Potencijal vakcina baziranih na dendritskim ćelijama za modulaciju populacija urođenih limfoidnih ćelija tipa 3

sažetak:

Vakcine dendritičnih ćelija (DC) su vrsta imunoterapije koja se oslanja na komunikaciju DC sa drugim aspektima imunog sistema. DC su moćne ćelije koje predstavljaju antigen uključene u aktivaciju urođenih imunoloških odgovora i obrazovanje adaptivnog imuniteta, što ih čini idealnim metama za imunoterapije. Urođene limfoidne ćelije (ILC) su relativno novo identifikovane u polju imunologije i imaju važnu ulogu u zdravlju i bolestima. Ovdje opisane studije istraživale su komunikaciju između ILC tipa 3 (ILC3) i DC koristeći mišji model vakcinacije zasnovane na DC. Uočene su lokalne i sistemske promjene u populaciji ILC3 nakon primjene DC vakcine, a nakon izazivanja B16F10 ćelija melanoma, uočene su promjene u populaciji ILC3 u plućima. Interakcije između DC i ILC3 treba dalje istražiti kako bi se utvrdio potencijal koji bi njihova komunikacija mogla imati u zdravlju, bolesti i razvoju imunoterapije.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Ključne riječi:

dendritične ćelije (DC); tip 3 urođene limfoidne ćelije (ILC3); urođeni; komunikacija

1. Uvod

Urođene limfoidne ćelije (ILC) su heterogena grupa leukocita izvedenih iz zajedničkih limfoidnih progenitor ćelija koje imaju ključne funkcije u razvoju tkiva, popravljanju i homeostazi. ILC se povezuju s različitim upalnim bolestima uključujući inflamatornu bolest crijeva, psorijazu, astmu i razne autoimune bolesti [1]. Obično se dijele u tri glavne grupe, tip 1 (ILC1), tip 2 (ILC2) i tip 3 (ILC3), na osnovu ekspresije faktora transkripcije, profila citokina i specifičnih fenotipskih markera [2]. Prirodne ćelije ubice (NK) se ponekad grupišu kao podskup ILC1 zbog njihovih sličnosti; međutim, pokazalo se da NK ćelije imaju različite karakteristike od ILC1 kao što su ekspresija faktora transkripcije i citolitička aktivnost koje ih izdvajaju kao sopstveni podtip ILC [3]. Međutim, mnogi još uvijek smatraju NK ćelije podskupom ILC1 [4]. Zbog sličnih profila citokina, faktora transkripcije i imunoloških funkcija, ILC (NK ćelije, ILC1, ILC2 i ILC3) se smatraju urođenim pandanima komponenti adaptivnog imunološkog sistema koji odražavaju citotoksične T limfocite, Th1, Th2 i Th17 odgovore, respektivno [4]. Međutim, za razliku od T ćelija, njima nedostaju receptori specifični za antigen [5].

DC su urođeni leukociti koji su kritični u indukciji imunoloških odgovora i tolerancije. Imaju receptore za prepoznavanje uzoraka koji prepoznaju molekularne obrasce povezane s patogenom i/ili oštećenjem i najefikasnije su ćelije koje predstavljaju antigen [6]. Kroz prezentaciju antigena i sekreciju citokina, DC-ovi mogu diktirati sudbinu naivnih T ćelija i inducirati proinflamatorne odgovore ili imunosupresiju. T ćelije se mogu educirati da prepoznaju antigen kao opasan i napadnu ga ili kao neopasan i poprime tolerogeni fenotip [6]. DC su također uključeni u aktiviranje urođenog imuniteta kao i edukaciju adaptivnog imuniteta. Direktnim kontaktom ili proizvodnjom različitih citokina i topljivih faktora, DC mogu aktivirati druge urođene leukocite i promovirati urođene imunološke odgovore [7].

Moć DC-a je korištena u imunoterapiji kao što su DC vakcine. DC vakcine se pripremaju izolacijom DC od pacijenta ili izolacijom prekursora DC i izvođenjem DC. Ovim DC-ovima se manipulira ex vivo, što uključuje sazrijevanje DC-a na imunogeni način. DC-ovi su također napunjeni specifičnim antigenima, što će biti ono što će vakcina imati za cilj da razvije imunogene odgovore usmjerene prema [8]. DC vakcine su imunoterapeutska platforma koja koristi prednost sposobnosti DC-a da obrazuju adaptivni imuni sistem da izazove antigen-specifične odgovore, posebno antigen-specifične citotoksične T ćelije. Stoga se većina istraživanja vakcine DC fokusirala na kapacitet DC-a da obrazuju adaptivni imunološki sistem. Međutim, posljednjih godina pokazalo se da odnos između DC i NK stanica ima snažan utjecaj na antitumorski imunitet što je ključno za efikasnost DC vakcinacije [9–11]. Ovo pokazuje važnu potrebu da se istraže drugi odnosi između DC-a i različitih urođenih leukocita i utjecaja koji ova komunikacija može imati na efikasnost DC vakcina. Budući da su NK ćelije dio porodice ILC i zbog bliske sličnosti ILC sa T ćelijama [5], cilj ovdje predstavljenih studija bio je istražiti potencijalnu vezu između DC i drugog člana porodice ILC, ILC3. Koristili smo platformu za DC (moDC) vakcinu izvedenu iz monocita gdje su DC generirani ex vivo iz stanica prekursora mišje koštane srži. MoDC vakcine su najčešći oblik DC vakcina jer ih je, istorijski gledano, bilo najlakše proizvesti [12].

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ILC3 imaju važne funkcije u crijevnoj homeostazi, imunitetu protiv ekstracelularnih bakterija i razvoju limfoidnog tkiva [5]. ILC3 se mogu podijeliti u grupe koje se razlikuju po ekspresiji površinskih markera i proizvodnji citokina. Međutim, svi ILC3 izražavaju ROR t [13]. Jedna podgrupa ILC3 je ILC3-ćelije induktora limfoidnog tkiva koje su važne u organogenezi [14]. ILC3 se takođe mogu podeliti na osnovu ekspresije prirodnog receptora citotoksičnosti (NCR), što je kod miševa ekspresija NKp46 [15,16], a kod ljudi je to NKp44 [17,18]. Dakle, postoje NCR+ i NCR-ILC3 koji se razlikuju u svojim funkcionalnim kapacitetima i fenotipskim karakteristikama. Na primjer, sugerirano je da NCR+ ILC3 proizvode IL-22 ali ne IL-17, dok NCR- ILC3 mogu proizvoditi oba citokina [19]. Međutim, u nedavnoj studiji Fiancette et al., pokazalo se da NCR+ ILC3 mogu proizvesti nisku količinu IL-17 [20]. Rankin et al. pokazao kod miševa da NCR+ ILC3 zahtijevaju transkripcijski faktor T-bet. Stoga se NCR+/− ILC3 mogu razlikovati na osnovu NKp46 i T-bet ekspresije. U studijama opisanim ovdje, mišji ILC3 su definirani linijom-CD45+DX5-ROR t +, pri čemu su NCR+ ILC3 također T-bet+NKp46+, a NCR-ILC3 su T-bet-NKp46 − (Tabela 1 i Dodatak A, slike A1–A3).

