Cistanche Deserticolapolisaharidi ublažavaju kognitivni pad kod starijih modela miševa obnavljanjem osi crijevne mikrobiote-mozak

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

SAŽETAK

Nedavni dokazi sugeriraju da promjene u osovini crijevne mikrobiote-mozak mogu uzrokovati kognitivno oštećenjestarenje. U ovoj studiji, primijetili smo da produžena primjena D-galaktoze kod miševa izaziva kognitivni pad, mikrobnu disbiozu crijeva, perifernu upalu i oksidativni stres. U ovom modelu kognitivnog pada povezanog sa starenjem,Cistanche deserticola polisaharidi(CDPS) poboljšao je kognitivnu funkciju kod miševa tretiranih D-galaktozom obnavljanjem homeostaze crijevnih mikroba, čime se smanjuje oksidativni stres i periferna upala. Blagotvorni efekti CDPS-a kod ovih miševa u modelu starenja uklonjeni su ablacijom gutmikrobiote antibioticima ili imunosupresijom ciklofosfamidom. Metabolomski profili u serumu su pokazali da su nivoi kreatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N-etilanilina, mokraćne kiseline i prolina promijenjeni ustarenjemodel miševa, ali ih je restaurirao CDPS. Ovi nalazi su to pokazaliCDPSpoboljšava kognitivnu funkciju kod osoba izazvanih D-galaktozomstarenjemodel na miševima obnavljanjem homeostaze moždane osovine crijevne mikrobiote, što je ublažilo neravnotežu aminokiselina, perifernu upalu i oksidativni stres.CDPSna taj način pokazuje terapeutski potencijal za pacijente s poremećajima pamćenja i učenja, posebno onima povezanim s crijevnom mikrobnom disbiozom.

Click to Cistanche nuspojava protiv starenja

UVOD

Produžena primjena D-galaktoze (D-gal) i soli berilijuma izaziva starenje u eksperimentalnim životinjskim modelima i in vitro primarnim ćelijskim kulturama i koristi se za identifikaciju mehanizama koji leže u osnovi prirodnog procesa starenja [1-4]. Prethodne studije pokazuju da je kognitivni pad uzrokovan D-galaktozomstarenjemodel miševa je povezan sa smanjenim nivoima proteina faktora rasta nerava (NGF) i povećanom reaktivnom vrstom kiseonika (ROS) u mozgu, od kojih oba uzrokuju degeneraciju neurona hipokampusa i smanjuju neurogenezu [3, 4]. Nedavne studije su također pokazale da se sastav i broj mikrobiote ljudskih crijeva značajno mijenjaju tokomstarenjeproces[5].

Cistanchedeserticola je biljka koja raste uglavnom u sjeverozapadnoj pustinjskoj regiji Kine i koristi se u tradicionalnoj kineskoj medicini. Općenito je poznat kao "ženšen pustinje". Ekstrakti Cistanche deserticola sadrže nekoliko farmakološki aktivnih spojeva, uključujući feniletanoidne glikozide, iridoide, lignozu, oligosaharide, polisaharide i aminokiseline; ovi spojevi su povezani s protuupalnim, antioksidativnim, anti-senescentnim, neuroprotektivnim i imunomodulatornim svojstvima [6, 7]. Na primjer, polisaharidi ekstrahirani iz Cistanche deserticolahove korišteni su u tradicionalnoj kineskoj medicini za liječenje kolorektalnog raka [8]. Širok spektar slabo toksičnih polisaharida s korisnim bioaktivnostima izolovan je iz nekoliko organizama, kao što su Chuanqiong polisaharid, Ganoderma lucidum polisaharid i Lycium barbarum polisaharid [9-11]. CDA 0.05 je galaktoglukan izolovan izCistanchedeserticola koja potiče rast nekoliko korisnih crijevnih bakterija, uključujući nekoliko vrsta Bacteroides i Lactobacillus [12].

