Održivost i antioksidativni efekti tradicionalnog rashladnog rižinog praha (bedak Sejuk) napravljenog od Oryza Sativa Ssp. Indica i Oryza Sativa Ssp. Japonica o ćelijama melanoma B164A5 izazvanim UVB zrakama

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ahmad Rohi Ghazali1*, Raveena Vaidheswary Muralitharan1, Chan Kam Soon1, Tharsini Salyam1, Nurul Najihah Ahmad Maulana1, Ummul Aqeela Balqees Mohamed Thaha1, Rasyidah Mohamad Halim1, Rasyidah Mohamad Halim1, Chan Kam Soon1, Tharsini Salyam1, Nurul Najihah Ahmad Maulana1, Ummul Aqeela Balqees Mohamed Thaha1, Rasyidah Mohamad Halim1, Rasyidah Mohamad Halim1, Hammad Sadžidah Suhaifizik1, M.

Abstract

Pozadina:Tradicionalni rashladni pirinač u prahu (bedak sejuk) je na bazi fermentisanog pirinčakozmetičkikoja se nanosi lokalno na kožu, kao noćna maska ​​za lice. Prema svjedočenjima korisnika,bedak sejukuljepšava i izbjeljuje kožu, pri čemu se ove prednosti mogu iskoristiti kao potencijalno sredstvo za hemoprevenciju melanoma.

Cilj:Stoga je ova studija imala za cilj da utvrdi efektebedak sejuknapravljen od Oryza sativa ssp. indica (Indica) i Oryza sativassp. japonica (Japonica) na stanicama melanoma B164A5 izazvanim UVB zrakama, te također identificiratiantioksidanskapaciteti obe vrste bedak sedžuka.

Metode:Optimalna doza Indica i Japonica bedak sejuk za tretiranje ćelija određena je MTT testom. Zatim, theantioksidanskapacitete obe vrstebedak sejukodređivani su pomoću FRAP testa.

Rezultati:Iz MTT testa je ustanovljeno da Indica i Japonica bedak sejuk ne pokazuju citotoksične efekte na ćelije. Dakle, IC50 se ne može dobiti i dvije veće doze, 50 i 100 g/L su odabrane za liječenje. U FRAP testu, Indica bedak sejuk pri 50 i 100 g/L pokazao je FRAP vrijednosti od 0,003 ± 0,001 ug AA (askorbinske kiseline)/g bedak sejuka i 0,004 ± 0,0003 ug AA/gbedak sejuk. Dok je Japonica bedak sejuk od 50 g/L imao istu FRAP vrijednost kao Indica bedak sejuk od 100 g/L. Što se tiče Japonica bedak sejuka od 100 g/L, pokazao je najvećuantioksidanskapacitet sa FRAP vrijednošću {{0}}.01 ± 0,0007 ug AA/g bedak sejuka što je bilo statistički značajno (p < 0,05) u poređenju sa drugim testiranim koncentracijama.

zaključak:U zaključku, Japonicabedak sejukima višuantioksidanskapacitet u poređenju sa Indica bedak sejuk uprkos tome što oba nisu citotoksična prema ćelijama. Bez obzira na to, potrebno je provesti daljnja istraživanja prije nego što se bedak sejuk razvije kao potencijalni agens za kemoprevenciju melanoma.

Ključne riječi:Bedak sejuk- fermentisani pirinač- fermentisankozmetika- Oryza sativa Indica- Oryza sativa Japonica

Kliknite zaekstrakt cistanche i cistanche deserticola ma za antioksidans

Uvod

Najveći organ ljudskog tijela je koža, koja čini 16 posto ljudske tjelesne težine. Epiderma kože funkcionira kao zaštitni sloj koji odvaja organizme od vanjskog okruženja. Ovo je ključno u suzbijanju stresora iz okoline kao što je ultraljubičasto (UV) svjetlo. Kada UV svjetlo prodre u epidermu, pigmenti melanina u keratinocitima formiraju zaštitni omotač iznad jezgara keratinocita. Ovo koži daje zaštitu od prodiranja UV svjetlosti, kao i neutralizaciju reaktivnih vrsta kisika (ROS) koje su proizvedene (D'Orazio et al., 2013.; Aluwi et al., 2016.; Woolridge Cooper, 2018.).