Tabela 1. ILC3 podskupovi definisani analizom protočne citometrije.

Cilj ovog istraživanja bio je pomoći da se razjasni postoji li komunikacija između DC vakcina i ILC3 i potencijala koje bi njihove interakcije mogle imati u DC imunoterapiji. Pokazalo se da ILC3 imaju ulogu u raznim bolestima i kancerima i stoga imaju potencijal u različitim kontekstima imunoterapije. ILC3 su relativno novi na sceni imunologije i kao rezultat toga, njihov utjecaj na bolesti i tretmane je ograničeno istražen. ILC3 reaguju na vanjske podražaje, koji će diktirati njihove aktivnosti i da li promoviraju progresiju ili supresiju tumora [21,22]. Slično Th17 ćelijama, ILC3 imaju faktor transkripcije ROR t i proizvode Th17 odgovor citokine kao što su IL-17 i IL-22. IL-22 je važan za kontrolu bakterijskih infekcija u crijevima [16]. Međutim, u modelu raka debelog crijeva izazvanog bakterijama, pokazano je da IL-17 i IL-22 iz ILC-a u debelom crijevu doprinose razvoju raka debelog crijeva [23]. Nadalje, ILC3 su u korelaciji s negativnim ishodima karcinoma dojke [24]. Suprotno tome, uočena je povezanost između NCR+ ILC3 i tercijarnih limfoidnih struktura (TLS) i bolji klinički ishodi kod karcinoma pluća ne-malih ćelija [18]. Pored toga, nedavna studija je istraživala ILC3 kod kolorektalnog karcinoma. Studija je uočila povećanje ILC1 i smanjenje ILC3 u uzorcima pacijenata sa reseciranim kolorektalnim tumorima u poređenju sa odgovarajućim nemalignim susjednim tkivima. RNK sekvenciranje i transkripciono profilisanje otkrili su da ILC3 imaju povećanu plastičnost i različite funkcionalne kapacitete unutar kolorektalnih tumora u poređenju sa nemalignim tkivima. Zanimljivo, sekvenciranje RNK također je sugeriralo da ILC3 koji infiltriraju tumor imaju povećanu plastičnost kako bi se prebacili na ILC1 fenotip. Studija je uočila da interakcije ILC3 sa T ćelijama podržavaju imunitet tipa I, a kod kolorektalnog karcinoma ove interakcije su ograničene, što ometa antitumorske odgovore. Ovo podržava važnu funkciju ILC3 u antitumorskom imunitetu. Sve u svemu, rad je pokazao značajnu ulogu koju ILC3 imaju u regulaciji imunološke homeostaze i kolorektalnog karcinoma [25]. Stoga se smatra da ILC3 imaju dvostruku ulogu u zdravlju i bolesti. Oni mogu promovirati progresiju raka [23,24,26], ali također mogu doprinijeti antitumorskim odgovorima [18,25,27,28]. Čini se da su njihov fenotip i doprinos raku kontekstualni, što ukazuje na potencijal za manipuliranje ILC3 putem imunoterapije kako bi se dobio fenotip koji pomaže u odgovorima protiv raka, a ne podržava progresiju tumora. Dakle, vakcine zasnovane na DC predstavljaju moguću metodu uticaja na mikrookruženje tumora kroz manipulaciju fenotipovima ILC i njihovom proizvodnjom citokina, što bi omogućilo prilagođavanje imunološkog odgovora u zavisnosti od okolnosti i moglo bi biti korisno u istraživanju raka.

Budući da je bilo ograničeno istraživanje komunikacije između DC i ILC3, posebno u kontekstu DC vakcinacije, ovdje opisane studije istraživale su promjene u populaciji ILC3 nakon primjene vakcine zasnovane na DC miševima. U ovom radu je uočena komunikacija između vakcine zasnovane na DC i ILC3, što se pokazalo kroz trajni uticaj vakcine na ILC3 odgovore tokom najmanje 10 dana nakon imunizacije.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

2. Rezultati

2.1. Broj i NCR+ i NCR− ILC3 se povećao u lokalnom drenirajućem limfnom čvoru nakon primjene DC vakcina 

DC vakcina je pripremljena diferenciranjem DC od ćelija dobijenih iz mišje koštane srži ex vivo. Ovi DC-ovi su stimulirani da promoviraju njihovo sazrijevanje kako bi stekli imunogeni fenotip. DC-ovi su zatim napunjeni peptidom. Budući da se ova studija fokusira na prirodu komunikacije između dva urođena leukocita, DC-a i ILC3-a, peptid odabran za proizvodnju vakcine bio je namjerno irelevantan za naš biološki model kako bi se izbjeglo da antigen-specifične T ćelije postanu zbunjujuća varijabla. Prema tome, DC vakcina je bila napunjena peptidom dobijenim iz pilećeg jajnog buta.

Da bismo započeli istraživanje da li DC vakcinacija utječe na ILC3 populaciju, prvo smo procijenili da li postoje razlike u celularnosti proksimalno od mjesta vakcinacije. Došlo je do promjena u lokalnom drenirajućem limfnom čvoru nakon DC vakcinacije, što je uključivalo povećanje broja ILC3 (Slika 1). Kinetika povećanja ILC3 je pokazala da se ILC3 postepeno povećavao nakon vakcinacije DC (Slika 1b,c). Procijenjen je broj NCR+ i NCR− ILC3 u lokalnom drenirajućem limfnom čvoru i obje subpopulacije su se povećale nakon primjene DC vakcine. Iako su i NCR+ i NCR− ILC3 populacije dostigle vrhunac tri dana nakon DC vakcinacije, NCR- ILC3 su se vratile na homeostatski broj sedam dana nakon imunizacije, dok je broj NCR+ ILC3 ostao značajno veći u poređenju sa lažno tretiranim kontrolnim miševima.

