Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Nedostatak mitohondrijalnog transkripcionog faktora A ciljanog epitela bubrega dovodi do progresivnog iscrpljivanja mitohondrija povezanih s teškom cističnom bolešću--I dio

Ken Ishii^1,2,11 et al

Abnormalna mitohondrijska funkcija je dobro poznata karakteristika akutnih i kroničnihbubreg bolesti. Kako bi stekli uvid u ulogu mitohondrija ububreghomeostazi i patogenezi, ciljali smo mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM), protein potreban za replikaciju i transkripciju mitohondrijske DNK koji igra kritičnu ulogu u održavanju mitohondrijalne mase i funkcije. Ispitati posljedice poremećene funkcije mitohondrija ububregepitelnih ćelija, inaktivirali smo TFAM u homeobox-u vezanom za sine oculis 2-izražavajućibubregprogenitorske ćelije. Nedostatak TFAM-a rezultirao je značajno smanjenom ekspresijom mitohondrijalnog gena, deplecijom mitohondrija, inhibicijom sazrijevanja nefrona i razvojem teške postnatalne cistične bolesti, što je rezultiralo preranom smrću. Ovo je bilo povezano s abnormalnom morfologijom mitohondrija, smanjenjem potrošnje kisika i povećanim glikolitičkim protokom. Nadalje, otkrili smo da je ekspresija TFAM smanjena kod miševa i ljudipolicistični bubrezi, što je bilo praćeno deplecijom mitohondrija. Dakle, naši podaci sugeriraju da su disregulacija ekspresije TFAM-a i deplecija mitohondrija molekularne karakteristikebubregcistična bolest koja može doprinijeti njenoj patogenezi.

KLJUČNE REČI: glikoliza; razvoj bubrega; mitohondrije;policistična bolest bubrega; TFAM

cistancheje dobro zapolicistična bolest bubrega

Translational Statement

Koristili smo genetiku miša kako bismo razumjeli ulogu mitohondrijalne disfunkcijebubreghomeostaza. Inaktivacija mitohondrijalnog transkripcionog faktora A (TFAM) u homeobox 2 epitelnim progenitor ćelijama povezanih sa sine oculisom rezultirala jebubrežnineuspjehzbog teškepolicistični bubreg bolest. Naši nalazi pokazuju da je progresivna mitohondrijska disfunkcija povezana s defektnom diferencijacijom epitela ibubrežnicistogeneza. Nadalje, ustanovili smo da su ekspresija TFAM i broj mitohondrija smanjeni kod ljudipolicistični bubregtkiva. Naše studije sugeriraju da terapijske strategije, koje imaju za cilj poboljšanje zdravlja mitohondrija, mogu biti korisne u liječenju pacijenata s autosomno dominantnimpolicistični bubregbolest.

Mitohondrijska (mt) disfunkcija je dobro poznata patološka karakteristika čestihbubreg bolestii može izazvati ćelijske ozljede, upalu i fibrozu.1 Ububreg, tubularne epitelne stanice su u velikoj mjeri ovisne o adenozin trifosfatu (ATP) koji nastaje oksidativnom fosforilacijom (OXPHOS) jer obavljaju višestruke funkcije epitelnog transporta koje troše energiju. Stoga je održavanje efikasne proizvodnje mt ATP-a od suštinskog značaja za normalnu funkciju bubrega i sistemsku homeostazu elektrolita. Osim toga, nedavni dokazi pokazuju da mitohondrije imaju glavnu ulogu u regulaciji gena, ćelijskoj signalizaciji i diferencijaciji stanica putem stvaranja posrednih metabolita i reaktivnih vrsta kisika (ROS).2Uprkos ovom napretku, uloga mt signalizacije u patogenezi uobičajenihbubregbolestinije dobro shvaćeno.