Osnovni mehanizmi normalnogstarenjeprocesi su također uključeni u nekoliko ljudskih bolesti kao što su neurodegenerativni poremećaji, koronarna ateroskleroza, dijabetes tipa 2 (T2DM) i hipertenzija [13, 14]. Nedavna istraživanja su pokazala da promjene u crijevnoj flori igraju značajnu ulogu u starenju ljudi [15]. Nekoliko studija je pokazalo da produžena primjena D-galaktoze kod eksperimentalnih miševa i štakora oponaša normalan proces starenja i predstavlja koristan model za proučavanjestarenje-povezani fenotipovi kao što je pad kognicije [16]. Štaviše, miševi na modelu starenja izazvanog D-galaktozom pokazuju promjene u sastavu crijevne mikrobiote [17]. Stoga smo pretpostavili da promjene u sastavu crijevne mikrobiote mogu uzrokovati kognitivni pad kod modela miševa starenja izazvanog D galaktozom, te smo istražili da liCistanche deserticola polisaharidi(CDPS) može ublažiti kognitivni pad obnavljanjem disbioze crijevne mikrobiote.

REZULTATI

Modeli starenja izazvanog D-galaktozom pokazuju kognitivni pad i mikrobnu disbiozu crijeva

Analizirali smo performanse ponašanja kod miševa divljeg tipa (WT) i onih koji su liječeni sa 150 mg D-gal po kg tjelesne težine tokom 2 mjeseca (model ili Mod) koristeći nove testove za prepoznavanje objekata i Morris vodeni labirint (MWM). Vrijednosti preferencijalnog indeksa u testu prepoznavanja novog objekta značajno su smanjene kod miševa grupe Mod u poređenju sa miševima grupe WT (Slika 1A, 1B). Rezultati MWM testa pokazali su da je vrijeme latencije bijega nakon šestog dana značajno povećano u Mod grupi u odnosu na WT grupu (Slika 1C, 1D). Štaviše, prelasci ciljnih platformi i vrijeme plivanja unutar ciljnog kvadranta značajno su smanjeni u Mod grupi u poređenju sa WT grupom (Slika 1E, 1F). Ovi rezultati su pokazali značajan pad sposobnosti učenja i pamćenja kod D gal-astarenjemodel miševa.

Zatim smo analizirali razlike u obilju i sastavu crijevnih mikrobnih tipova, rodova i vrsta u uzorcima fekalija Mod i WT grupa miševa koristeći podatke sekvenciranja 16S ribosomalne RNK (rRNA) iz fekalnih uzoraka. Dominantna crijevna flora kod miševa grupe WT i Mod bili su Firmicutes i Bacteroides. Međutim, brojnost Bacteroides je značajno smanjena, a brojnost Firmicutes je značajno povećana u Mod grupi u poređenju sa WT grupom (Slika 2A). Zatim smo izvršili linearnu diskriminantnu analizu (LDA) da bismo odredili rezultate veličine LDA efekta (LEfSe), nakon čega su uslijedili Kruskal-Wallis i Wilcoxon testovi za procjenu relativne zastupljenosti različitih taksona u miševima grupe WT i Mod. Rezultati LDA prikazani su na slici 2B. Nadalje, konstruirali smo kladograme koji pokazuju diferencijalno obogaćivanje različitih rodova i vrsta koje pripadaju tipu Bacteriodes i Firmicutes u WT i modelnim grupama (Slika 2C). Sve u svemu, naši rezultati su pokazali oštećenu kognitivnu sposobnost i mikrobnu disbiozu crijeva kod miševa na modelu starenja izazvanog D-galaktozom.

CDPS tretman poboljšava kognitivne sposobnosti kod D-gal-indukovanog modela starenja miševa

Analizirali smo da liCDPStretman ublažava kognitivni pad kod D-gal izazvanogstarenjemodel miševa. Tokom 2 mjeseca primjene, tjelesna težina je mjerena svaki drugi dan. Tjelesne težine modelske i CDPS grupe miševa bile su slične (Slika 3A). Provedite eksperimente ponašanja nakon posljednje doze. Prepoznavanje novih objekata i rezultati Morrisovog testa vodenog lavirinta pokazali su da je kratkoročno pamćenje značajno veće u CDPS grupama miševa u poređenju sa modelnom grupom miševa; dugoročna memorija u CDPS grupi miševa bila je veća, ali statistički beznačajna u poređenju sa modelnom grupom miševa (Slika 3B, 3C). Ovo sugerira da je CDPS tretman poništio gubitak kratkoročne memorije za prepoznavanje objekata kod miševa tretiranih D-gal.