Slika 1. Broj prirodnih receptora citotoksičnosti (NCR)+ i NCR− tip 3 urođenih limfoidnih ćelija (ILC3) porastao je u lokalnom drenirajućem limfnom čvoru nakon DC imunizacije. Ženke miševa C57BL/6 inokulirane su DC vakcinama putem injekcija stražnjeg stopala. Poplitealni limfni čvorovi su pregledani za ILC3 populacije. (a) Određen je ukupan broj ćelija u limfnom čvoru. Akumulacija (b) NCR− ILC3 i (c) NCR+ ILC3 u limfnom čvoru i procenat CD{{10}} ćelija u limfnom čvoru koji su bili (d) NCR− ILC3 i (e) NCR+ ILC3s. Svaka traka predstavlja podatke iz četiri poplitealna limfna čvora. Studentov t-test je korišten u svakoj vremenskoj tački za određivanje značajnih razlika između kontrolnih miševa inokuliranih s fosfatnim puferom (PBS) i miševa inokuliranih DC vakcinom (p-vrijednosti * < 0.{{ 21}}5, ** < 0.005, *** < 0,0005 i **** < 0,0001). Reprezentativni tačkasti grafikoni koji pokazuju prosečan broj (f) NCR- ILC3 i (g) NCR+ ILC3 u drenirajućem poplitealnom limfnom čvoru. Grafikoni prikazuju srednju vrednost sa standardnom devijacijom.

2.2. DC vakcine su povećale proizvodnju ILC3 citokina u slezeni bez promjene ukupnog broja ILC3 slezene

Zatim su ispitivane sistemske promjene u populaciji ILC3 procjenom slezine, koja je najveći sekundarni limfoidni organ [29], tjedan dana nakon DC vakcinacije, što je standardna vremenska tačka naše laboratorije za sistemsku evaluaciju promjena u leukocitima. Nije uočena značajna razlika u ukupnom broju NCR+ ili NCR− ILC3 u slezeni (Slika 2).

Slika 2. Nije bilo promjena u broju ILC3 slezene nakon DC imunizacije. Ženke C57BL/6 miševa (n=8 [PBS] ili 10 [DC]) inokulirane su DC vakcinama putem injekcija stražnjeg podnožja. Slezine su sakupljene nedelju dana nakon inokulacije i ispitane na ILC3 populacije. Ukupan broj slezene (a) NCR− ILC3 i (b) NCR+ ILC3 (i geometrijski srednji fluorescentni intenzitet T-bet za NCR+ ILC3) i procenat CD45+ ćelija slezene koje su bile (c) NCR− ILC3 i (d) NCR+ ILC3 su praćeni i kvantifikovani analizom protočne citometrije. Studentov t-test je korišten za određivanje značajnosti između populacija kontrolnih miševa inokuliranih fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) i miševa inokuliranih DC. Sredstva se nisu bitno razlikovala. Reprezentativni tačkasti grafikoni koji pokazuju prosečan broj slezene (e) NCR− ILC3 i NCR+ ILC3. Standardna devijacija i srednja vrijednost predstavljeni su trakama grafikona i trakama greške.

Budući da na ILC3 citokinske profile mogu uticati faktori okoline, ILC3 proizvodnja IL-22 i IL-17 u slezeni je izmjerena jednu sedmicu nakon DC vakcinacije. Došlo je do povećanja ILC3 koji proizvode IL-17 ili IL-22 ili oba citokina kod miševa tretiranih DC vakcinama u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 3).

Slika 3. Došlo je do povećanja ILC3 slezene koji proizvode IL-17 i IL-22 nakon DC imunizacije. Ženke C57BL/6 miševa (n=12-18) inokulirane su DC vakcinama putem injekcije stražnjeg jastučića. Kontrolni miševi su tretirani fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS). Sedmicu nakon imunizacije, slezine su sakupljene i pregledane na ILC koje proizvode IL-17- i IL{{1{19}}}}. Broj linija-CD127+DX5− ćelija koje proizvode (a) IL-17, (b) IL-22 i (c) i IL-17 i IL{{ 16}} i odgovarajući geometrijski srednji fluorescentni intenziteti određeni su korištenjem intracelularnog bojenja citokina i protočne citometrije. Podaci su analizirani korištenjem dvosmjernog ANOVA testa (p-vrijednosti * < 0.05, ** < 0.005). (d) Reprezentativni tačkasti grafikoni pokazuju prosječan broj CD45+ linija slezene-CD127+DX5− ćelija koje proizvode IL-17 i/ili IL-22. Grafikoni prikazuju srednju vrednost sa standardnom devijacijom.

2.3. ILC3 subpopulacije nakon DC imunizacije i izazova sa B16F10 ćelijama melanoma

ILC3 mogu igrati dvostruku ulogu u progresiji raka doprinoseći i pro- i antitumogenim odgovorima [22]. Stoga je istražen utjecaj DC vakcinacije na ILC3 odgovore u kontekstu raka. Miševi su tretirani DC vakcinama i nedelju dana kasnije, oni su intravenozno izazvani ćelijama melanoma B16F10, što je rezultiralo zasejavanjem pluća. Kao što je spomenuto, budući da su se procjenjivale samo komponente urođenog imuniteta, antigen-specifična edukacija vakcine nije se procjenjivala u našim eksperimentima i, stoga, korišteni model melanoma nije eksprimirao ovalbumin, zbog čega je peptid napunjen na DC-ove. nebitno. Kinetički eksperiment (slika 1) pokazao je da se lokalni odgovori ILC3 mogu uočiti u roku od tri dana. Stoga je, tri dana nakon izazivanja, ispitan broj ILC3 subpopulacija i njihova sposobnost da proizvode citokine u slezeni i plućima. Slično onome što je uočeno u slezeni naivnih miševa, nije bilo značajne razlike u ukupnom broju NCR+ i NCR- ILC3 slezene između kontrolne grupe i grupe imunizovane DC (Slika 4). Međutim, za razliku od naivnog modela, u slezeni više nije bilo promjena u proizvodnji IL-17 i/ili IL-22 (Slika 5).

Slika 4. Nije bilo promjene u ukupnom broju ILC3 slezene nakon DC vakcinacije i izazivanja B16F10 ćelija melanoma. Ženke C57BL/6 miševa (n=10) su inokulirane DC vakcinama putem injekcije stražnjeg podnožja, a tjedan dana kasnije, miševima je primijenjeno 3 × 105 B16F10 ćelija putem injekcije u repnu venu. Slezene su sakupljene i ispitane na akumulaciju ILC3 populacija tri dana nakon primjene B16F10. Broj (a) NCR− ILC3 slezene i (b) NCR+ ILC3 (i geometrijski srednji fluorescentni intenzitet T-bet za NCR+ ILC3) i procenat CD45+ ćelija slezene koje su bile (c) NCR− ILC3 i (d) NCR+ ILC3 su praćeni i kvantifikovani protočnom citometrijom. Studentov t-test je korišten za određivanje značajnosti između populacija kontrolnih miševa tretiranih fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom (PBS) i miševa inokuliranih DC. Sredstva se nisu bitno razlikovala. Reprezentativni tačkasti grafikoni pokazuju prosečan broj slezene (e) NCR− ILC3 i NCR+ ILC3. Srednja vrijednost i standardna devijacija predstavljeni su trakastim grafikonima i greškama.