Za istraživanje mt funkcije ububrežnihomeostaze i patogeneze, ciljali smo mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM). TFAM je nuklearno kodirani faktor bitan za mt funkciju, održavanje broja kopija mt i strukturnu stabilnost mt DNK jer regulira replikaciju i transkripciju mt genoma savijanjem promotorske DNK.3,4 Mt DNK sisara sadrži 37 gena, 13 od kojih kodiraju proteinske podjedinice kompleksa respiratornog lanca, 22 kodiraju prijenosne RNK i 2 ribosomske RNK.3 Dakle, TFAM je direktno uključen u regulaciju transporta mt elektrona i sintezu ATP-a putem transkripcije gena kao što je mitohondrijski kodirani citokrom b ( MT-CYB), mitohondrijski kodirana podjedinica citokrom c oksidaze 1 (MT-CO1) i mitohondrijski kodirana membranska podjedinica ATP sintaze 6 (MTATP6).3,5 Bez TFAM-a, ćelije gube sposobnost da proizvode ATP putem OXPHOS-a, ne mogu generirati značajne količine mt ROS i progresivno iscrpljuju mitohondrije.6–9 Genetske studije su pokazale da je TFAM neophodan za normalnu embriogenezu jer je globalna homozigotna inaktivacija Tfam rezultirala intrauterinim smrtnost do embrionalnog dana 10,5, dok heterozigotni nedostatak, iako je smanjio broj kopija mt za ~40 posto i doveo do nedostatka respiratornog lanca, nije doveo do embrionalne letalnosti.6 Dakle, genetsko ciljanje TFAM-a je korisna eksperimentalna strategija za ispitivanje uloge progresivne mt disfunkcije u ćelijskoj diferencijaciji i homeostazi tkiva. Uslovna inaktivacija Tfam-a specifična za tip ćelije sugerira da je stvaranje OXPHOS-a i/ili mt ROS ključno za ćelijsku diferencijaciju, funkciju i normalnu fiziologiju.6–10

Primarni mt poremećaji zbog nuklearnih ili mt genskih mutacija mogu se pojaviti sabubreg bolestnajčešće se manifestira kao tubulointersticijska ozljeda ili izolirana tubularna disfunkcija.11,12 Iako je implicirana u patogenezi određenih ljudskih bolesti kao što su neurodegenerativni poremećaji,13 specifične mutacije u TFAM-u koje uzrokujububrežnibolest nije prijavljena. U novije vrijeme, smanjena ekspresija TFAM-a povezana je s kroničnombubregbolest. Gubitak mt integriteta zbog inaktivacije Tfam-a uzrokovao je tubulointersticijsku bolest ibubrežni neuspjehkod miševa, što je djelomično bilo zbog aktivacije mt DNK stresom izazvane cikličke GMP-AMP sintaze (cGAS) – stimulatora interferonskih gena (STING) – zavisnih upalnih odgovora.14

Ovdje izvještavamo da miševi s uslovnom inaktivacijom Tfam-a u homeoboxu 2 (SIX2) koji eksprimiraju nefronske progenitorne ćelije15 razvijaju tešku cističnu bolest i prerano umiru odbubrežnineuspjehkao mladi mladi miševi.Tfam^-/- miševe su karakterizirali defekti u sazrijevanju nefrona, što je bilo povezano s deplecijom mt, smanjenjem OXPHOS-a i metaboličkim pomakom prema glikolizi uTfam^-/- bubrežniepitel. S obzirom na težinu cistične bolesti uTfam^-/- miševa, analizirali smo 2 mišja modelapolicistični bubregbolest(PKD), koje su rezultat mutacija u bilo kojem policistinu-1 (PKD(policistična bolest bubrega)1) ili cistin-1 (Cys1), kao i ljudska tkiva pacijenata sa autosomno dominantnom policističnom bolešću bubrega (ADPKD). Mi to utvrđujemoTfam^-/- je disreguliran u cistama iz mišje i ljudske PKD(policistična bolest bubrega), maramice. Uzeti zajedno, naše studije sugeriraju da su disregulacija TFAM-a i smanjenje mt karakteristične karakteristikebubrežnicistične bolesti i mogu imati doprinos u njihovoj patogenezi.