Prostorno učenje i pamćenje ovih miševa procijenjeni su Morrisovim testom vodenog lavirinta, a rezultati su pokazali da je vrijeme latencije bijega odCDPSgrupa miševa bila je uporediva sa WT grupom miševa i značajno niža od miševa Mod grupe (Slika 3D). Nadalje, vrijeme kašnjenja u bijegu bilo je značajno niže šestog dana nakon primjene CDPS-a u poređenju sa modelnom grupom (Slika 3E). Vrijeme plivanja unutar ciljnog kvadranta bilo je značajno duže u CH i CM grupama u odnosu na modelsku grupu. CL grupa je viša od grupe modela, ali nema statističku značajnost (slika 3F). Štaviše, broj prelazaka preko platforme bio je značajno veći u CM i CL grupama u odnosu na modelsku grupu. Međutim, CH grupa je viša od grupe modela i nema statističku značajnost (Slika 3G). Ovi rezultati su pokazali da CDPS tretman poboljšava prostorno učenje i pamćenje kod D-gal-indukovanog modela starenja miševa.

Tretman CDPS-om obnavlja homeostazu sastava crijevne mikrobiote kod miševa na modelu starenja D-galaktoze

Monosaharidi i polisaharidi su esencijalni nutrijenti potrebni za rast bakterija [18-21]. Takođe se navodi daCDPSreguliše sastav crijevne mikrobiote [22]. Stoga smo analizirali jesu li tretmani CDPS-om ublažili mikrobnu disbiozu crijeva kod miševa modelne grupe procjenom podataka sekvenciranja 16S rRNA uzoraka fecesa iz WT, modela i CDPS grupa miševa.

Prvo smo izračunali indekse alfa raznolikosti kako bismo procijenili ukupno bogatstvo fekalne mikrobiote i strukturne razlike između ovih grupa. Analizirali smo indekse alfa raznolikosti (-diversity) kao što su promatrane vrste, vrijednosti Shannon, Chao 1, ACE i Simpson indeksa kako bismo odredili promjene u sastavu različitih vrsta bakterija u uzorcima fecesa različitih grupa miša. Indeksi -diverziteta (opažene vrste, Shannon, Chao 1, ACE i Simpson indeksi) bili su viši u WT iCDPSgrupe miševa u poređenju sa modelnom grupom, ali je statistička značajnost uočena samo za vrijednosti Chao 1 indeksa između CM grupe i Mod grupe. Pokazalo je da primjena CDPS-a povećava bogatstvo mikrobioma (Slika 4A-4E). Zatim smo analizirali indekse raznolikosti kako bismo identificirali razlike u vrstama crijevnih mikroba između WT, modela i CDPS grupa miševa koristeći nemetričko višedimenzionalno skaliranje (NMDS), analizu glavnih koordinata (PCoA) i analizu glavnih komponenti (PCA) . PCA je pokazao varijacije u mikrobnom sastavu crijeva miševa modelne grupe tokomstarenjeproces, uključujući smanjenje dimenzija i održavanje obrazaca i trendova (slika 4F). Razlike u fekalnoj mikrobioti između grupa WT, modela i CDPS identifikovane su na osnovu PCoA neponderisanih UniFrac udaljenosti za gene 16S rRNA (slika 4G). Grupna analiza je pokazala značajne razlike u NMDS između grupe modela i WT i CDPS grupa (Slika 4H).

Procijenili smo prvih 10 tipova crijevne mikrobiote i otkrili da je brojnost Bacteroides phyla značajno veća u CH, CM i CL grupi u poređenju sa modelnom grupom (Slika 4I). Ovo sugerira da je CDPS obnovio homeostazu crijevne mikrobiote kod miševa tretiranih D-gal. Kladogrami su pokazali diferencijalno obogaćivanje različitih rodova i vrsta koje pripadaju Bacteriodes i Firmicutes phyla u WT, modelu i CDPS grupama (Slika 4J). Kao što je prikazano na toplotnim kartama,CDPStretmani su smanjili relativnu brojnost Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovanih Actinobacteria, Fusobacteriia i neidentifikovane Elusimicrobia i povećali relativnu brojnost Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, neidentifikovanih_Deferribacteria, Nitrosiphaerisha, Nitrosiphania{0}, Moferribacteria, Elusilicutea i Elusimicrobia }Cijanobakterije u poređenju sa modelnom grupom (Slika 4K). Ovi rezultati su pokazali da tretman CDPS-om značajno obnavlja homeostazu crijevne mikrobiote kod D-gal induciranog modela starenja miševa.