Međutim, povećano izlaganje UV zračenju glavni je uzrok hiperpigmentacije i oštećenja kože (Chan et al., 2014; American Cancer Society, 2020). Sunčevo UV svjetlo koje prodire u kožu su UVA (90 - 95 posto) i UVB zraci (5 – 10 posto), pri čemu stepen oštećenja kože zavisi od talasne dužine svakog zraka. UVA zraci imaju veće talasne dužine (320 – 400 nm) koje prodiru duboko u dermis i rezultiraju stvaranjem slobodnih radikala, posebno ROS. Što se tiče UVB zraka, sa kraćim talasnim dužinama (280 – 320 nm) koje prodiru samo do epidermalnog sloja, zraci oštećuju DNK što zauzvrat izaziva mutacije. Ova kombinacija ROS formacija i mutacija u konačnici doprinosi razvoju raka kože (Sander et al., 2003; Pfeifer i Besaratinia, 2012; D'Orazio et al., 2013; Kamarulzaman et al., 2017; Pavel et al., 2017; Nagapan et al., 2018).

Tip raka kože koji nastaje zbog prekomjernog izlaganja UV zračenju je melanom. Melanom nastaje kada melanociti rastu van kontrole zbog mutacija u DNK. Iako melanom čini samo manje od 10 posto svih karcinoma kože, on doprinosi većini smrtnih slučajeva od raka kože. Ovo se može pripisati visokom metastatskom potencijalu melanoma i otpornosti na terapiju (Pfeifer i Besaratinia, 2012; American Cancer Society, 2020). Stoga su strategije kemoprevencije melanoma prikladnije u borbi protiv ove bolesti (Chhabra et al., 2017).

U skladu sa strategijama kemoprevencije melanoma, ideja da se koristi lokalnokozmetičkipojavio se proizvod koji ima potencijal da smanji stvaranje ROS i mutacije na ljudskoj koži. Ovaj proizvod, tradicionalni rashladni pirinač u prahu, poznatiji kaobedak sejuku Maleziji, tradicionalni je kozmetički proizvod na bazi fermentirane riže. Zrna riže koja su fermentirana u prethodnim studijama za proizvodnju bedak sejuka su Oryza sativa ssp. indica (Indica) i Oryza sativa ssp. japonica (Japonica) (Dzulfakar et al., 2015a). Zrna pirinča Indica su duga, ravna, vitka, lako se lome i imaju visok sadržaj amiloze, dok su zrna pirinča Japonica kratka, okrugla, ne lome se lako i imaju nizak sadržaj amiloze (Ricepedia, nd). Bedak sejuk kao proizvod fermentacije zrna pirinča je u obliku kapljica vode ili pastila u obliku konusa. Kada se ove pastile pomešaju sa vodom i nanesu na kožu kao noćna maska ​​za lice, daju efekat hlađenja. Svjedočanstva korisnika s generacije na generaciju potvrđuju da je bedak sejuk u stanju da uljepša, ali i izbijeli kožu (Dzulfakar et al., 2015b; Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018). Međutim, ova svjedočanstva nikada nisu testirana u laboratorijskim uvjetima, posebno u pogledu njegovog djelovanja na stanice kože, kako normalne tako i maligne.

Stoga je naša studija imala za cilj da utvrdi efektebedak sejuknapravljen od podvrsta pirinča Indica i Japonica korištenjem stanica melanoma B164A5 izazvanih UVB zrakama, kao i identifikacijomantioksidanskapaciteti obe vrste bedak sedžuka.