cistancheje dobro zapolicistična bolest bubrega

REZULTATI

Inaktivacija Tfam u ćelijama loze SIX2 uzrokuje tešku cističnu bolest koja rezultirabubrežnineuspjehDa bi se istražila mt funkcija ububrežniepitela, inaktivirali smo Tfam u SIX2-progenitorskim ćelijama koje eksprimiraju sve segmente nefrona, osim sabirnog kanala (CD).15 Za ovo smo ukrstili Tfam floxed alel sa bakterijskim umjetnim hromozomskim transgenim miševima koji eksprimiraju poboljšani zeleni fluorescentni protein/Cre rekombinaza fuzioni protein (eGFP/Cre) pod transkripcijskom kontrolom promotora Six2 (slika 1a).16 Miševi homozigotni za Tfam floksirani alel i heterozigotni za eGFP/Cre transgen (Šest{0}}eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) se odavde nadalje naziva Šest2-Tfam^-/- mutanti. šest2-Tfam^-/- miševi su rođeni u očekivanim Mendelovim omjerima i nisu se razlikovali od Cre legla kontrola vizualnom inspekcijom pri rođenju. Međutim, razlike u tjelesnoj težini između Six2-Tfam^-/- kontrole mutanata i Cre legla postale su očigledne do postnatalnog dana (P) 14 (5,7 plus -0,3 g za mutante naspram 7,5 plus -0,3 g za kontrole, n=4 svaka, P =0.004; Dodatna tabela S1). šest2-Tfam^-/- mutantne miševe karakterizira povećanjebubreziu poređenju sa kontrolama (bubreg/omjer tjelesne težine od 1,45 posto plus -0.19 posto za mutante naspram 0.60 posto plus - 0.02 posto za kontrolu, n {{8} } svaki, P < 0,001;="" slika="" 1b,="" dodatna="" tabela="" s1)="" i="" umrli="" između="" p20="" i="" p30="" (slika="" 1b).="" maloljetnička="" smrtnost="" u="" mutantnoj="" kohorti="" bila="" je="" povezana="">bubrežnineuspjehod teške cistične bolesti sa nivoom azota ureje u krvi od 68,40 plus -5,32 mg/dl za mutantne miševe naspram 16.8 2.0 mg/dl za kontrole ( n= 6 i 7, redom; P < 0.0001;="" slike="" 1b="" i="" c).="" nadalje,="" six2-tfam="" mutanti="" su="" razvili="" značajnu="" albuminuriju="" (omjer="" albumin/kreatinin="" u="" urinu="" 43,58="" plus="" -362,475,18="" mg/g="" u="" six2-tfam="" mutanti="" naspram="" 3,39="" mg/g="" u="" kontrolama="" na="" p14,="" n="6" i="" 10="" redom;="" p="">< 0,0001).="" ovo="" je="" u="" skladu="" sa="" obrascem="" ekspresije="" cre="" rekombinaze="" u="" six2="" nefronskim="" progenitorskim="" ćelijama,="" koje="" dovode="" do="" kapi="" mezenhima="">bubrežnitubuli i podociti.15 Za razliku od Six2-Tfam^-/- mutanti, miševi s heterozigotnim Tfam nedostatkom u SIX2 progenitornim stanicama razvijali su se normalno, bili su plodni i nisu se očito razvijalibubregbolest(Dopunska slika S1).