CDPS tretman ublažava neurodegeneraciju kod D-gal induciranog modela starenja miševa smanjenjem oksidativnog stresa

Zatim smo analizirali efekte CDPS-a na upalu analizom serumskih nivoa pro-upalnih citokina (IL-2 i TNF- ) i protuupalnih citokina (IL-4 i IL-10 ) u različitim grupama miševa. Nivoi IL-2 i TNF-a u serumu su bili značajno niži, a serumski nivoi IL-4 i IL-10 su bili značajno viši u CH, CM i CL grupi u poređenju sa modelnom grupom . To je pokazaloCDPSima protuupalno djelovanje (Slika 5A-5D).

Oksidativni stres je uzrokovan povećanom proizvodnjom reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) i jedan je od glavnih faktora koji potičustarenje[23]. Stoga smo analizirali efekte CDPS-a na oksidativni stres u modelu miša starenja izazvanog D-gal procjenom nivoa antioksidativnog enzima SOD u serumu i produkta peroksidacije lipida, malondialdehida (MDA). Nivoi MDA u serumu su bili značajno viši i nivoi SOD u serumu su značajno smanjeni u Mod grupi u poređenju sa WT grupom, ali,CDPStretman je poništio ove efekte (Slika 5E, 5F). Ovi rezultati su pokazali da je oksidativni stres bio povišen kod D-gal-indukovanog modela starenja miševa, ali je smanjen CDPS tretmanom.

Nadalje, procijenili smo nivoe oksidativnog stresa u moždanim tkivima analizom nivoa naprednog oksidiranog proteinskog proizvoda (AOPP), direktne peroksidacije lipida (LPO) i MDA, kao i aktivnosti antioksidativnih enzima kao što je glutation peroksidaza (GSH-Px). ) i superoksid dismutaze (SOD) u homogenatima moždanog tkiva. Mozak miševa Mod grupe pokazao je značajno smanjenu aktivnost SOD i GSH-PX i značajno povećane nivoe AOPP, LPO i MDA u poređenju sa WT grupom, ali su ovi efekti bili obrnuti u CH, CM i CL grupi (Slike 6A-6E ).

Nadalje, izvršili smo histološko bojenje dijelova mozga H&E i Nissl bojama kako bismo procijenili zaštitne efekteCDPSna mozgu D-gal izazvanogstarenjemodel miševa. Miševi Mod grupe pokazali su značajno smanjenje broja i volumena neurona, povećan jaz između neurona, nepravilan raspored neurona i nuklearnu piknozu u CA1 regiji hipokampusa u poređenju sa WT grupom, ali su ove patološke promjene značajno smanjene CDPS tretmanima ( Slika 6F). Ovi rezultati su pokazali da CDPS tretmani značajno smanjuju oksidativni stres i patologiju mozga kod miševa na modelu starenja izazvanog D gal.

CDPS tretman smanjuje perifernu upalu i oksidativni stres održavanjem crijevne mikrobne homeostaze kod D-gal-induciranih modelnih miševa

Zatim smo analizirali jesu li promjene u sastavu crijevne mikrobiote povezane s povećanom perifernom upalom i oksidativnim stresom tijekom starenja. U tu svrhu koristili smo koktel s trostrukim antibiotikom (ABX grupa) ili ciklofosfamid (Cy grupa; također pogledajte Materijali i metode) da uklonimo crijevnu mikrobiotu ili izazovemo imunosupresiju kod CDPS tretiranihstarenjemodel miševa. Liječenje antibioticima poništilo je korisne efekte CDPS tretmana kod starijih modelnih miševa. Uočili smo oštećenje učenja i pamćenja (Slika 7A) i promjene u sastavu crijevne mikrobiote (Slika 7B, 7C) kod miševa grupe ABX u poređenju sa grupom koja je tretirana CDPS-om. Gore navedeni rezultati ukazuju da čak i administracijaCDPSne može povećati sposobnost učenja i pamćenja miševa nakon promjene crijevne flore. Štaviše, uočili smo povećane nivoe proinflamatornih citokina u mozgu i serumu miševa grupe ABX u poređenju sa grupom CDPS (Slika 7D-7N). Rezultati ABX grupe i CY grupe pokazali su da nakon što su crijevna flora i imunološka funkcija uništeni, čak ni primjena CDPS-a ne može poboljšati sposobnost učenja i pamćenja miševa. Ovi rezultati sugeriraju da liječenje CDPS-om smanjuje perifernu upalu, oksidativni stres i kognitivni pad u D-gal-induciranojstarenjemodelirati miševe sprečavanjem crijevne disbioze.

