Identifikacija Sitogluside kao potencijalnog agenta za smanjenje pigmentacije kože kroz mrežnu farmakologiju

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Haoran Guo,1 Hongliang Zeng,2 Chuhan Fu,1 Jinhua Huang,1 Jianyun Lu,1 Yibo Hu,1 Ying Zhou,1 Liping Luo,1 Yushan Zhang,1 Lan Zhang,1 Jing Chen,1 i Qinghai Zeng 1

Mnogi tradicionalni kineski lijekovi (TCMs) sabeljenje kozeimovine su zabilježene u Ben-Cao-Gang-Mu i u Narodni recepti, a neka literatura potvrđuje da njihovi ekstrakti imaju potencijal da inhibicionipigmentacija. Međutim, ne sistematske studije su utvrdile specifične regulatorne mehanizme potencijalnih aktivnih sastojaka. Cilj ove studije bio je da se procijene sastojci u TCM-ovima koji inhibira kožupigmentacijaputem mrežnog farmakološkog sistema i za istraživanje mehanizama. Identificirali smo 148 potencijalnih aktivnih sastojaka od 14 TCM-ova, i na osnovu prosječnog "stepena" topološki parametri, prvih pet TCM -a (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, i Paeoniae Radix Alba) koje su najvjerovatnije uzrokovalebeljenje kozekroz anti-upalne procese su odabrani. Sitogluside, najučesti sastojak u prvih pet TCM-ova, inhibira melanogenezu u stanicama humanog melanoma (MNT1) i ćelijama melanoma murina (B16F0) i snizuje kožupigmentacijau zebrafish. Nadalje, mehanističko istraživanje je otkrilo da je sitogluside sposoban da se umanjetirosinase(TYR) izraz po inhibira ERK i p38 puteve i inhibira aktivnost TYR-a. Ovi rezultati pokazuju da je mrežna farmakologija efikasan alat za otkrivanje prirodnih spoja sa svojstvima beljenja kože i određivanje njihovih mogućih mehanizama. Sitogluside je roman izbjeljivanja kože aktivni sastojak s dual regulatornim efektima koji inhibicijeTYRizraz i aktivnost.

Kliknite da bisteCistanche DHT ekstrakt za izjeljenje kože

Uvođenje

Melanin ne samo da određuje boju ljudske kože, očiju, i kose ali ima i ključnu ulogu u kamuflaži, mimikrijama, društvena komunikacija, i zaštita od ultraljubičastih zraka. Međutim, kada se melanin preprodukira i abnormalno raspodijeljeni u epidermisu, izaziva razne uvjete, kao što su pjege i melasma, što može negativno utjecati na tu je perciptivna ljepota i socijalno samopouzdanje [1]. Melanin je konačni proizvod L-tirozina nakon više koraka od enzimskih reakcija i sintetizira se u melanocitnim melanosomima [2]. U koži se melanociti nalaze u bazalnom sloj epiderme i može proizvesti i prenijeti zrele melanosomi na keratinocite, uzrokujući tako kožupigmentacija[3].TYRje glavni enzim koji ograničava stopu u melanin proizvodnja [4], a faktor transkripcije povezan s mikroftalmom (MITF) je glavni transkripcioni faktor koji regulira transkripcioni izraz TYR [5].

Nedavno, studije su pokazale da su upalni odgovori igraju važne uloge u regulaciji melanogeneze [6]. Na primjer, IL-18, proizveden od strane Langerhans ćelija, dendritic stanica, i keratinocita u epidermisu, mogu upreguliti izraza TRP-1 (protein 1 povezan s tirozinasom) i TRP-2 (protein 2 povezan s tirozinasom) aktivirajući p38/MAPK (protein kinaza aktivirana mitogenom) i PKA (protein kinaza A) putevi, tako promovirajući melanogenezu [7, 8]. TNF-α umanjuje proizvodnju melanina B16 uglavnom aktivirajući NF-κB [9]. PGe2 (prostaglandin e2), koji je izlučuju fibroblasti i keratinociti, pokazalo se da stimuliraju razlučivanje dendritičke ćelije i iniciraju AKTIVNOST TYR-a u melanocitima kroz cAMP (ciklički adenozin monofosfat) i Plc (fosfolipaza c) signalizirajuće puteve [10]. PIH (postinflammatory hyperpigmentation) je vrsta reaktivne melanizacije kože [11]. Razne kožne bolesti, trauma, ili kozmetička operacija često vode dopigmentacijazahvaćenog područja, posebno kod osoba boje [12]. Pacijenti sa PIH obično snose neizmjetan psihološki stres, koji u teški slučajevi, negativno utiču na njihov kvalitet života. Stoga određeni lijekovi koji reguliraju upalu koriste se za liječiti PIH i druge bolesti koje uzrokuju hiperpigmentaciju. Na primjer, resveratrol, koji je smanjio upalni oštećenja u HaCaT ćelijama [13], pronađeno je da inhibicije melanina sinteza putem vancelijskog signala-regulacije kinaze 1/2 and signaling of phosphoinositide 3-kinase/Akt [14].