Slika 1|Inaktivacija Tfam u ćelijama loze SIX2 dovodi do teške cistične bolesti i zatajenja bubrega. (a) Šematski prikaz koji ilustruje eksperimentalni pristup i lokaciju ciljanih sekvenci unutar Tfam floksiranog alela. Analiza lančane reakcije polimerazom ukupne genomske DNK bubrega izolovane iz kontrole legla (Cre ) i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi postnatalnog dana (P) 7; nerekombinirajući Tfam floxed alel je označen sa 2-lox (2); rekombinovani alel po 1-lox, alel divljeg tipa po wt; þ ili - ukazuju na prisustvo ili odsustvo Six2-eGFP/Cre transgena. (b) Lijevi paneli, fotografije bubrega iz Cre kontrole i Six2-Tfam^-/- miševi starosti P20. Težina bubrega (KWs) je izražena kao postotak tjelesne težine (BW) (n= 4-14). Desni paneli, nivoi azota uree u krvi (BUN) u Cre littermate control (co) i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi P7 (n=7 i 6, respektivno) i Kaplan-Meierove krivulje preživljavanja za Cre kontrolu i šest2-Tfam^-/- miševi u poređenju sa testom log ranga (n=10–13). (c) Reprezentativne slike formalinom fiksiranih, parafinskih sekcija bubrega iz Cre kontrole i Six2-Tfam^-/-miševi u dobi P7 i P29 obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i analizirani imunohistohemijom na aktin glatkih mišića (ACTA2) i antigen 31 za diferencijaciju klastera (CD). Brojčani znakovi prikazuju cistične strukture, a zvjezdice prikazuju glomerule. Šipke ¼ 1 mm za cijeli poprečni presjek bubrega, 100 mm za H&E slike velike snage i 50 mm za IHC slike. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost plus - SEM i analizirani su 2-tailed Studentovim t-testom. ***P < 0,001.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Analiza Six2-Tfam^-/- miševi, koji su također eksprimirali ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reporter alel, ovdje nazvan Six2-mT/mG;Tfam^-/- miševa, što ukazuje da je velika većina cističnih struktura uTfam^-/- bubrezi su izvedeni iz ćelija sa istorijom ekspresije Six2-eGFP/Cre (dodatna slika S2). Ciste u šest2-Tfam^-/- bubrezipokazao je dokaz proliferacije što je pokazano prisustvom Ki67- pozitivnih epitelnih ćelija koje oblažu ciste (u prosjeku w40 posto svih epitelnih ćelija koje oblažu ciste), dok ćelije pozitivne na rascijepljenu kaspazu 3 nisu otkrivene unutar cista (dodatna slika S3 ). Ovi nalazi su u skladu sa povećanim fosforiliranim ekstracelularnim signalom reguliranom kinazom (p-ERK) i nivoima b-katenina u šesti2-Tfam^-/- tkivo bubrega (dodatna slika S3). Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da šest2-Tfam^-/- bubrezi pokazuju molekularne karakteristike koje su često povezane sabubrežnicistične bolesti.

Slika 3 |Tfam^-/-ciste ne izražavaju uobičajene markere specifične za segment nefrona. (a) Reprezentativne slike formalinom fiksiranih, parafinom ugrađenih sekcija bubrega od šest2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Reprezentativne slike formalinom fiksiranih, parafinom ugrađenih sekcija bubrega od šest2-mT/mG;Tfam^-/-miševi u dobi P14 obojeni na eGFP i uromodulin pomoću IF. Zvjezdicama su prikazane ciste s intraluminalnim uromodulinom. Ispitivano je prisustvo intraluminalnog uromodulina u cistama sa maksimalnim prečnikom od 50-100μm ili u cistama većim od 100 mm u maksimalnom prečniku. Šipke=(a,b) 100 mm. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte internetsku verziju ovog članka nawww.kidney-international.org.