Materijali i metode

Priprema Indica i Japonica bedak sejuk

Thebedak sejuknapravljene od podvrsta pirinča Indica i Japonica ljubazno su dostavljene sa Fakulteta za inženjerstvo i građevinsko okruženje, Universiti Kebangsaan Malaysia, 43600 Bangi, Selangor. Da bi se pripremio bedak sejuk, zrna pirinča Indica i Japonica su namočena u vodu iz slavine u omjeru 1:1 (w/v) u odvojenim zatvorenim posudama koje nisu sterilizirane. Zrna pirinča su zatim ostavljena da se podvrgnu prirodnoj fermentaciji 14 dana na sobnoj temperaturi. Četrnaestog dana, zrna pirinča su filtrirana pomoću muslinske krpe i ponovo namočena u novoj količini vode (w/v). Namakanje zrna pirinča je ponovljeno šest puta svakih 14 dana, čime je ukupni proces namakanja trajao 84 dana. Nakon 84 dana, dobijena rižina pasta iz svake podvrste riže je sakupljena i osušena u pećnici da bi se dobio praškasti oblik bedak sejuka (Dzulfakar et al., 2016a). Bedak sedžuk je potom čuvan u frižideru na 4oC do dalje upotrebe. Prije eksperimenata, bedak sejuk je otopljen u destilovanoj vodi i filtriran kroz 0,22 µm Millipore filter šprica za sterilizaciju.

Ćelijska kultura

Ćelijska linija mišjeg melanoma B164A5 kupljena je od Evropske zbirke provjerenih ćelijskih kultura (ECACC). Ćelije su uzgajane u Dulbeccovom modificiranom mediju orla (DMEM) obogaćenom sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1 posto mješavine penicilina i streptomicina (Pen/Strep, 10,000 IU/ml), glukozom i L- glutamin. Ćelije su zatim inkubirane u vlažnoj atmosferi na 37oC u 5% CO2. Kada konfluentnost ćelija dostigne 80 procenata, ćelije su subkulturisane (Public Health England, nd). Pre nego što su testovi sprovedeni, ucrtana je kriva rasta ćelija B164A5. Iz krivulje rasta dobijeno je vrijeme udvostručenja od 24 sata, pri čemu je ovaj nalaz potkrijepljen studijom Danciu et al., (2013).

MTT test

Citotoksičnost oba tipabedak sejukprema B164A5 ćelijama procijenjene su putem testa vitalnosti ćelija 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijum bromida (MTT) prema metoda Mosmanna (1983) sa malim modifikacijama. 200 µL od 5 x 104 ćelije zasijano je u 96-ploču sa ravnim dnom i inkubirano 24 sata u vlažnoj atmosferi na 37oC u 5 procenat CO2. Nakon 24 sata inkubacije, medij je odbačen i zamijenjen sa 200 µL PBS-a. Zatim su ćelije izložene UVB zračenju pri 30 mJ/cm2 u trajanju od 36,4 sekunde (Lin et al., 2002). Odmah nakon izlaganja UVB-u, PBS je odbačen i ćelije su tretirane sa obe vrste bedak sejuka u serijski razblaženim koncentracijama od 6,25, 12,5, 25, 50 i 100 g/L. Što se tiče pozitivne kontrole, ćelije su tretirane menadionom u serijski razrijeđenim koncentracijama od 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 i 1 mM prema Basri et al., (2015), dok su negativna kontrola bile netretirane ćelije. Nakon tretmana, ćelije su inkubirane još 24 sata. Nakon perioda inkubacije, 20 µL otopine MTT od 5 mg/mL dodano je u svaku jažicu i inkubirano 4 sata. Zatim je 190 µL mješavine odbačeno iz svake jažice i dodano je 200 µL DMSO i inkubirano 15 minuta. Na kraju, ploča je mućkana 5 minuta i očitavanja apsorbancije su uzeta na 570 nm pomoću čitača mikroploče. Postotak vitalnosti ćelije izračunat je korištenjem sljedeće formule: Vijabilnost ćelije ( posto )= (srednja OD tretiranih ćelija)/(srednja OD negativne kontrole) ×100

Test smanjenja antioksidativne moći željeza (FRAP).