Izjeljenjeagensi, kao što su hidrokinon (HQ) i vitamin C, tradicionalno se koriste za liječenje pigmentacije [15]. HQ je hidroksifinol sa snažnim inhibitorijnim dejstvom na melanogeneza. Međutim, zbog raznih nuspojava kao što su iritantni ili alergijski kontaktni dermatitis, promenljiva noktiju, i oљteжenim zaceljenjem rana, upotreba HQ-a je ograniиen [16, 17]. Vitamin C inhibicijeTYRinterakcijom s bakrenim iona na aktivnim mjestima TYR-a, i time se snizuje melanogeneza. Međutim, vitamin C je nestabilna u gotovim proizvodima. U osim toga, ako je koncentracija vitamina C višu od 20%, može izazvati iritaciju kože [18]. Stoga, prirodna sastojci iz širokog spektra izvora koji su sigurni, učinkoviti, vrlo stabilni, i laki za pohranu su u visokoj potražnji.

Nedavno je za više sastojaka TCM-a učinkovit u inhibicije kožepigmentacija, kao sto je apigenin i paeoniflorin [19–21]. TCM-i sa aktivnošću izbjeljenja opisani u Ben-Cao-Gang-Mu su naširoko korišteni kao tajni recepti u Kini, a danas se potvrđuje da imaju efekt inhibicije pigmentacije. Na primjer, ekstrakt Hedysarum multijugum Maxim (rizom od Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge) uzrokuje izbjeljenje kože inhibijući ERK put [22]. Suhi ekstrakt od Typhonii Rhizoma (rizom Sauromatum gigan-teum (Engl.) Cusimano i Hett.) mogu učinkovito inhibirati tirosinaseaktivnost in vitro [23]. I zasnovano na dokazima medicina je također potvrdila da ekstrakt Sapindija Mukorossi Semen (plod Sapindus mukorossi Gaertn.), koji inhibiraju aktivnost tirozinaze, ima potencijal da bude koristi kao lijek i kozmetički dodatak [24]. Neki tradicionalni narodni recepti, iako se ne sačinjavaju u kompendij, također se naširoko koriste. San-Bai-Tang (SBT) je tipičan primjer. Ti i ja smo demonstrirali da se SBT može sniziti. proizvodnja melanina inhibicijama p38/MAPK signalizacije put i TYR aktivnost [25]. Ostali TCM-i opisani u pokazalo se da neki recepti imajuizjeljenje kozeEfekte. Coicis Semen (samje Coix Aquatica Roxb.) ekstrakt inhibira proizvodnju melanina snižavajući MITF, TYR, TRP-1, i TRP-2 [26]. Štaviše, ćelija assay ofTYRpokazala da je ampelopsis japonica (rizom od ampelopsis japonica (Thunb.) Makino) je inhibirao aktivnost gljiva TYR za više od 50% [27]. U izbjeljenje TCM-ova zabilježenih na ovim drevnim receptima dokazano je da su učinkovite od strane modernih eksperimentalnih tehnike, ali se većina njih verificira u obliku ekstrakti, a aktivni sastojci koji rade nisu jasni. To je probudilo naše interesovanje za aktivne sastojke TCM-a sa efektima beljenja zabilježenim na drevnim receptima.