Zatim smo upotrijebili imunosupresivni lijek, ciklofosfamid [24] kako bismo odredili ulogu upale u blagotvornim efektima CDPS-a. CDPS miševi tretirani ciklofosfamidom (Cy grupa) pokazali su smanjenu sposobnost učenja i pamćenja, promjene u sastavu crijevne mikrobiote i aberantne nivoe pro- i protuupalnih citokina u mozgu i serumu u poređenju sa divljim tipom iCDPSgrupni miševi. Međutim, nema značaja u poređenju sa modelom i ABX grupom. (Slika 7A–7N). Ovi podaci pokazuju da promjene u sastavu crijevne mikrobiote povećavaju perifernu upalu u D-gal izazvanojstarenjemodel miševa.

CDPS sprečava starenje izazvano D-gal regulacijom metabolizma aminokiselina

Na imunološki sistem domaćina utiču metaboliti koje stvara crijevna mikrobiota [25]. Fekalni metaboliti predstavljaju funkcionalno očitavanje mikrobnog metabolizma crijeva i mikrobnog sastava crijeva[26]. Štoviše, metaboliti crijevne mikrobiote ulaze u krvotok i utiču na metabolizam i zdravlje domaćina [26, 27]. Ukupno 1058 metabolita je identificirano u uzorku seruma iz fWT, Mod iCDPSmiševi. Zatim smo analizirali ove metabolite koristeći BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) i Human Metabolome Database (HMDB) i otkrili da je 65 metabolita različito izraženo u Mod grupi u odnosu na WT grupu. Nadalje, otkrili smo da se nivoi 8 metabolita (kreatinin, valin, L-(-)-metionin, o-toluidin, N etilanilin, mokraćna kiselina, prolin i fenilalanin) značajno razlikuju među grupama WT, Mod i CDPS. Analiza puteva obogaćivanja ovih 8 metabolita pomoću MetaboAnalyst-a [28, 29] pokazala je da su ovi metaboliti povezani s metabolizmom arginina, histidina, arginina, prolina i purina (Slike 8A, 8B). 7 različitih metabolita MOD grupe i CDPS grupe u WT grupi.

Zatim smo analizirali jesu li promjene u metabolizmu aminokiselina povezane s promjenama u sastavu crijevne mikrobiote. Uočili smo da je 7 različitih metabolita WT, Mod i CDPS grupa (kreatinin, valin, L-(-)-metionin, o-toluidin, N-etilanilin, mokraćna kiselina i prolin) značajno smanjeno u ABX, Cy, i Mod grupe u poređenju sa WT i CDPS grupama. Štaviše, nema značaja između ABX i Cy grupa (Slika 8C). Konačno, radi istraživanja postoji korelacija između diferencijalnog metabolizma i drugih bolesti povezanih sa starenjem. Analizirali smo korelaciju između ovih sedam različito izraženih metabolita i ljudskih bolesti koristeći MetaboAnalyst bazu podataka i otkrili da su ovi metaboliti povezani sa Alchajmerovom bolešću (p=0.00173; Slika 8D, 8E). Sve u svemu, ovi podaci upućuju na toCDPSštiti od D-gal izazvanogstarenjeregulacijom metabolizma aminokiselina.

DISKUSIJA

Progresivni pad kognitivnih funkcija je karakteristična karakteristika starenja. Prethodne studije su pokazale da je tretman CDPS značajno poboljšao učenje i pamćenje kod miševa koji su stariji [30–33]. U ovoj studiji, pokazali smo da je tretman CDPS-om poboljšao kognitivne funkcije inhibicijom periferne upale i oksidativnog stresa kroz obnovu homeostaze crijevnih mikroba u D-gal-induciranoj homeostazi.starenjemodel miševa (slika 9). Sprague-Dawley pacovi hranjeni saCistanche polisaharidipokazao povećan rast korisnih crijevnih bakterija i povećanu mikrobnu raznolikost crijeva [34]. CDA-0.05, Cistanche neutralni polisaharid, poboljšao je rast probiotskih laktobacila [22]. Ovi podaci sugeriraju da polisaharidi Cistanche poboljšavaju homeostazu crijevnih bakterija.