Slika 5. Nije bilo promjene u broju slezene IL-17 i/ili IL-22-koji proizvode ILC nakon DC vakcinacije i izazivanja B16F10 ćelija melanoma. Ženke C57BL/6 miševa (n=10) su inokulirane DC vakcinama putem injekcije stražnjeg podnožja i jednu sedmicu kasnije, 3 × 105 B16F10 ćelija je dato intravenozno. Tri dana kasnije, slezine su sakupljene i ispitane na proizvodnju ILC3 citokina. Broj CD127+DX5- ćelija koje proizvode (a) IL-17, (b) IL-22 i (c) i IL-17 i IL-22 i njihovi odgovarajući geometrijski srednji fluorescentni intenziteti određeni su korištenjem intracelularnog bojenja citokina i protočne citometrije. Podaci su analizirani korištenjem dvosmjernog ANOVA testa i nije otkrivena značajna razlika između DC vakcinisanih miševa i kontrola tretiranih fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom (PBS). (d) Reprezentativni tačkasti grafikoni pokazuju prosječan broj CD45+loze CD127+DX5- ćelija slezene koje proizvode IL-17 i/ili IL-22.

Intravenska injekcija B16F10 ćelija preko repne vene je uobičajen mišji model metastaza sintetičkog melanoma u plućima [30]. Stoga su pluća također ispitana kako bi se odredio broj ILC3 subpopulacija i procijenila njihova proizvodnja citokina.

Došlo je do smanjenja broja NCR- ILC3 sa istovremenim povećanjem broja NCR+ ILC3 (Slika 6). Međutim, nije uočen efekat DC vakcinacije na ILC3-posredovanu proizvodnju citokina u plućima (Slika 7).

Slika 6. Nakon DC imunizacije i izazova sa B16F10 ćelijama, došlo je do numeričkih promjena u ILC3 subpopulacijama u plućima. Ženke C57BL/6 miševa (n=10) primile su DC vakcine putem injekcije stražnjeg podnožja, a tjedan dana kasnije, 3 × 105 B16F10 ćelija je primijenjeno intravenozno. Tri dana nakon izazivanja, pluća su pregledana pomoću protočne citometrije na broj (a) NCR− ILC3 i (b) NCR+ ILC3 (i geometrijski srednji intenzitet fluorescentnog T-bet za NCR+ ILC3) i procenat CD{ {18}} ćelije koje su bile (c) NCR− ILC3 i (d) NCR+ ILC3. Studentov t-test je korišten za određivanje značajnosti između subpopulacija kontrolnih miševa tretiranih slanom otopinom fosfatnog pufera (PBS) i miševa inokuliranih DC (p-vrijednosti *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Slika 7.Nije bilo promjene u broju ILC3 koji proizvode IL-17 i/ili IL-22 u plućima nakon DC vakcinacije i izazivanja B16F10 ćelija melanoma. Ženke C57BL/6 miševa (n=10) su inokulirane DC vakcinama putem injekcije stražnjeg podnožja i jednu sedmicu kasnije, intravenozno im je primijenjeno 3 × 105 B16F10 ćelija. Tri dana kasnije, pluća su sakupljena i ispitana na ILC{12}posredovanu proizvodnju citokina. Broj ćelija linije-CD127+DX5− koje proizvode (a) IL-17, (b) IL-22 i (c) i IL{{0}} i IL-22 i njihovi odgovarajući geometrijski srednji fluorescentni intenziteti određeni su korištenjem intracelularnog bojenja citokina i protočne citometrije. Podaci su analizirani pomoću dvosmjernog ANOVA testa (p-vrijednosti *** < 0,0005). Nije bilo značajne razlike u ukupnom broju IL-22-proizvodnje, IL-17-proizvodnje i IL-22 i IL-17 multi-citokina loze-CD{{ 12}}DX5− ćelije. (d) Reprezentativni tačkasti grafikoni koji pokazuju prosječan broj plućnih CD45+ loza-CD127+DX5- ćelija koje proizvode IL-17 i/ili IL-22. Standardna devijacija i srednja vrijednost predstavljeni su trakama grafikona i trakama greške.

3. Diskusija

Ovdje opisane studije nastojale su istražiti potencijalnu komunikaciju između ILC3 i DC u kontekstu DC vakcine. Došlo je do povećanja broja i NCR+ i NCR- ILC3 subpopulacija u drenirajućim limfnim čvorovima (Slika 1) nakon vakcinacije DC, što je sugeriralo da se lokalna komunikacija odvijala između DC vakcine i ILC3 subpopulacija. Međutim, komunikacija između DC-a i NCR+ ILC3 imala je dugotrajniji utjecaj na ukupan broj NCR+ ILC3 od one uočene između DC-a i NCR- ILC3. Ovo je pokazalo da DC-ovi mogu imati jedinstvene interakcije sa ILC3-ima u zavisnosti od njihove ekspresije NCR-a. Nije uočena promjena u broju ILC3 subpopulacija u slezeni sedam dana nakon vakcinacije DC (Slika 2) ili deset dana nakon vakcinacije DC i tri dana nakon izazivanja ćelija melanoma B16F10 (Slika 4). Naše metode za ispitivanje ILC3 za njihovu proizvodnju IL-17 i IL-22 imaju ograničenje jer pokazuju i translacijski i transkripcijski odgovor zbog in vitro restimulacije ćelija. Međutim, dodali smo eksperimentalnu kontrolu u sve eksperimente, što bi bio tretman bez stimulacije in vitro da bi se otkrilo šta ILC3 proizvode kao odgovor na signal primljen in vivo. Kao što je ilustrovano na slikama 3d, 5d i 7d, ćelije koje nisu primile in vitro stimulaciju proizvele su IL-17 i IL-22. Osim toga, iako se broj ILC3 ćelija slezene nije promijenio (Slika 2), proizvodnja citokina od strane ILC3 subpopulacija bila je različita sedam dana nakon DC vakcinacije (Slika 3). Ovo sugerira da bi DC vakcinacija mogla utjecati na funkcionalnost ILC3 odgovora bez utjecaja na njih brojčano. Budući da su komponente urođenog imunološkog sistema, trgovina ILC3 u i van tkiva mogla se dogoditi u rasponu od nekoliko dana, čime se sprečava otkrivanje brojčanih razlika moduliranih tretmanom sedam do deset dana nakon DC vakcinacije. Dokaz za to je uočen u limfnom čvoru koji drenira DC vakcinu, gdje se broj ILC3 povećao tokom tri dana, a zatim počeo opadati (Slika 1). Dakle, možda je došlo do numeričkih promjena u ILC3 subpopulacijama u slezeni koje su propuštene jer su se vratile na homeostatske brojeve do sedmog dana nakon DC imunizacije. Ipak, studije su bile fokusirane na dugotrajnije odgovore za razliku od kratkoročnih prolaznih odgovora i, stoga, nisu dalje istraživale ovaj put. Zanimljivo, iako se broj subpopulacija ILC3 slezene nije razlikovao od kontrolnih grupa, njihovi citokinski profili su izmijenjeni (Slika 3). Proizvodnja IL-22 i IL-17 je povećana u ILC3 slezene, pokazujući na taj način da vakcinacija DC ima sistemski efekat na ILC3. Ukratko, DC vakcinacija nije utjecala na količinu ILC3 slezene, ali je utjecala na njihovu funkcionalnost.