cistancheje dobro zabubreg

Sazrijevanje nefrona je defektno u Six2-Tfam^-/-miševi

Budući da može proći i do nekoliko sedmica prije nego kod miševa sa tkivno specifičnom Tfam inaktivacijom razviju patologiju,17 smo zatim ispitali vremenski tokbubrežnirazvoj bolesti u šest2-Tfam^-/-miševi. Prikupili smo bubrege kontrolnih i mutantnih miševa u dobi P0, P7 i P14 i koristili histološke metode, imunofluorescentno (IF) bojenje i analizu genske ekspresije u cijelostibubregizvodi za procjenu. IF bojenje za SIX2 i E-kadherin u dobi P0 pokazalo je da su bubrezi iz kontrole i šest2-Tfam^-/-bili histološki slični. Formiranje struktura kortikalne nefrogene zone, kao što je SIX2þ mezenhim kape, vrhovi uretera koji eksprimiraju E-kadherin, i nastajuće strukture nefrona kao što sububrežnivezikule i tijela u obliku zareza i S nije blokirana u Six2-Tfam^-/-bubrezi (Slika 2a). Ovi histološki nalazi bili su u skladu sa nivoima ekspresije gena koji kodiraju nefrogene markere. Nivoi mRNA Six2, uparene kutije 2 (Pax2), LIM homeobox proteina 1 (Lhx1) i transkripcionog faktora 1 (Sall1) nisu se značajno razlikovali između kontrole i Six2-Tfam^-/- miševa ukupnobubreghomogenati iz P0bubrezi(Slika 2b). Ovo sugerira da inaktivacija TFAM-a u SIX2 nefronskim progenitorima nije značajno utjecala na formiranje nefrogenih struktura.

Iako formiranje strukture nefrona u nastajanju nije inhibirano, bojenje alcijanskom plavom/periodnom kiselinom–Schiff i lotus tetragonolobus lektinom ukazuje na defektno sazrijevanje terminalnog nefrona kod šestice2-Tfam^-/-miševi u dobi P{{0}}. Alcian blue/periodična kiselina-Schiff, koja boji tubularne bazalne membrane i obrub četkice, i lotus tetragonolobus lektin, koji identificira specifične oligosaharide u četkici proksimalnih stanica tubula, oba su smanjena u mutantnim bubrezima. Slika 2c prikazuje alcijansko plavo/periodna kiselina – Schiffovo bojenje u vremenskim tačkama P0, P7 i P14. Histohemija lektina lotosa tetragonolobusa i IF bojenje za Wilmsov tumor 1 protein u vremenskim tačkama P{{10}}, P7 i P14 prikazani su na dodatnoj slici S4. U dobi P0, relativna površina koja je pozitivno obojena lektinom lotosa tetragonolobusa bila je 2,10 posto, 0,51 posto i {{30}},39 posto 0,1 posto u dobi P7 naspram 6,25 posto 0,28 posto i 6,2 posto 1,1 posto za kontrole, respektivno (n=3–4, P=0,0004 i 0,0007, respektivno; Dodatna slika S4). U skladu sa ovim histološkim nalazima je značajno smanjenje ekspresije gena koji kodiraju markere specifične za glomerularne i nefronske segmente podocin, nefrin, akvaporin 1 (Aqp1), natrijum-fosfatni kotransporter 2a (NaPi2a), uromodulin, natrijum-kalijum hlorid (kotransporter2). Nkcc2), i kotransporter natrijum klorida (Ncc) osjetljiv na tiazide u Six2-Tfam^-/-miševi (slika 2b). Uzeti zajedno, ovi podaci sugeriraju da Šest2-Tfam^-/- bubrezipokazuju progresivno smanjenje broja zrelih proksimalnih segmenata nefrona i glomerula.