U ovoj studiji smo to i pokazaliCDPSima protuupalno djelovanje i poboljšava kognitivne sposobnosti miševa modela koji stare modulirajući obilje crijevnih bakterijskih rodova kao što su Bacteroidetes, Firmicutes i Proteobacteria. Dakle, CDPS može biti terapeutski koristan za bolesti povezane sa starenjem preoblikovanjem sastava crijevne mikrobiote [35,36]. Štaviše, prethodne studije su pokazale da su nivoi inflamatornih citokina u serumu i debelom crevu povezani sa relativnom obiljem bakterijskih rodova kao što su Bacteroidetes, Firmicutes i Proteobacteria [37, 38]. Nadalje, mikrobni sastav crijeva reguliše funkciju mozga modulacijom cirkulirajućih nivoa nekoliko citokina [39-43]. Naši rezultati su pokazali da je tretman CDPS-om smanjio relativnu brojnost Thermoplasmata, Bacilli, neidentifikovanih Actinobacteria, Fusobacteriia i neidentifikovanih Elusimicrobia, i povećao relativnu brojnost Methanobacteria, Spirochaetia,Deltaproteobacteria, neidentificirane bakterije,Monidentifikovane bakterije,Demosferobacterije,Nikolaikurea,Monitorobacteria{8} Erysipelotrichia i neidentificirane_cijanobakterije.

Metaboliti crijevnih mikroba oslobađaju se u krvotok i reguliraju zdravlje i metabolizam domaćina [26, 27]. Metaboliti crijevnih mikroba mogu se procijeniti procjenom sastava metabolita fekalija, koji se mijenja s promjenama u sastavu crijevnih mikroba [44]. Nedavne studije su pokazale da su nivoi citrulina, prolina, arginina, asparagina, fenilalanina i treonina u plazmi povezani sa neurodegenerativnim poremećajima uključujući Alchajmerovu bolest [45, 46]. Naša studija je pokazala da su serumski nivoi kreatinina, valina, L-metionina, o-toluidina, N etilanilina, mokraćne kiseline i prolina povezani sa D-gal-induciranim nivoima.starenjekod miševa.

Urođeni i adaptivni krakovi imunog sistema igraju značajnu ulogu u održavanju homeostaze domaćina i mikroba na luminalnoj površini crijeva [47]. Intestinalna mikrobiota takođe igra značajnu ulogu u regulaciji centralnog nervnog sistema (CNS) i imuniteta oslobađanjem citokina i metabolita u krvotok [48, 49]. Proinflamatorni citokini igraju ključnu ulogu u nekoliko neurodegenerativnih bolesti [50-52]. Na primjer, makularna degeneracija (AMD) i glaukom povezani su s ekstracelularnom akumulacijom amiloida (A) i intracelularnim taloženjem hiperfosforiliranog taua (p-tau) i željeza u ganglijskim stanicama retine (RGC) [44]. Štaviše, upala igra značajnu ulogu u patogenezi povezanoj s glaukomom [53]. Oštećenje vida je rani simptom Alchajmerove bolesti (AD) i manifestuje se pre početka kognitivnog pada [54]. Naša studija je to pokazalaCDPSštiti od kognitivnog pada i periferne upale održavanjem homeostaze crijevne mikrobiote.

Postoji nekoliko ograničenja za ovu studiju. Prvo, veza između metabolizma aminokiselina i sastava crijevne mikrobiote nije dobro poznata. Drugo, sastav i molekularna struktura CDPS-a nisu poznati. Stoga su potrebne buduće studije kako bi se dalje istražila regulatorna uloga CDPS-a u ublažavanju AD kroz osovinu za signalizaciju moždane mikrobiote crijeva.

