Tang QB, Lei CL, Huang QY (2019b) Mehanizmi socijalnog imuniteta protiv gljivičnih infekcija kod eusocijalnih insekata. Toxins 11:244. https://doi.org/10.3390/toxins11050244

Liu L, Wang CC, Zhao XY, Guan JX, Lei CL, Huang QY (2020) Metabolički poremećaji posredovani izocitrat dehidrogenazom ometaju aktivnu imunizaciju protiv gljivičnih patogena kod eusocijalnih termita. J Pest Sci 93:291–301. https://doi.org/10.1007/ s10340-019-01164-y

Lopez-Uribe MM, Sconiers WB, Frank SD, Dunn RR, Tarpy DR (2016) Smanjeni ćelijski imuni odgovor u linijama društvenih insekata. Biol Lett 12:20150984. https://doi.org/10.1098/rsbl.2015. 0984

Lucas KJ, Zhao B, Liu S, Raikhel AS (2015) Regulacija fizioloških procesa mikroRNA kod insekata. Curr Opin Insect Sci 11:1–7. https://doi.org/10.1016/j.cois.2015.06.004

Rosengaus RB, Jordan C, Lefebvre ML, Traniello JFA (1999) Ponašanje alarma patogena kod termita: novi oblik komunikacije kod društvenih insekata. Naturwissenschaften 86: 544–548. https://doi.org/ 10.1007/s001140050672

Rosengaus RB, Lefebvre ML, Traniello JFA (2000) Inhibicija klijanja spora gljivica nasutitermima: dokaz moguće antiseptičke uloge vojničkih odbrambenih sekreta. J Chem Ecol 26:21–39. https://doi.org/10.1023/A:1005481209579

Rosengaus RB, Schultheis KF, Yalonetskaya A, Bulmer MS, DuComb WS, Benson RW, Thottam JP, Godoy-Carter V (2014) Symbiont izvedene -1,3-glukanaze u društvenom insektu: uzajamnost izvan ishrane . Prednji Microbiol 5:607. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00607

Schuler F, Casida JE (2001) Cilj insekticida u PSST podjedinici kompleksa I. Pest Manag Sci 57:932–940. https://doi.org/10. 1002/ps.364

Seipke RF et al (2011) SinglStreptomycessymbiont proizvodi više antifungalnih sredstava za podršku gljivičnim mravimaAcromyrmex octospinosus. PLOS ONE 6:e22028. https://doi.org/10.1371/journ al.pone.0022028

Shankar K, Mehendale HM (2014) Cytochrome P450. U: Wexler P (ed) Encyclopedia of toxicology. Academic Press, str. 1125–1127 Stroeymeyt N, Grasse AV, Crespi A, Mersch DP, Cremer S, Keller L (2018) Plastičnost društvenih mreža smanjuje prijenos bolesti kod eusocijalnih insekata. Science 362:941–945. https://doi.org/10.1126/ science.aat4793

Sun Q, Haynes KF, Zhou XG (2016) Dinamične promjene u znakovima smrti moduliraju rizike i nagrade od upravljanja leševima kod društvenog insekta. Funct Ecol 31:697–706. https://doi.org/10.1111/1365- 2435.12754

Syazwan SA, Lee SY, Sajap AS, Lau WH, Omar D, Mohamed R (2021) Interakcija izmeđuMetarhizium anisopliaei njegov domaćin, podzemni termitCoptotermes curvignathustokom procesa infekcije. Biologija 10:263. https://doi.org/10.3390/biolo gy10040263

Terrapon N et al (2014) Molekularni tragovi alternativne društvene organizacije u genomu termita. Nat Commun 5:3636. https://doi.org/10. 1038/ncomms4636

Van Meyel S, Körner M, Meunier J (2018) Socijalni imunitet: zašto bismo trebali proučavati njegovu prirodu, evoluciju i funkcije u svim društvenim sistemima. Curr Opin Insect Sci 28:1–7. https://doi.org/10.1016/j. cois.2018.03.004

Verma M, Sharma S, Prasad R (2009) Biološke alternative za kontrolu termita: pregled. Int Biodeter Biodegr 63:959–972. https:// doi.org/10.1016/j.ibiod.2009.05.009

Wang YL, Yang ML, Jiang F, Zhang JZ, Kang L (2013) Razvoj ovisan o mikroRNA otkriven utišavanjem gena posredovanim interferencijom RNALmDicer1u migratornom skakavcu. Insect Sci 20:53–60. https://doi.org/10.1111/j.1744-7917.2012.01542.x

Weber F (2021) Antivirusni urođeni imunitet: uvod. U: Bamford DH, Zuckerman M (ur.) Encyclopedia of virology. Elsevier, str. 577–583 Xu H, Huang QY, Gao YY, Wu J, Hassan A, Liu YT (2021a)IDHKnockdown mijenja ponašanje termita u potrazi za hranomodontocetes formosanusu različitim društvenim kontekstima. Curr Zool 67:609. https:// doi.org/10.1093/cz/zoab032 Xu Z, Zeng X, Li M, Liao J, Chen Q (2021b) MikroRNA-383 promoviše autofagiju izazvanu reaktivnim vrstama kiseonika putem smanjenja peroksiredoksina 3 u ljudskom gliomu U87 ćelije. Exp Ther Med 21:439. https://doi.org/10.3892/etm.2021.9870

Yanagawa A, Fujiwara-Tsujii N, Akino T, Yoshimura T, Yanagawa T, Shimizu S (2011) Mučni miris entomopatogena poboljšava ponašanje termita u prevenciji bolestiCoptotermes formosanus. J Invertebr Pathol 108:1–6. https://doi.org/10.1016/j.jip.2011. 06.001

Yanagawa A, Imai T, Akino T, Toh Y, Yoshimura T (2015) Olfaktivni znakovi patogenih gljiva utječu na smjer kretanja termita,Coptotermes formosanus. J Chem Ecol 41:1118–1126. https://doi.org/10.1007/s10886-015-0649-8

Yang ML et al (2014) MicroRNA-133 inhibira agregaciju u ponašanju kontrolirajući sintezu dopamina kod skakavaca. PLoS Genet 10:e1004206. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004206