Osim toga, TCM-i ili recepti imaju složene sastojke, raznolike modove djelovanja, i nepoznate aktivne sastojke. Osim toga, nedosljednost faktora kao što su kvalitet sirovina, metode prerade, priprema tehnike, kompatibilnost sastojaka koji se koriste u sastavu, a oblici doze imaju veći uticaj na od TCMs [19, 28]. Stoga, uvažanje određenih TCM-ova sabeljenje kozeefekti su ograničeni. Stoga je hitno identificirati aktivne sastojke s potencijalnim efektima izboja na kože, putem sistematskog skriinga kako bi se osigurala sigurnost, učvršćenost, i stabilnost ovih sastojaka.

Posljednjih godina primjena sistemske biologije u polje TCM-a je napravilo veliki napredak. Mrežna farmakologija TCM-a je nova unakrsna disciplina koja kombinira Pharmacology of TCMs with network science, system biology, computational science, and bioinformatics [29]. To je u potpunosti razumije složenost između lijekova, bolesti, i bioloških sistema iz perspektive mreže "kompleks-protein/gen-bolest" [30]. Mrežna farmakologija je efikasan i sistematičan alat za proučavanje farmakološkog djelovanje, mehanizam, sigurnost, i druge aspekte biljne medicine, posebno TCM-ova, te pruža vrijedne uvide za trenutno otkriće droge [31, 32].

izjeljenje koze

2. Materijali i metode

2.1. Mrežni farmakološki proces

2.1.1. Zgrada baze podataka za hemijske sastojke

Tok grafikon proucenog eksperimentalnog programa prikazan je u Figura 1. TCM-i sa anti-pigmentacijnim efektima, opisani u Ben-Cao-Gang-Mu i na narodnim receptima, bili su koristi se za mrežnu farmakološku analizu. Typhonii Rhizoma, Ricini Semen, Hedysarum multijugum Maxim., Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, and Sapindi Mukorossi Semena, opisana u Ben-Cao-Gang-Mu, suizjeljenjei zuta svojstva spuštanja i mogu ukloniti mrlje lica i krtice. Poria cocos (Schw.) Wolf (sclerotium of Smilax china L.), Paeoniae Radix Alba, i Atractylodes macrocephala Koidz (rhizome Atractylodes macrocephala Koidz.) koje su konstituenti SBT-a poznato je da poboljšati teksturu kože i smanjiti kloazmu ipigmentacija. Ostala tradicionalno zabilježena bilja, kao što je Bletilla striata (Thunb. Murray) Rchb.F. (rizom Bletilla striata (Thunb.) Rchb.F.), Ampelopsis japonica, A. dahurica (Fisch.) Benth. Et Hook (rhizome of Angelica dahurica (Hoffm.) Benth. i Kuka.f. Bivši Franch. i Sav.), Atractylodes lancea (Thunb.) Dc. (rhizome of Atractylodes lancea (Thunb.) DC.), Fructus Ligustri Lucidi, i Coicis Semen, također su bili uključeni u ovu studiju. Zbog velikog broja TCM-ova uključena u ovu studiju, više kineskih medicina baze podataka projekcije će izazvati zabunu u obradi podataka. Mi samo koristiti tradicionalnu kinesku medicinu Pharmacology (TCMSP) bazu podataka, najčešće korištenu bazu podataka, za praćenje prikazivanja. Hemijski sastojci ovih TCMs su pretražene u TCMSP (ažurirano 24. aprila, 2020) [33]. Naličnost na drogu (DL) i oralna bioavailability (OB) su obično korišteni parametri za screening. Topical ili sistemski lijekovi su uobičajeni tretmani za bolesti pigmentacije kože; stoga smo koristili samo DL kao screening kriterij. Odlični kompleksi sa DL > 0:18 izabrani su da povećaju stopu udara kandidata za drogu.

2.1.2. Raskrižje između ciljnih gena TCM-ova i Pigmentation-Associated Genes.

Skup gena pridruženpigmentacijaizabran je na osnovu GeneCards baze podataka (ažurirano 24. aprila 2020. godine), iz kojih su ciljevi sa izabran je rezultat gen-bolesti > 1. Na kraju, 6180 identifikovane su mete vezane za pigmentaciju. Sjecišta između ciljnih gena TCM-a i gena povezanih s pigmentacijom je ilustrirana pomoću Venn dijagrama [34].