Theantioksidanskapacitete obe vrstebedak sejukodređivani su putem FRAP testa kako su opisali Benzie i Strain (1996). To je metoda za procjenu antioksidativne moći kroz redukciju željeza (Fe3 plus) do željeznih jona (Fe2 plus) pri niskom pH koja rezultira stvaranjem obojenog kompleksa željeza-tripiridiltriazin. Prvo, FRAP radni reagens je pripremljen sveže mešanjem acetatnog pufera (30 mM, pH 3,6), rastvora gvožđa (III) hlorida (FeCl3) (20 mM) i rastvora TPTZ (10 mM) u omjeru 10:1:1 . Pripremljeni FRAP radni reagens je zatim držan u vodenom kupatilu na 37oC i zaštićen od svjetlosti. Nakon toga slijedi priprema kalibracijske krive željezo (II) sulfata (FeSO4) korištenjem serijski razrijeđenih koncentracija koje se kreću od 100 – 1,000 µM. Askorbinska kiselina je korištena kao pozitivna kontrola i pripremljena je korištenjem serijski razrijeđenih koncentracija u rasponu od 3,125 – 50 µg/mL, u mraku (Hasiah et al., 2011). Što se tiče eksperimentalnih koraka, 50 µL FeSO4, askorbinske kiseline i oba tipa bedak sejuka dodano je u njihove dodijeljene jažice u 96-ploči sa bunarima. Nakon toga, 175 µL zagrijanog FRAP radnog reagensa dodato je naknadno u svaku jažicu. Zatim je ploča inkubirana na 37oC 5 minuta. Konačno, očitanja apsorbancije su uzeta na 595 nm pomoću čitača mikroploče, a FRAP vrijednosti su izražene kao antioksidativni kapacitet ekvivalenta askorbinske kiseline (AEAC) (Gashahun i Solomon, 2019.).

cistanche prah

Statistička analiza

Za prezentaciju podataka korišten je softver SPSS v25. Podaci svakog testa iz tri nezavisna eksperimenta (n=3) izraženi su kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerni ANOVA test je korišten za poređenje između srednjih vrijednosti. Korištena alfa je 0.05, a p-vrijednost < 0,05="" se="" smatra="" statistički="">

Rezultati

Citotoksičnost Indica i Japonica bedak sejuk

Citotoksičnost oba tipabedak sejukje procijenjen u odnosu na ćelije melanoma B164A5 izazvane UVB-om putem MTT testa. Menadion, koji je korišten kao pozitivna kontrola, pokazao je citotoksičnost sa IC50 od 0.04 ± 0.02 mM (Slika 1). Svaka koncentracija menadiona bila je statistički značajna (p < 0,05)="" u="" poređenju="" sa="" negativnom="" kontrolom.="" dok="" indica="" i="" japonicabedak="" sejuk="" nisu="" pokazali="" citotoksičnost,="" stoga="" nisu="" dobijene="" vrijednosti="" ic50.="" obje="" vrste="" bedak="" sejuka="" su="" u="" početku="" imale="" smanjenje="" vitalnosti="" ćelija,="" ali="" su="" se="" postepeno="" povećavale="" kako="" se="" koncentracija="" povećavala="" (slike="" 2="" i="" 3).="" osim="" toga,="" sve="" koncentracije="" oba="" tipa="" bedak="" sejuka="" nisu="" bile="" statistički="" značajne="" (p=""> 0,05) u poređenju sa negativnom kontrolom. Rezultati su pokazali da oba tipa bedak sejuka nisu bila citotoksična za ćelije melanoma B164A5 izazvane UVB-om.