Iako je postojao trajni efekat na proizvodnju citokina izvedenih iz ILC3- sedam dana nakon DC imunizacije u slezeni miševa bez tumora, ovaj uticaj na ILC3 u slezeni nije bio detektovan tri dana nakon intravenske infekcije sa B16F10 ćelijama melanoma ( Slika 5). Činilo se da DC vakcina prima ILC3 populacije u modelu bez tumora koji je potisnut nakon izazivanja tumora. Budući da su ILC pod velikim utjecajem njihovog okruženja, to bi moglo sugerirati da je komunikacija između DC u vakcini i ILC3 ograničena na model bez tumora. Suprotno tome, ovo bi takođe moglo biti zbog mobilizacije pripremljenih ILC3 na druge lokacije u tijelu gdje su se B16F10 možda skupile i uspostavile mikrookruženje koje je izazvalo regrutaciju leukocita.

Uočen je pomak u ILC3 subpopulacijama u plućima deset dana nakon DC vakcinacije i tri dana nakon izazivanja ćelija B16F10 u poređenju sa kontrolnim miševima koji nisu vakcinisani DC koji su primili samo B16F10 ćelije. Konkretno, došlo je do povećanja broja NCR+ ILC3 i smanjenja NCR- ILC3 u plućima (Slika 6). T-bet je faktor transkripcije koji je povezan sa Th1 odgovorima [31]. Stoga, povećanje NCR+ ILC3, koji izražavaju T-bet, ukazuje na potencijalnu promociju imuniteta tipa 1. Ovo bi mogao biti koristan ILC3 odgovor u kontekstu raka gdje su imuni odgovori tipa 1 obično poželjni.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Pokazano je da NCR+ ILC3 mogu proizaći iz podskupa NCR- ILC3 [16]. Stoga se povećanje NCR+ ILC3 i smanjenje NCR- ILC3 može pripisati stimulaciji koja je izazvala promjenu u NCR- ILC3 da postanu NCR+ ILC3. Ako su ILC3 bili podvrgnuti prebacivanju fenotipa sa NCR- na NCR+, možda nisu bili u stanju da proizvode citokine tokom ili ubrzo nakon prebacivanja i dok su se prilagođavali okruženju i svom novom fenotipu. Stoga je njihova proizvodnja citokina mogla biti zaustavljena ili odgođena dok se dešavala promjena fenotipa, što bi moglo objasniti zašto nije bilo promjena u ILC3-posredovanoj proizvodnji IL-17 i/ili IL-22 u pluća (slika 7). Međutim, također je moguće da DC vakcinacija jednostavno nije utjecala na proizvodnju citokina od strane ILC3 u plućima u ovom trenutku.

4. Materijali i metode

Etičko odobrenje

Sve studije na miševima izvedene su prema protokolu o korištenju životinja #3807 pod nadzorom osoblja za brigu o životinjama na Univerzitetu Guelph.

Miševi

Ženke C57BL6 miševa su primljene iz Charles River Laboratories u dobi od pet do osam sedmica. Miševi su smešteni u kontrolisanom okruženju u jedinici za izolaciju životinja Univerziteta Guelph i dali su im nedelju dana da se aklimatizuju pre početka eksperimenata. Miševi su hranjeni i davana im je voda ad libitum.

Kulture dendritičkih ćelija

Sakupljeni su butne kosti i tibije ženki miševa C57BL6 i odsječeni krajevi kostiju. Pomoću šprica, koštana srž tibije i femura je isprana PBS-om u Petrijevu posudu. Koštana srž je resuspendirana u jednoćelijsku suspenziju i izbrojana je pomoću hemocitometra. Ćelije su zatim resuspendirane u mediju (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] sa 2-merkaptoetanolom [Gibco Ref# 21985-023], 1% penicilina/streptomicina [HyClone Cat# SV30010] i 10% fetalni goveđi serum [VWR Cat#97068-085]) do koncentracije od 1,25 × 106 ćelija po mL, dopunjen sa 20 ng/mL faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF) (Biolegend Cat#576308) i alikvoti u tikvice za kulturu od 25 cm2, 5 mL po boci. Kulture su stavljene u vlažne inkubatore na 37 ◦C sa 5% CO2 i ostavljene da rastu 7 dana. Drugog dana kulture dodano je 5 mL svježe podloge sa 20 ng/mL GM-CSF. Petog dana, 5 mL svake kulture je centrifugirano, a supernatant je uklonjen. Ćelije su resuspendirane u 5 mL svježe podloge sa 20 ng/mL GM-CSF i ponovo dodane u boce za kulturu. Kulture su sakupljene 7. dana i pripremljene za vakcinaciju.

Priprema za vakcinaciju dendritskih ćelija

Kulture dendritskih ćelija (DC) prebačene su u konusnu epruvetu od 50 mL i izbrojane pomoću hemocitometra. Ćelije su stimulirane sa 100 ng/mL lipopolisaharida (LPS) iz Escherichia coli O55:B5 (Sigma Cat#L2880) i 1 µg/mL pilećeg ovalbumina (OVA)257–264(SIIN) (PepScan Systems, Nizozemska), Lely 1 h u inkubatoru na 37 ◦C sa 5% CO2. Ćelije su zatim tri puta isprane PBS-om i resuspendirane do koncentracije od 5 × 105 ćelija po 30 µL. Vakcine su davane u dozama od 5 × 105 ćelija po 30 µL PBS.