2.1.3. Izgradnja aktivnog spoja-cilj-put Mrežni.

Aktivni sastojci i regulirani ciljni geni bili su screened prema rezultatima Venn dijagrama. U mreža je konstruirana pomoću Cytoscape softvera [35] i korištena je za označavanje odnosa između aktivnog spoja TCM-a i ciljnih genapigmentacija. Svaki ciljni gen reguliran aktivnim sastojkom u TCM je smatran jednim "stepenom". Prosječan "stepen" topološki parametri svakog TCM-a korišteni su za procjenu važnost odabranih TCM-ova. Spojeva su rangirana, a prvih pet TCM-ova je odabrano za ključne analize. Nadalje, detaljne informacije o potencijalnim aktivni sastojci prijavljeni za regulaciju pigmentacije je bio Analizirali.

2.1.4. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome (KEGG) Analiza obogaćivanja ciljnih gena regulisana Potencijalno efektivne TCM-e.

Ciljni geni regulirani od strane prvih pet TCM-ova je odabrano za određivanje KEGG mete puteva i istražiti moguće mehanizme potencijalno učinkovite sastojke u ovim TCM-ovima protivpigmentacija. DAVID bioinformatički resursi 6.8 korišteni su za analizu obogaćivanje KEGG ciljnih puteva. Simboli gena potencijalnih ciljeva efektivnih aktivnih sastojaka su učitane. Dobiveni identifikatori gena su tada preuzeto i ušlo u KOBAS3. Gen koji se prilagodio izabrane su p vrijednosti manje od 0,05.

2.1.5. Simulacija molekularnog doka.

2D strukture sitogluside, arbutin, nikotinamid, HQ, kojic kiselina, i askorktinska kiselina su dobiveni iz PubChem baze podataka. U mehaničke strukture malih molekula su optimizirane koristeći ChemBio3D Ultra 14.0. 3D kristalna struktura gljivaTYR(PDB ID: 2Y9X, koordinate za prisijanje: X = −8:87, Y = −30:74, a Z = −41:52) dobiven je iz Protein Data Bank (PDB) database [36]. 3D kristal strukture šest membranskih receptora (opioidni u receptor, PDB ID: 4DKI; melanokortin 1 receptor, PDB ID: 2L1J; endotelin B receptor, PDB ID: 5GLI; adrenergicni β receptor, PDB ID: 4GBR; prostaglandin receptor, PDB ID: 6D26; stem receptora faktora ćelija, PDB ID: 2EC8) dobiveni su iz PDB baza podataka. Proteinske strukture su pripremljene koristeći AutoDock Tools uklanjanjem molekula vode, dodavanjem vodika, i stvaranje veza nultog reda sa metalima i disulfidne obveznice. Na kraju, simulacije molekularnog prisiljavanja su bile izvedeno pomoću AutoDock Vina 1.1.2 [37], a rezultati analizirani su pomoću PyMoL 1.7.2.1.

2.2. Eksperimentalna validacija

2.2.1. Hemikalije i antitijela.

Sitogluside (čistoća ≥ 98%) je kupljen od ChemFaces (#CFN98, 713, ChemFaces). Dimetilsulfoksid (DMSO) je kupljen od Sigma-Aldrich. Neutralni paraformaldehid (4%) je kupljen od Biosharpa (Hefei, Kina). Kojic kiselina, Fontana-Masson Stain Kit, natrij dezoksiholat, i LDOPA su kupljeni od Solarbio (Peking, Kina). Dulbeckov modificirani Eagleov medij (DMEM) je kupljen iz Gibco (#C11995500BT, Gibco). Fetalni serum goveda (FBS) i Cell Counting Kit-8 (CCK8) su kupljeni od BI (Kibbutz Beit-Haemek, Israel). PMA (12-O-tetradekanoil phorbol-13-acetat, ERK/MAPK aktivator) je kupljen od APExBIO (#N2060, APExBIO). Anisomicin (p38/MAPK activator) je kupljen od MedChemExpress (HY-18982, MedChemExpress). Primarna antitijela protiv proteina vezanog za RAS Rab-27A (RAB27A) (#69295, CST), vancelijska signalno regulirana kinaza (ERK) (#4695, CST), p-ERK (#4370, CST), c-Jun N-terminal kinaza JNK (#9252, CST), p-JNK (#4668, CST), p38 (#8690, CST), p38 (#4511, CST), cAMP odgovor element-vezani protein CREB (#9107, CST), i p-CREB (#9198, CST) su kupljeni od Cell Signaling Technology. Primarna antitijela protiv TRP1 (ab235447, Abcam), TRP2 (NBP1-56058, Novusbio), MITF (STJ94134, laboratorij Sv.TYR(BS1484, Bioworld), i GAPDH (#AP0066, Bioworld) Kupljeni su od Abcama, Novusbioa, Laboratorije Sv. Johna, odnosno Bioworlda.