Antioksidativni kapaciteti Indica i Japonica bedak sejuk

Smanjenje sposobnosti oba tipa bedak sejuk asantioksidansiodređivani su FRAP testom. FRAP vrijednosti su izražene kao antioksidativni kapacitet ekvivalenta askorbinske kiseline (AEAC) u jedinici µg AA (askorbinska kiselina)/g bedak sejuka. Vrijednosti FRAP za 50 i 100 g/L Indica bedak sejuka bile su 0.003 ± {{ 17}}.001 i 0,004 ± 0,0003 µg AA/g bedak sejuka (Slika 4). Što se tiče Japonica bedak sejuk, FRAP vrijednosti za 50 i 100 g/L bile su 0,004 ± 0,0003 i 0,01 ± 0,0007 µg AA/gbedak sejukrespektivno, pokazujući način ovisan o dozi (Slika 4).

Kada su upoređene FRAP vrijednosti Indica bedak sejuka za 50 i 100 g/L, to nije bilo statistički značajno (p=0.803). Ali, FRAP vrijednosti Japonica bedak sejuka za 50 i 100 g/L bile su statistički značajne (p=0.006) u poređenju. Osim toga, FRAP vrijednost Japonica bedak sejuka za 100 g/L koja pokazuje najveći antioksidativni kapacitet bila je statistički značajna u poređenju sa FRAP vrijednostima Indicabedak sejukza 50 (p=0.001) i 100 g/L (p=0.003).

Diskusija

U posljednje vrijeme upotreba prirodnih proizvoda u njezi kože pokazuje sve veći trend. Dokazano je da većina ovih prirodnih proizvoda imaantioksidanskarakteristike osim što pružaju zaštitu koži od UV zraka (Abdul Wahab et al., 2014). Jedan primjer takvog proizvoda je bedak sejuk, kozmetički proizvod na bazi fermentirane riže. za generacije,bedak sejukpastile se pomiješaju s vodom i nanose lokalno na kožu kao maska ​​za lice preko noći (Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018).

U fermentaciji zrna riže za proizvodnju bedak sejuka obično su uključene bakterije mliječne kiseline (LAB), uz plijesan i kvasac (Dzulfakar et al., 2015a; Dzulfakar et al., 2016b). Upotrebakozmetičkiproizvodi koji imaju ovu komponentu LAB fermentirane riže rezultiraju proširenjem i glatkoćom proizvoda, kao i osjećajem mokre nakon nanošenja na kožu (Sawaki et al., 2010). Slično iskustvo izvještava i odbedak sejukkorisnika, pri čemu primjena bedak sejuka stvara osjećaj hladnoće (Dzulfakar et al., 2015a). Zanimljiv je i odnos između kože i fermentacije pomoću LAB-a, pri čemu LAB voda za namakanje koja se koristi tokom fermentacije pirinčanih zrna sadrži mliječnu kiselinu i druge aminokiseline koje doprinose hidrataciji kože. Ove prednosti čine LAB vodu za namakanje korisnom kao izvor kozmetičkih proizvoda. Dakle, kombinacija supstrata ili medija poput zrna pirinča i LAB sojeva može dovesti do kozmetičkih efekata kao što su antioksidativni efekti, kontrola pH i prevencija ćelijskog stresa (Izawa i Sone, 2014). Ove prednosti su u skladu sa strategijama kemoprevencije melanoma. Međutim, bedak sejuk tek treba da se istraži u laboratoriji zbog njegovog djelovanja na maligne stanice kože. Stoga, kao preliminarna studija za potencijalni agens za kemoprevenciju melanoma, ćelije mišjeg melanoma B164A5 koje su inducirane UVB su prikladan model raka.

Prvo, u MTT testu je ustanovljeno da Indica i Japonicabedak sejuknisu bili citotoksični prema stanicama melanoma B164A5 izazvanim UVB zrakama. Međutim, uočeno je da je došlo do smanjenja vitalnosti ćelija pri nižim koncentracijama bedak sejuka, praćenog povećanjem vitalnosti ćelija pri višim koncentracijama bedak sejuka. Ovo smanjenje vitalnosti ćelija može se pripisati činjenici da su UVB zraci citotoksični prema ćelijama, u ovom slučaju, ćelijama B164A5 (Pavel et al., 2017). U isto vrijeme, niže koncentracije bedak sejuka nisu bile dovoljne da povećaju broj ćelija koje su inducirane UVB-om. Bez obzira na to, smanjenje vitalnosti ćelija nije palo ispod granice od 50 posto i stoga nije bilo moguće dobiti IC50 za oba tipa bedak sejuka. Kao rezultat toga, dvije veće doze, 50 g/L i 100 g/L su izabrane kao doze liječenja za sljedeći test.