Zaključno, naša studija je to pokazalaCDPSpoboljšane kognitivne sposobnosti kod D-gal izazvanihstarenjemodel miševa obnavljanjem homeostaze crijevne mikrobiote, čime se vraća neravnoteža aminokiselina, periferna upala i oksidativni stres. Ovi nalazi sugeriraju da je CDPS potencijalni terapeutik za pacijente s poremećajima učenja i pamćenja, posebno onima povezanim s crijevnom disbiozom.

MATERIJALI I METODE

Priprema CDPS

Oko 1.0 kg očišćenogCistanche deserticolaosušen na vazduhu u pećnici na 40 stepeni C i usitnjen u sirovi prah. Prašak je ekstrahovan u vrućem etanolu 3 h. Ostatak je filtriran kroz gazu da bi se uklonio filtrat i zatim razrijeđen vodom (8X) i refluksiran uzastopno 2 h, 1,5 h i 1 h na 90°C. U svakoj vremenskoj tački, otopina je centrifugirana da se odvoji supernatant i u kombinaciji sa smeđe-crvenim filtratom. Zatim je filtrat koncentrisan pod sniženim pritiskom, ohlađen na sobnu temperaturu, polako dodan u 95 posto etanola (3X) i ostavljen da stoji na 4 stepena C tokom 24 h. Zatim je rastvor centrifugiran na 6000 r/min 20 min na 4 stepena C. Talog je sakupljen nakon ponovljene ekstrakcije vodom i triput precipitacije alkohola. Talog je rekonstituisan u vodi, deproteiniziran, dijaliziran i osušen zamrzavanjem da bi se dobio sirovPolisaharid Cistanche deserticola(CDPS). Sadržaj polisaharida bio je više od 90 posto, što je procijenjeno ultraljubičastom spektrofotometrijom.

Grupiranje životinja i tretmani

Osmosedmični mužjaci Kunming miševa (SCXK licenca br.2019-0010) kupljeni su od SPF Biotechnology Co. Ltd (Peking, Kina), smješteni u prostoriji s kontroliranom svjetlošću i temperaturom i hranjeni hranom i vodom. Svi eksperimenti na životinjama sprovedeni su u skladu sa protokolima odobrenim od strane Institucionalne komisije za negu i upotrebu životinja Medicinskog univerziteta Unutrašnje Mongolije. Eksperimenti su izvedeni prema Vodiču za brigu i upotrebu laboratorijskih životinja Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH).

Nakon jednonedeljne adaptacije na novo okruženje, 120 miševa je podeljeno u sledećih 7 grupa: (1) kontrola divljeg tipa (WT); model grupa (150 mg/Kg/dan D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kgCDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) ABX grupa: antibiotici plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Cy grupa: ciklofosfamid plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

Miševi iz grupe modela, ABX, Cy i CDPS primali su potkožne injekcije fiziološkog rastvora od 150 mg/kg D-gal svakog dana tokom 2 mjeseca. Grupi WT je subkutano ubrizgavan jednak volumen fiziološkog rastvora tokom 2 meseca. CDPS grupi miševa su također davani dnevno sa intragastričnim injekcijama koje su sadržavale 100 mg/kg, 50 mg/Kg ili 25 mg/Kg CDPS-a tokom 2 mjeseca. Miševi grupe ABX su primali vodu za piće sa 0,1 mg/mL ampicilina i 0,5 mg/mL streptomicina tokom 2 mjeseca pored D-gal iCDPSinjekcije. Prije primjene D-gal, miševi su primali injekcije koje sadrže 0.1 mg/mL ampicilina, 0.5 mg/mL streptomicina i 0.1 mg/mL kolistina tokom 7 dana u ABX grupi. Miševi Cy grupe primali su intraperitonealne injekcije od 20 mg/Kg ciklofosfamida svaki drugi dan (qod) tokom 2 mjeseca uz dnevne injekcije D-gal i CDPS.

Test za prepoznavanje novih objekata

Provedite eksperimente ponašanja nakon posljednje doze. Test prepoznavanja objekata uključivao je faze upoznavanja, obuke i testiranja. Tokom faze upoznavanja, miševi su habituirani u praznoj komori za testiranje 10 minuta dva dana. Zatim su trećeg dana (dan treninga) dva predmeta iste veličine, oblika i boje (A1 i A2) postavljena na suprotne krajeve komore. Svaki miš je tada dobio 10 minuta da istraži dva slična objekta. Nakon 1-sat (trećeg dana) i 24-sat (četvrti dan) intervala od treninga do testiranja, jedan od sličnih objekata (A1 ili A2) je zamijenjen sa B ili C predmet koji se razlikuje po veličini, boji i obliku na dan testiranja. Tokom faze testiranja, svaki miš je testiran 5 minuta i preferencijalni indeks je izračunat kako bi se odredila memorija za prepoznavanje novog objekta (B ili C) koristeći sljedeću formulu: Preferencijalni indeks=Vrijeme na objektu B ili C/( Vrijeme na objektu B ili C plus Vrijeme na objektu A)×100 posto .