2.2.2. Cell Culture and Treatment.

MNT1 i B16F0, koji su bogati melanosomima, naširoko se koriste za proučavanje melanogeneze [38]. S tim uh, ove dvije ćelijske linije su izabrane za naknadno eksperimente. MNT1 i B16F0 ćelije su bile kulturan u 20% ili 10% fetusnog seruma goveda (Biološki Industrije, Izrael) i 1% penicilin-streptomicin (Gibco) u DMEM-u. Sve ćelije su bile kulturane u mokram inkubatoru u 37° C i 5% CO2. Sitogluside je otopio u DMSO, a konačna koncentracija DMSO-a bila je<0.1%. pma="" and="" anisomycin="" were="" separately="" dissolved="" in="" dmso,="" and="" the="" final="" concentration="" of="" dmso="" was=""><>

2.2.3. Zebrafish Culturing and Treatment.

Zebrafish embrioni a kulturni medij su kupljeni od EzeRinka Biotech (Nanjing, Kina). Eksperimentalni protokol je odobren od strane Etičkog komiteta Treće Xiangya bolnice Central South University (no. 2021-S137). Prvog dana poslije izleganje, zebrafish su gajeni u tanjuru od 12 dobrota (10 po pa), zaštićen od svjetlosti, a kulturan na 37° C. Zebrafiš se liječio različitim koncentracijama sitogluside, i fotografije su snimljene pomoću obrnutog mikroskopa na 24 h intervala za snimanje promjena melanina u repovima zebrafish. Nakon što su slike snimljene, sitoglusid otopine različitih koncentracija su pročitane i snimljene neprekidno jednu sedmicu.

2.2.4. Održivost ćelija.

Održivost ćelija je ocekivana pomoću CCK8. MNT1 i B16F0 ćelije su bile tanjirane u 96-dobrom tanjuru na density of 2000 cells/well or 500 cells/well. Ćelije su bile liječe različitim koncentracijama sitoglusidea (25, 50, 100, 200, 400, 600 i 800 μM). Nakon 24 h ili 48 h, 10 μL od CCK8 reagenta je dodan svakom dobrom, a ćelije su bile inkubiran na 37° C za 1 h. Kada je boja medija narandžasta, kultura je prekinuta, i mikroplata čitač (PerkinElmer EnVision Xcite, UK) je korišten za mjerenje apsorbcije na 490 nm.

2.2.5. Fontana-Masson Melanin Staining.

Ćelije su bile kulturane u 6-dobrom tanjuru i tretirani različitim koncentracijama sitogluside 2 dana, a kojic kiselina kao pozitivna kontrola bila je dodano na 200 μM. Ćelije su tada bile 4% paraformaldehida 15 min. Nakon ispiranja vodom, ćelije inkubirali su fontanom amonijak-srebro rješenje za 24 h u tamnoj komori, ispranoj vodom, a zatim 24 h u tamnoj komori, ispranoj vodom, a zatim u hiposulfitu dodatnih 5 min. Obrnuti mikroskop je korišten za promatranje melanina.