Budući da aktivnost Six2-eGFP/Cre dovodi do nefronskih segmenata koji potiču iz mezenhima s nedostatkom TFAM-a, predvidjeli smo da sazrijevanje epitelnih ćelija CD-a, koje potiču iz ureternog pupoljka, neće biti pogođeno kod šest{{2} }Tfam^-/-bubrezi. U skladu sa ovom idejom je da bojenje Dolichos biflorus aglutininom, koji reaguje sa N-acetil-D-galaktozom u distalnom tubulu i CD-u, ukazuje na relativnu preveliku zastupljenost Dolichos biflorus aglutinin-pozitivnih struktura u šest2-Tfam^-/-bubrezi. U dobi P7, pozitivno obojene površine za Dolichos biflorus aglutinin činile su 13,91 posto 0,9 posto ukupne površine za mutante naspram 1,93 posto 0,1 posto za kontrolu (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Dodatna slika S4). Ekspresija mRNA epitelne 1 alfa podjedinice natrijum kanala (Scnn1a) ili akvaporina 2 (Aqp2), koji su oba eksprimirana u CD epitelnim ćelijama, nije značajno smanjena u poređenju sa kontrolom (Slika 2b). Za razliku od Six2-Tfam^-/-bubrezi, Tfam inaktivacija u homeobox B7 (HOXB7) progenitornim ćelijama, koje stvaraju CD epitelne ćelije, što rezultira gubitkom ekspresije markera CD nefrona i blagom dilatacijom tubula, ali ne i cistogenezom (dopunska slika S5). Uzeti zajedno, naši podaci ukazuju na to da gubitak TFAM funkcije u SIX2 progenitorskim ćelijama ne blokira razvoj nefronskih struktura u nastajanju, ali inhibira terminalno sazrijevanje nefrona.

Tfam^-/-ciste imaju manjak uobičajenih markera nefronskih segmenta

Za karakterizaciju histogenetskog porijeklaTfam^-/- bubrežniciste, uradili smo IF analizeTfam^-/- bubreziat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm karakterizirane su intraluminalnim naslagama uromodulina, što ukazuje na porijeklo iz segmenata nefrona distalno od proksimalnog tubula i Henleove descendentne petlje (slika 3b).

Progresivne abnormalnosti u mt funkciji i morfologiji uTfam^-/- epitelne ćelije

Da bismo okarakterizirali vremenski tok metaboličkih posljedica delecije Tfam-a, prvo smo ispitali nivoe mRNA Tfam-a i mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 regulirane TFAM-om uTfam^-/- bubreziu dobi P0, P7 i P14. Kao što se očekivalo, nivoi mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb i mt-Atp6 bili su značajno smanjeni (Slika 4a).Tfam^-/-epitelne ćelije označene eGFP (šest{{0}}mT/mG; Tfam/miševi) pokazale su značajno smanjenje ekspresije proteina MT-CO1 (dodatna slika S7). Broj kopija mt DNK smanjen je za 63 posto, što je u skladu sa osiromašenjem mt, što je znak nedostatka TFAM (Slika 4a). Nasuprot tome, ekspresija nuklearnih gena koji kodiraju nikotinamid adenin dinukleotid: podjedinicu 3 jezgre ubikinon oksidoreduktaze (Ndufs3) i flavoproteinsku podjedinicu A (Sdha) kompleksa sukcinat dehidrogenaze nije bila pogođena u dobi P0, ali je smanjena u dobi P7 i P14a (Slika P7 i P14). Ovi nalazi iz analize mt gena i proteina su u skladu sa progresivnim gubitkom broja kopija mt u Tfam/epitelu.

Zatim smo istražili metaboličke efekte inaktivacije Tfam u primarnim epitelnim ćelijama proksimalnih tubula (PTEC) izolovanim u dobi P7.Tfam^-/- PTECs su pokazali značajno smanjenje bazalne potrošnje kiseonika (40.77 4.10 za mutante naspram 61.75 5.18 pmol/min/104 ćelije za kontrole, n=3 svaka, P =0.034), ATP-vezano disanje (33.11 3.91 za mutante naspram 46.92 4.91 pmol/min/104 ćelije za kontrole, n{{18} } svaki, P=0.093), maksimalno disanje (116.8 14.19 za mutante naspram 225.5 13.55 pmol/min/104 ćelije za kontrole, n{{ 28}} svaki, P=0.005), i rezervni respiratorni kapacitet (76.05 10.18 za mutante naspram 163.7 8.61 pmol/min/104 ćelije za kontrole , n =3 svaki, P=0.003; Slika 4b).