Morrisov test vodenog lavirinta

Morrisov test vodenog lavirinta izveden je u okruglom bazenu koji je bio 45 cm u dubinu i 90 cm u prečniku. Protokol koji su opisali Ruediger S, et al. (2011) [55] i Wood RA, et al. (2018) [56] je ovdje bio zaposlen. Dubina vode u bazenu bila je 30 cm, a temperatura vode 20±1 stepen C. Platforma je bila prečnika 6 cm i 1 cm pod vodom. Vrijeme za obuku i testiranje je bilo po 60 s. Za obuku smo provodili četiri probe od po 60 s sa skrivenom platformom svaki dan u trajanju od pet dana uzastopno. Ako miševi nisu otkrili platformu za 60 s, vodili su ih do platforme i stavljali na platformu 5 s. Tokom faze testiranja, zabilježeno je i analizirano latencija za dostizanje skrivene platforme u obuci i probnim sesijama, broj prelazaka preko uklonjene lokacije platforme i vrijeme provedeno u ciljnom (platformskom) kvadrantu.

ELISA testovi

Nivoi proinflamatornih citokina u serumu kao što su IL-2(), IL-4, IL-10 i TNF- analizirani su za svaku grupu miševa korištenjem ELISA kompleta kupljenih od Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, Kina) prema uputama proizvođača. Aktivnost antioksidativnog enzima, superoksid dismutaze (SOD), i nivoi produkta peroksidacije lipida, malondialdehida (MDA), u serumu svake grupe miševa analizirani su setovima za analizu kupljenim od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) . Nivoi naprednih oksidacionih proteinskih proizvoda (AOPP) u uzorcima mišjeg hipokampusa procijenjeni su korištenjem ELISA kompleta iz Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Šangaj, Kina) prema uputama proizvođača.

Procjena oksidativnog stresa u mozgu miša

Homogenizirali smo 100 mg tkiva hipokampusa sa 0,9 ml ledom ohlađene fiziološke otopine i homogenat je centrifugiran na 12000 rpm 30 minuta na 4 stepena C. Sadržaj proteina u supernatantu je analiziran korištenjem BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina). Nivoi lipidne peroksidacije (LPO) i malondialdehida (MDA), te aktivnosti GSH-Px i SOD u uzorcima hipokampusa analizirani su kolorimetrijom pomoću kompleta Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) prema uputama proizvođača.

Sastav crijevne mikrobiote

Uzorci fekalija su sakupljeni od svih miševa i odmah pohranjeni na -80 stepen C. V3 plus V4 regija gena 16S rRNA je sekvencionirana korištenjem Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Peking, Kina) i analizirana pomoću QIIME otvorena platforma za određivanje profila crijevne mikrobiote.

LC/MS analiza serumskih metabolita

Uzorci seruma su inkubirani 10 minuta sa prethodno ohlađenim metanolom u omjeru 1:3 kako bi se istaložili proteini. Uzorci su centrifugirani na 12000r/min 15 minuta na 4 stepena C. Supernatanti su analizirani pomoću Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography i QExactive masenog spektra. Kromatografski uslovi su prikazani u Tabeli 1. Analiti su razdvojeni u XBridge BEH Amide hromatografskoj koloni (2,1×100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) koristeći 0,1 posto mravlje kiseline i acetonitrila kao mobilne faze A i B , odnosno. Brzina protoka je postavljena na 0,4 ml/min, zapremina injekcije je bila 5 µl, a temperatura kolone je podešena na 25 stepeni C (Tabela 1). Signali masenog spektra dobiveni su korištenjem moda skeniranja pozitivnih i negativnih jona. Napon raspršivanja jona i drugi specifični MS parametri prikazani su u tabeli 2.

Statistička analiza

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 i str< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">