2.2.6. Eksperiment oporavka funkcije.

PMA, kao priznata aktivator ERK/MAPK [39, 40], testiran je na cistotoksičnost kroz CCK8 eksperiment u različitim koncentracijama (6,25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, i 800 ng/mL) 24 sata. I nakon što su MNT1 i B16F0 ćelije tretirane različitim koncentracije (25, 50, i 100 ng/mL) PMA u 2 sata, fosforilacijsku razinu ERK-a je otkrio zapadni eksperiment blotting. Na odabranoj koncentraciji, ćelije liječe se sa 0, 1, 2, 4, 6, i 8 sati kako bi se detektirao efektivno vrijeme aktivacije. Nakon što su ćelije tretirane sa sitogluside (200 μM) i PMA (25 ng/mL) 48 sati (povlačio svakih 8 sati), proteinske razineTYRi P-ERK su otkriveni. Fontana-Masson melanin mrlja detektirao sadržaj melanina. Anisomicin [41] je aktivator p38/MAPK, od kojih je koncentracija istraživanja 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 i 512 nM, a ostale eksperimentalne metode su iste kao PMA.

2.2.7. MJERENJA AKTIVNOSTI TYR-a.

Ćelije su tretirane sa različite koncentracije sitoglusidea 2 dana. Poslije probave i centrifugacije, ćelije su prebrojane i dva puta u fosfatno-baferiranoj otopini (PBS). Sljedeći Dodano je 500 μL od 0,5% otopine natrijevog deoksikloata svaki uzorak. Uzorci su inkubirali na 4° C 10 min a zatim na 37° C za 15 min. 1 mL od 1% L-DOPA otopine dodat je, nakon čega je 200 μL odmah pipetirano u ploču od 96 dobro. Naknadno, multimode ploča čitač je korišten za mjerenje vrijednosti apsorbatora (A0) na 475 nm, a mjerenje je ponovljeno nakon 30 min (A30).TYRaktivnost je izračunata kao (A30-A0)/broj ćelije.

2.2.8. TYR Activity Sonda.

Blisko infracrvena fluorescencija sonda zaTYRaktivnost zasnovana na resorufinu korištena je za vizualizaciju aktivnosti u živim ćelijama, kao što je prethodno opisano [42]. Ukratko, MNT1 i B16F0 ćelije su bile kulturane u 6-dobrom ploča i tretirana različitim koncentracijama sitogluside 2 dana. Dodana je sonda fluorescenciju od 10 μM, a nakon 4 h, ćelije su zamijenjene PBS-om. Nakon što je crveno svjetlo bilo uzbudljivo, fluorescentni invertni mikroskop je odmah bio nekada su slikali.

2.2.9. Ekstrakcija proteina i zapadno blotiranje.

Nakon ćelija liječe se različitim koncentracijama sitogluside za 2 dana, ukupan ćelijski protein je ekstrahiran pomoću RIPA Lysis Buffer (Thermo Fisher) and the Protease Inhibitor and Phosphatase Inhibitor cocktails (Roche). Protein koncentracija je određena pomoću BCA proteinske assay kit (KeyGEN Biotec). Nakon blokiranja sa 1% BSA, primarna antitijela protivTYR, MITF, TRP1, TRP2, RAB27A, CREB, p-CREB, ERK, p-ERK, JUK, p-JUK, p38, i p-p38 su inkubirali s membranama preko noći na 4° C na 1: 1000 i GAPDH u 1: 3000. Membrane su bile oprana TBS-T i inkubiran sa kozjim anti-zec sekundarnim antitijela na 1: 3000 za 1 h. Vezano protutijelo detektiran je elektrohemiluminescence (ECL).

2.2.10. Statistička analiza.

SPSS22.0 softver je korišten za statističke analize, i Studentov t-test ili jednosmjesna analiza varijancije (ANOVA) je korištena za više grupnih usporedbi. Mann-Whitney U test je korišten za neparametrijske podatke. p< 0:05="" in="" all="" cases="" was="" considered="" statistically="" significant.="" ∗∗∗p="">< 0:001,="" ∗∗p="">< 0:01,="" and="" ∗p=""><>

3. Rezultati

3.1. Kompozite Sastojci TCM-a.

14 TCM-ova, snimljena u Ben-Cao-Gang-Mu i na narodnim receptima, sa anti-pigmentacijnim učincima su proučavani. Ukupno je 372 sastojaka kineske medicine iz 14 TCM-ova preuzetih iz TCMSP baze podataka (dopunska tabela S1).