Da bismo dalje karakterizirali stepen iscrpljenosti i oštećenja mt, ispitali smoTfam^-/- bubrezitransmisijskom elektronskom mikroskopijom i {{0}}dimenzionalnom strukturiranom iluminirajućom mikroskopijom (3D SIM). U dobi P7, mitohondrije su pokazale nepravilne oblike i balon, što je u skladu s prethodnim nalazima kod Tfam nokaut miševa. Transmisiona elektronska mikroskopska analiza je pokazala da su strukturne abnormalnosti mitohondrija, kao što su povećana veličina i abnormalne kriste, napredovale postnatalno jer su morfološke razlike između mutanata i kontrolne skupine bile manje očigledne u dobi P0 i postale su teže s godinama (slika 4c ). 3D SIM je korišten za ispitivanje mt volumena i veličine mreže u šest2-mT/mG; Tfam / mutanti u poređenju sa šest2-mT/mG kontrolnim miševima u dobi P7; mt volumen je mjeren u poprečnim presjecima od 5 do 8 tubula po presjeku, ispitujući 25 do 40 eGFP-pozitivnih kortikalnih epitelnih ćelija obojenih na anion-selektivni kanal 1 zavisan od napona IF bojenjem. Otkrili smo da je ukupni volumen mt po eGFP pozitivnoj ćeliji značajno smanjen (62.66 16.46 mm3/ ćeliji za mutante naspram 177.4 30.17 mm3/ćeliji za kontrolu, n ¼ 3 svaka , P ¼ 0.0289) i bio je povezan s promjenom omjera ukupnog mt zapremine po ukupnoj zapremini ćelije od 0.230 0.01 u kontrolama na 0.{{ 33}}.016 u Šest2-Tfam / mutanti (n=3 svaki, P=0,0017; Slika 4c). Maksimalna veličina mt mreže, koja mjeri najveću mt mrežu koja je pronađena u svim ispitanim ćelijama pozitivnim na eGFP, smanjena je u šest2-Tfam^-/- bubrezi(143.2 23.2 mm3 za mutante naspram 318.3 49.45 mm3 za kontrole, n ¼ 3 svaka, P ¼ 0.0327). Uzeti zajedno, ultrastrukturni i SIM nalazi i nalazi iz analize mt gena i proteina su u skladu s progresivnim gubitkom broja mt kopija uTfam^-/- epitel.

Cistancheje dobro zapolicistična bolest bubrega

Nedostatak TFAM-a pomjera metabolizam bubrežnog epitela prema glikolizi

PTEC ububregkoriste b-oksidaciju masnih kiselina i OXPHOS za stvaranje ATP-a i glukoneogenetski su.18 Da bismo stekli dodatni uvid u metaboličke promjene povezane s inaktivacijom Tfam-a, izvršili smo analizu sekvenciranja RNKbubreziod šest2-Tfam^-/-i Cre legla kontrolni miševi u dobi P7. Otkrili smo da su ključni regulatorni geni uključeni u glikolizu, kao što su heksokinaza 2 (Hk2) i enolaza 2 (Eno2), bili pojačano regulirani. Nasuprot tome, smanjena je ekspresija većine gena uključenih u ciklus trikarboksilne kiseline (npr. izocitrat dehidrogenaza 1 [Idh1]), kao i ekspresija gena uključenih u b-oksidaciju masnih kiselina, kao što je acetil-koenzim A aciltransferaza 1B ( Acaa1b), acil-koenzim A dehidrogenaze srednjeg lanca (Acadm) (Slika 5a i b, Dodatna slika S8). U skladu sa smanjenom ekspresijom gena uključenih u ciklus trikarboksilne kiseline - oksidacijski geni bili su akumulacija neutralnih lipida što je otkriveno uljno crvenim O bojenjem u smrznutombubregsekcije u dobi P14 (Slika 5c).