Obrada tkiva

Limfni čvorovi i slezena su sakupljeni i stavljeni u Petrijeve posude sa 2 mL Hanksovog puferovanog fiziološkog rastvora (HBSS). Presovane su u jednoćelijske suspenzije koristeći stražnju stranu čepa šprica od 3 mL. Jednoćelijske suspenzije su filtrirane u konusnu epruvetu od 50 mL koristeći sito za ćelije veličine 70 µm. Limfni čvorovi su izbrojani pomoću hemocitometra. Slezene su centrifugirane, supernatant je uklonjen, a ćelije su resuspendirane u ACK puferu za lizu (8,29 g NH4Cl [0.15 M], 1 g KHCO3 [10,0 mM], 37,2 mg Na2EDTA [0,1 mM] u 1 mL Milli Q vode) i ostaviti da odstoji pet minuta kako bi se eritrociti lizirali. Ćelije su dva puta isprane sa HBSS prije nego što su resuspendirane u mediju i izbrojane pomoću hemocitometra.

Pluća su sakupljena i izmjerena prije nego što su stavljena u nježnu MACSTM epruvetu koja sadrži 1 mg/mL kolagenaze IV (Gibco Ref#17104-019) i 5 µg/mL DNase I (Roche Ref#11284932001) u HBSS. Koristeći gentleMACSTM disocijator, uzorci su prošli kroz plućni protokol A i zatim inkubirali 20 minuta u inkubatoru na 37 ◦C sa 5% CO2. Uzorci su zatim prošli kroz plućni protokol B na gentleMACSTM disocijatoru. Uzorcima je dodan duplo veći volumen uzorka HBSS da bi se neutralizirala enzimska reakcija. Uzorci su filtrirani u konusnu epruvetu od 50 mL kroz ćelijsko cjedilo veličine 70 µm. Ćelije su zatim dva puta isprane sa HBSS i resuspendovane u ACK puferu za lizu. Nakon pet minuta u puferu za lizu ACK, ćelije su dva puta isprane sa HBSS i resuspendovane u medijumu.

Cytokine Response Assay

Jednoćelijske suspenzije iz uzoraka tkiva zasijane su u 96- ploče sa jažicama u duplikatima, pri čemu je jedna jažica tretirana kao kontrola bez stimulacije, a druga dobro je primila stimulativni tretman. Nestimulisanim bunarčićima dat je samo medij, a jažice tretirane stimulansom su primile 10 ng/mL forbol miristat acetata (PMA) i 1500 ng/mL jonomicina u mediju. Ćelije su stavljene u inkubator na 37 ◦C sa 5% CO2 na jedan sat. Zatim je Brefeldin A (GolgiPlug, Biolegend Cat#420601) (x100 razrjeđenje) dodat u sve jažice za uzorke, a ploča je vraćena u inkubator na dodatna četiri sata. Ćelije su zatim dva puta isprane sa PBS i obojene za analizu protočnom citometrijom.

B16F10 ćelije melanoma

B16F10 ćelije su odmrznute iz tečnog azota i izbrojane pomoću hemocitometra. Ćelije su zatim resuspendirane u mediju (Dulbecco visokom glukozom modifikovani Eagles medijum [HyClone Cat#SH3002201] sa 1% penicilina/streptomicina [HyClone Cat# SV30010] i 10% goveđeg seruma [VWR} Cat]{6) koncentracija od 1 × 105 ćelija po mL. Ćelije B16F10 su zatim raspoređene u tikvice za kulturu i stavljene u inkubator na 37 ◦C sa 5% CO2. Da bi se ćelije B16F10 pripremile za davanje, ćelije su prebačene iz tikvica za kulturu u konusnu epruvetu od 50 mL, isprane sa PBS, a zatim resuspendovane u PBS. Ćelije su izbrojane pomoću hemocitometra i resuspendirane u PBS da bi se dobile doze od 3 × 105 ćelija po 200 µL.

Bojenje intracelularnim citokinskim antitijelima

Ćelije su posađene u {{0}} ploče i resuspendirane u Fc bloku (anti-CD16/CD32, BioLegend Cat#101320) i inkubirane na 4 ◦C 15 min. Ćelije su dva puta isprane sa fosfatnim puferom koji sadrži 0,5% goveđeg serumskog albumina (FACS pufer), zatim ponovo suspendovane u glavnoj mešavini antitela za bojenje površine ćelije (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46, BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311) i inkubirao na 4 stepena 20 min. Ćelije su dva puta isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom i resuspendovane u Zombie Aqua Fixable vibilitetnoj boji (FVD) (BioLegend Cat#423101) i inkubirane na 4 ◦C 30 min. Slani rastvor sa fosfatnim puferom korišćen je za pranje ćelija dva puta pre resuspenzije u puferu za fiksaciju (BioLegend Cat#420801). Ćelije su inkubirane na 4 ◦C 20 min. Nakon fiksacije, ćelije su dva puta isprane puferom za permeabilizaciju (BioLegend Cat#421002). Ćelije su resuspendirane u glavnoj mješavini intracelularnih antitijela (IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81) i inkubirane na 4 ◦C za 20 min. Ćelije su dva puta isprane puferom za permeabilizaciju, zatim resuspendirane u FACs puferu, a zatim obrađene protočnim citometrom BD FACSCantoTM II i analizirane korištenjem softvera BD FACSDivaTM.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Bojenje antitijela na faktor transkripcije

Ćelije su posađene u {{0}} ploče i resuspendirane u FC bloku (anti-CD16/CD32 BioLegend Cat# 101320) i inkubirane na 4 ◦C 15 min. Ćelije su dva puta isprane sa FACs puferom (0,5% u albuminu goveđeg seruma [HyClone Cat# SH30574.02] u PBS), zatim ponovo suspendovane u glavnoj mešavini antitela za bojenje ćelijske površine (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46 , BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311), i inkubirao na 4 ◦C 20 min. Ćelije su zatim isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom, dva puta resuspendovanim u FVD (BioLegend Cat#423101) i inkubirane na 4 ◦C 20 min. Ćelije su dva puta isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom i resuspendovane u puferu za fiksaciju FoxP3 miša (BD Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124) i inkubirane na 4 ◦C 30 min. Nakon fiksacije, ćelije su isprane puferom za permeabilizaciju FoxP3 miša (BD Pharmingen BD Sciences Cat# 51-9006125) resuspendiranim u puferu za permeabilizaciju FoxP3 i inkubirane na 37 ◦C 30 min. Ćelije su resuspendirane u antitijelima faktora transkripcije (ROR gama(t), eBioscience Cat#17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat# 12-5825-82) i inkubirane na 4 ◦C 20 min. Ćelije su dva puta isprane puferom za permeabilizaciju, zatim resuspendovane u FACs puferu i analizirane pomoću protočnog citometra BD FACSCantoTM II i softvera BD FACSDivaTM.