U FRAP testu je utvrđeno da je Japonica bedak sejuk imao većiantioksidanskapacitet u poređenju sa Indikombedak sejuk. Razlike se mogu objasniti činjenicom da se zrna pirinča Japonica uzgajaju u umjerenim i hladnijim područjima Azije, dok se zrna pirinča Indica uzgajaju u cijeloj tropskoj Aziji (Garris et al., 2005). Temperatura okoline igra bitnu ulogu u antioksidativnim aktivnostima biljaka, a biljke koje se uzgajaju u hladnije vrijeme imaju izraženije antioksidativno djelovanje za razliku od biljaka koje su uzgajane u toplijem vremenu. Ovo povećanje antioksidativne aktivnosti može se pripisati proizvodnji većeg broja fitokemikalija kako biljke podležu stresu po hladnijem vremenu (Kumar et al., 2017.).

Postoje i drugi proizvodi od fermentirane riže koji su pokazali obećavajuće rezultate. Prvo, tu je fermentni filtrat Galactomyces (GFF) koji je nusprodukt fermentacije riže pomoću kvasca Galactomyces. Ekstrakt GFF sadrži jedinstvenu mješavinu vitamina, minerala, malih peptida i oligosaharida koji se koriste kaokozmetičkisastojci u proizvodima za njegu kože. Ekstrakt je pokazaoantioksidanskarakteristike štiteći normalne ljudske epidermalne melanocite (NHEM) od oksidativnog stresa (Woolridge Cooper, 2018). Ovi nalazi GFF-a bili su slični nalazimabedak sejuku ovoj studiji.

Pirinčane mekinje također posjeduju snažne antioksidativne aktivnosti do te mjere da rezultiraju citotoksičnošću prema melanocitima. Ali, kada se pirinčane mekinje fermentiraju, citotoksičnost ekstrakta pirinčanih mekinja prema B16F1 ćelijama je eliminisana. Ovo pokazuje da je fermentacija mozga riže proizvela nova korisna jedinjenja sa biološkim funkcijama, iako tačna jedinjenja tek treba da budu razjašnjena (Chung et al., 2009).

Na kraju, pirinač namakanje vode iz prahabedak sejukzapravo sadrži aminokiseline koje bi mogle biti korisne u kozmetičkoj primjeni. Postoji 16 od 17 aminokiselina otkrivenih u Indica bedak sejuku, kao i u vodi za namakanje. Glutaminska kiselina je bila najveća koncentracija aminokiselina pronađena u Indica bedak sejuku i njegovoj vodi za namakanje (Johar et al., 2018.). Glutamin (derivat glutaminske kiseline), uz arginin, tirozin i lizin koji se otkrivaju u bedak sejuku i njegovoj vodi za namakanje, spadaju među glavne aminokiseline koje se koriste u kozmetičkoj industriji (Ha et al., 2018). Osim toga, aminokiseline ukozmetičkiproizvodi funkcionišu kaoantioksidansi(Ivanov i sur., 2013.) i sadržaj aminokiselina u Indica bedak sejuku bio je znatno veći u odnosu na vodu za namakanje. Stoga je primjena bedak sejuka bila efikasnija u pogledu sadržaja aminokiselina u odnosu na vodu za namakanje (Johar et al., 2018).

Ukratko, Indica i Japonicabedak sejukpotrebno je dalje istražiti prije nego što se može reći da imaju potencijal kao agens za kemoprevenciju melanoma koji može (1) spriječiti melanom, (2) spriječiti razvoj malignog melanoma iz predmalignih lezija ili (3) spriječiti ponovnu pojavu melanoma nakon uspješnog liječenja melanoma (Chhabra et al., 2017).