Smanjena ekspresija TFAM-a u mišjim i ljudskim PKD tkivima povezana je sa deplecijom mt

Jer šest2-Tfam^-/- bubrezijako je ličio na PKD(policistična bolest bubrega) bubrezi, zatim smo procijenili da li je TFAM bio nereguliran u PKD(policistična bolest bubrega)maramice. Prvo smo ispitali TFAM i TFAM reguliranu ekspresiju gena u 2 dobro utvrđena genetska PKD modela miša. Nivoi Tfam mRNA su značajno smanjeni u homogenatima cijelog bubrega iz Pkd^-/- i Cys^cpk/cpkmiševi, koji nose mutacije u bilo kojem od PKD1(policistična bolest bubrega)ili Cys1. Ovo je bilo povezano sa smanjenjem ekspresije mitohondrijalnih i nuklearno kodiranih mt gena, kao i sa disreguliranom ekspresijom glikolitičkih gena. Slično kao Six2-Tfam^-/-bubrezi, PKD(policistična bolest bubrega)^-/- i Cys^cpk/cpk bubrezikarakterizirani su povišenim nivoima Eno2 i Hk2 i značajno smanjenim nivoima fosfoglicerat kinaze (Pgk) 1, piruvat dehidrogenaze kinaze (Pdk) 1 i Pdk4 (Slika 6a). Ekspresija TFAM proteina, kako je procijenjena IF bojenjem, smanjena je u epitelnim ćelijama ciste u poređenju sa epitelnim ćelijama iz susjednih necističnih tubula (Slika 6b). Ovo je povezano sa smanjenom ekspresijom mt-Co1 i mt-Atp6 hibridizacijom RNA fluorescencije in situ (Slika 6b, Dodatna slika S9); mt volumen, kako je određen 3D SIM, smanjen je za 55 posto u usporedbi s epitelnim stanicama iz susjednih, noncističnih tubula ili PTEC-ima iz normalne kontrolebubrezi. Razlike u zapremini mt između normalnih kontrolnih PTEC-a i PTEC-a iz necističnih tubula nisu pronađene (Slika 6c).

Ispitati da li je gubitak ekspresije TFAM uobičajena molekularna karakteristika ljudske PKD(policistična bolest bubrega), analizirali smo uzorke nefrektomije od 5 pacijenata sa ADPKD imunohistohemijom, IF bojenjem, RNA fluorescencijom in situ hibridizacijom i 3D SIM. Smanjena ekspresija TFAM-a uočena je u 75,2 posto plus -7,5 postobubrežniciste analizirane imunohistohemijom. Ovo je povezano sa smanjenom ekspresijom MT-CO1 i MT-ATP6 hibridizacijom RNA fluorescencije in situ (Slika 7a, Dodatna slika S10); mt volumen u epitelnim ćelijama sluznice ciste smanjen je za približno 70 procenata kako je procijenjeno 3D SIM (Slika 7b). Uzeto zajedno, analiza 2 PKD(policistična bolest bubrega)mišji modeli i ljudska ADPKD tkiva sugeriraju da su nedostatak TFAM-a i deplecija mt uobičajeni nalazi u PKD-u(policistična bolest bubrega)tkiva i vjerovatno će utjecati na patogenezububrežnicistične bolesti.

cistanche je dobar zapolicistična bolest bubrega

Diskusija

Kliknite ovdje za informacije o dijelu II (Diskusija) ovog članka.

Izvod iz: 'BubregNedostatak mitohondrijalnog transkripcionog faktora A ciljanog epitela dovodi do progresivnog iscrpljivanja mitohondrija povezanih s teškom cističnom bolešću ' od Ken Ishii1,2,11 i sur.

---BubregInternational (2021) 99, 657–670