Statistička analiza

Slezena i plućna populacija NCR+ i NCR− ILC3 su analizirane korišćenjem neparnih t-testova. Analiza populacije kinetičkog eksperimenta upoređena je upotrebom uobičajene jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) i Tukeyjevog testa višestrukog poređenja. Analiza citokina u slezeni i plućima je ispitana korištenjem dvosmjerne ANOVA i Šidákovog testa višestrukih poređenja. Srednje vrijednosti za tretirane grupe definirane su kao značajno različite sa p-vrijednošću < 0.05.

Strategija ulaza

Prvo, korišćenjem područja raspršenja prema naprijed (FSC-A) i područja bočnog raspršenja (SSC-A), limfociti su bili zatvoreni. Zatim su duple ćelije isključene pomoću FSC-A i FSC-visine (FSC-H). Žive ćelije su zatvorene uzimanjem ćelija negativnih na FVD. Zatim, CD127+ i koktel ćelije su uzete kako bi se suzile ILC-ove. CD45+ ćelije su tada uključene. Da bi se osiguralo da su sve NK ćelije isključene, DX5− je tada bio uključen. Za identifikaciju faktora transkripcije ILC3, ROR t + ćelije su zatim uključene, a od ovih ćelija, NCR+ ILC3 su bili T-bet+ i NKp46+, a NCR− ILC3 su bili T-bet− i NKp46. Za identifikaciju citokina, nakon gajtanja na limfocitima, pojedinačne ćelije, žive ćelije i CD127+ loza-CD45+, IL-17 i IL-22 su zatim uvedene kao koje proizvode ILC3 jer bi ILC3 bile jedine ćelije u ovoj konačnoj kapiji koje bi mogle proizvoditi IL-22 i IL-17.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

5. Zaključci

Iako je povećana proizvodnja ILC3-izvedenih IL-17 i IL-22 u slezeni uočena u modelu bez tumora izgubljena u modelu izazivanja tumora, došlo je do suprotnog pomaka u NCR+ i NCR− ILC3 populacije u plućima. Ovo sugerira da je DC vakcinacija mogla utjecati na ILC3 u modelu izazivanja tumora, kao i kod miševa bez tumora. Međutim, efekat ovog odnosa između DC u vakcini i ILC3 na antitumorske odgovore ostaje nepoznat i predstavlja budući pravac istraživanja. Stoga, ovdje opisane studije pokazuju da postoji komunikacija između vakcina baziranih na DC i ILC3 subpopulacija, kako kod miševa bez tumora tako i kod miševa koji nose tumor. Čini se da su ove komunikacije i njihov naknadni utjecaj na imunološki odgovor složeni. Ova zapažanja doprinose literaturi koja nastoji dešifrirati odnos između DC vakcina i ILC3 u nastojanju da se razviju poboljšane strategije DC vakcinacije. Preporučujemo dalje studije koje istražuju potencijal za dizajniranje strategija vakcinacije koje mogu modulirati ove komunikacije kako bi se optimizirali ILC3 odgovori kako bi se pomoglo u antitumorskim odgovorima i ograničilo podršku protumorskih odgovora.

Reference

1. Crinier, A.; Vivier, E.; Bléry, M. Urođene limfoidne ćelije slične pomagačima i imunoterapija raka. Semin. Immunol. 2019, 41, 101274. [CrossRef] [PubMed]

2. Salimi, M.; Wang, R.; Yao, X.; Li, X.; Wang, X.; Hu, Y.; Chang, X.; Fan, P.; Dong, T.; Ogg, G. Aktivirane urođene populacije limfoidnih ćelija akumuliraju se u ljudskim tumorskim tkivima. BMC Cancer 2018, 18, 341. [CrossRef] [PubMed]

3. Spits, H.; Bernink, JH; Lanier, L. NK ćelije i urođene limfoidne ćelije tipa 1: Partneri u odbrani domaćina. Nat. Immunol. 2016, 17, 758–764. [CrossRef] [PubMed]

4. Bruchard, M.; Ghiringhelli, F. Dešifriranje uloga urođenih limfoidnih ćelija u raku. Front. Immunol. 2019, 10, 656. [CrossRef]

5. Mazzurana, L.; Rao, A.; Van Acker, A.; Mjösberg, J. Uloge urođenih limfoidnih ćelija u ljudskom imunološkom sistemu. Semin. Imunopathol. 2018, 40, 407–419. [CrossRef]

6. Solano-Gálvez, SG; Tovar-Torres, SM; Tron-Gómez, MS; Weiser-Smeke, AE; Álvarez-Hernández, DA; Franyuti-Kelly, GA; Tapia-Moreno, M.; Ibarra, A.; Gutiérrez-Kobeh, L.; Vázquez-López, R. Ljudske dendritske ćelije: Ontogenija i njihove podskupine u zdravlju i bolesti. Med. Sci. 2018, 6, 88. [CrossRef]

7. Steinman, RM; Hemmi, H. Dendritske ćelije: Prevođenje urođenog u adaptivni imunitet. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006, 311, 17–58. [CrossRef]

8. Fu, C.; Ma, T.; Zhou, L.; Mi QS; Jiang, A. Vakcine protiv raka na bazi dendritičkih ćelija: izazovi, napredak i buduće mogućnosti. Immunol. Investig. 2022, 51, 2133–2158. [CrossRef]

9. Karimi, K.; Boudreau, JE; Fraser, K.; Liu, H.; Delanghe, J.; Gauldie, J.; Xing, Z.; Bramson, JL; Wan, Y. Pojačani antitumorski imunitet izazvan vakcinama dendritičnih ćelija rezultat je njihove sposobnosti da angažuju NK ćelije koje proizvode CTL i IFN. Mol. Ther. 2008, 16, 411–418. [CrossRef]

10. Bouwer, AL; Saunderson, SC; Caldwell, FJ; Damani, TT; Pelham, SJ; Dunn, AC; Jack, RW; Stoitzner, P.; McLellan, AD NK ćelije su potrebne za imunoterapiju zasnovanu na dendritskim ćelijama u vrijeme izazivanja tumora. J. Immunol. 2014, 192, 2514–2521. [CrossRef]

11. Pampena, MB; Levy, EM Prirodne ćelije ubice kao pomoćne ćelije u vakcinama protiv raka dendritičnih ćelija. Front. Immunol. 2015, 6, 13. [CrossRef] [PubMed]

12. Gardner, A.; de Mingo Pulido, Á.; Ruffell, B. Dendritske ćelije i njihova uloga u imunoterapiji. Front. Immunol. 2020, 11, 924. [CrossRef] [PubMed]

13. Cortez, VS; Robinette, ML; Colonna, M. Urođene limfoidne ćelije: Novi uvidi u funkciju i razvoj. Curr. Opin. Immunol. 2015, 32, 71–77. [CrossRef] [PubMed]

14. Montaldo, E.; Juelke, K.; Romagnani, C. Grupa 3 urođene limfoidne ćelije (ILC3): Porijeklo, diferencijacija i plastičnost kod ljudi i miševa. EUR. J. Immunol. 2015, 45, 2171–2182. [CrossRef]

15. Vacca, P.; Chiossone, L.; Mingari, MC; Moretta, L. Heterogenost NK ćelija i drugih urođenih limfoidnih ćelija u ljudskim i mišjim deciduama. Front. Immunol. 2019, 10, 170. [CrossRef] [PubMed]

16. Rankin, LC; Girard-Madoux, MJ; Seillet, C.; Mielke, LA; Kerdiles, Y.; Fenis, A.; Wieduwild, E.; Putoczki, T.; Mondot, S.; Lantz, O.; et al. Komplementarnost i redundantnost urođenih limfoidnih ćelija koje proizvode IL-22-. Nat. Immunol. 2016, 17, 179–186. [CrossRef] [PubMed]

17. Hoorweg, K.; Peters, CP; Cornelissen, F.; Aparicio-Domingo, P.; Papazian, N.; Kazemier, G.; Mjösberg, JM; Spits, H.; Cupedo, T. Funkcionalne razlike između ljudskih NKp44(-) i NKp44(+) RORC(+) urođenih limfoidnih ćelija. Front. Immunol. 2012, 3, 72. [CrossRef]

18. Carrega, P.; Loiacono, F.; Di Carlo, E.; Scaramuccia, A.; Mora, M.; Conte, R.; Benelli, R.; Spaggiari, GM; Cantoni, C.; Campana, S.; et al. NCR(+)ILC3 se koncentriše na ljudski karcinom pluća i povezan je sa intratumoralnim limfoidnim strukturama. Nat. Commun. 2015, 6, 8280. [CrossRef]

19. Spits, H.; Artis, D.; Colonna, M.; Diefenbach, A.; Di Santo, JP; Eberl, G.; Koyasu, S.; Locksley, RM; McKenzie, AN; Mebius, RE; et al. Urođene limfoidne ćelije – prijedlog za jedinstvenu nomenklaturu. Nat. Rev. Immunol. 2013, 13, 145–149. [CrossRef]

20. Vjerenica, R.; Finlay, CM; Willis, C.; Bevington, SL; Soley, J.; Ng, STH; Baker, SM; Andrews, S.; Hepworth, MR; Withers, DR Mreže recipročnih faktora transkripcije upravljaju funkcijom i identitetom podskupa ILC3 rezidentnog u tkivu. Nat. Immunol. 2021, 22, 1245–1255. [CrossRef]

21. van Beek, JJP; Martens, AWJ; Bakdash, G.; de Vries, IJM Urođene limfoidne ćelije u imunitetu tumora. Biomedicines 2016, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

22. Mattner, J.; Wirtz, S. Prijatelj ili neprijatelj? Dvosmislena uloga urođenih limfoidnih ćelija u razvoju raka. Trends Immunol. 2017, 38, 29–38. [CrossRef]

23. Kirchberger, S.; Royston, DJ; Boulard, O.; Thornton, E.; Franchini, F.; Szabady, RL; Harrison, O.; Powrie, F. Urođene limfoidne ćelije održavaju rak debelog crijeva kroz proizvodnju interleukina-22 u modelu miša. J. Exp. Med. 2013, 210, 917–931. [CrossRef] [PubMed]

24. Irshad, S.; Flores-Borja, F.; Lawler, K.; Monypenny, J.; Evans, R.; Male, V.; Gordon, P.; Cheung, A.; Gazinska, P.; Noor, F.; et al. RORgammat( + ) urođene limfoidne ćelije promovišu metastaze karcinoma dojke u limfnim čvorovima. Cancer Res. 2017, 77, 1083–1096. [CrossRef] [PubMed]

25. Goc, J.; Lv, M.; Bessman, NJ; Flamar, AL; Sahota, S.; Suzuki, H.; Teng, F.; Putzel, GG; Eberl, G.; Withers, DR; et al. Disregulacija ILC3 oslobađa progresiju i otpornost na imunoterapiju kod raka debelog crijeva. Cell 2021, 184, 5015–5030.e16. [CrossRef]

26. Liu, Y.; Song, Y.; Lin, D.; Lei, L.; Mei, Y.; Jin, Z.; Gong, H.; Zhu, Y.; Hu, B.; Zhang, Y.; et al. NCR(-) Grupa 3 Urođene limfoidne ćelije orkestriraju IL-23/IL-17 osovinu za promicanje razvoja hepatocelularnog karcinoma. EBioMedicine 2019, 41, 333–344. [CrossRef] [PubMed]

27. Bruchard, M.; Geindreau, M.; Perrichet, A.; Truntzer, C.; Balot, E.; Boidot, R.; Racoeur, C.; Barsac, E.; Chalmin, F.; Hibos, C.; et al. Regrutacija i aktivacija urođenih limfoidnih ćelija tipa 3 promoviše antitumorski imuni odgovor. Nat. Immunol. 2022, 23, 262–274. [CrossRef]

28. Rethacker, L.; Dječak, M.; Bisio, V.; Roussin, F.; Denizeau, J.; Vincent-Salomon, A.; Borcoman, E.; Sedlik, C.; Piaggio, E.; Toubert, A.; et al. Urođene limfoidne ćelije: NK i citotoksične ILC3 podgrupe infiltriraju metastatske limfne čvorove raka dojke. Oncoimmunology 2022, 11, 2057396. [CrossRef]

29. Cesta, MF Normalna struktura, funkcija i histologija slezine. Toxicol. Pathol. 2006, 34, 455–465. [CrossRef]

30. Ishiguro, T.; Nakajima, M.; Naito, M.; Muto, T.; Tsuruo, T. Identifikacija gena različito eksprimiranih u B16 podlinijama mišjeg melanoma s različitim metastatskim potencijalima. Cancer Res. 1996, 56, 875–879.

32. Szabo, SJ; Kim, ST; Costa, GL; Zhang, X.; Fathman, CG; Glimcher, LH Novi faktor transkripcije, T-bet, usmjerava posvećenost Th1 liniji. Cell 2000, 100, 655–669. [CrossRef] [PubMed]