3.2. Target Genes Regulated by TCMs and Related Pigmentacioni geni.

Prema predviđanjima mete sistem u TCMSP bazi podataka, ukupno 834 ciljnih gena od 14 TCM-ova su dobiveni. Ukupno 9431 gena vezano zapigmentacijasu dohvatene iz GeneCards baze podataka, od kojih je izabrano 6180 i imalo je ocjenu > 1.

3.3. Rang-14 TCM-ova i Bolest-Spoj-Cilj Mrežni.

Koristeći Cytoscape softver, uzeli smo raskrižje regulatornim genima svakog TCM-a i gena povezanih s pigmentacijom i dobivenih potencijalnih aktivnih sastojaka i zajedničkih ciljnih gena. Dalje, ciljna mreža spoja bolesti između TCM-a ipigmentacijaje konstruisan. Na osnovu ovoga, dobili smo prosečan "stepen" svakog aktivnog sastojka i rangirali TCM-ove prema do njihovih rezultata. Prema ocjenama ranga, top 5 bilja bili su Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, i Paeoniae Radix Alba (figura 2(a)). Kroz KEGG analizu 220 ciljnih gena prvih 5 TCM,19,3% gena bili bogati signalnim putem PI3K-Akt, 13,6% geni su bili povezani sa TNF signalnim putem, i oko 12,3% gena je bilo povezano sa IL-17. Osim toga, 37 gena bili uključeni u PUT MAPK i 28 gena je bilo uključeni u HIF-1 put. Ovi putevi su pažljivo odnose se na regulaciju metabolizma melanina i kože fotoaging. Među prvih 20 obogaćenim signalnim putevima, putevi vezani za upalu su naišli na jednu četvrtinu od ovih (slike 2(c)). Slike 2(d)–2(h) prikazuju mrežu spoja bolesti između Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, Paeoniae Radix Alba, i pigmentacija, odnosno. Prema Venn dijagramu od sastojaka u prvih pet TCM-ova, otkrili smo da su četiri TCM-i su sadržavali sitogluside i beta-sitosterol (na dopunski tabela S2).

3.4. Potencijalni aktivni sastojci u inhibiciji pigmentacije.

Prema toj mreži, 148. sastojci koji se odnose napigmentacijadobiveni su od 14 TCMs. Kroz potragu za literaturom, 25 od 148 sastojaka prijavljeno je da inhibiciju melanogeneze. Četiri aktivna sastojka su prijavljena kao biljni ekstrakti koji inhibijuju melanogenezu. Četrnaest aktivnih sastojaka je proučavano, a njihovi izvedenice su prijavljene da reguliraju pigmentaciju. Zanimljivo je da su četiri sastojka promovirala melanogenezu, dok je mehanizam šest sastojaka u regulaciji melanogeneza je još uvijek nejasna. Preostalih 95 potencijala Kineski ljekoviti sastojci još nisu istraženi za regulaciju pigmentacije. Detaljne informacije na ovim sastojcima je dat u dopunski Stol S3.

3.5. In Vitro i In Vivo Učinci Sitoglusidea na Melanogeneza.

Nakon gore navedenog procesa skriinga, pronašli smo da su četiri TCM-a u gornjim TCM-ovima sadržavali sitogluside i β-sitosterol. β-Sitosterol je prijavljen da inhibicije alfa-melanocit-stimulirajući hormon (α-MSH), stimulirajući melanogenezu putem signalizirajućeg puta p38 u B16F10 melanomske ćelije [43]. Međutim, anti-pigmentacija efekti sitoglusidea i njegovog specifičnog mehanizma nisu prijavljeno. Stoga smo izabrali sitogluside kao kandidata za drogu za ove studije. CCK8 atentat je izvršen kako bi se istražite potencijalne otrovne koncentracije sitogluside u MNT1 i B16F0 ćelije. Rezultati su pokazali da sitogluside nije imao očigledan učinak na proliferaciju ćelija (Figure 3(a) i 3(b)) pri koncentracijama ispod 400 μM. Fleka melanina obavljena pomoću 25, 50, 100, i 200 μM sitoglusid je pokazao da sitogluside može smanjiti sadržaj melanina u ćelijama MNT1 i B16F0 na način zavisan od doze (Na 3. Nadalje, liječenje sitoglusidom je značajno inhibirao kožupigmentacijakod zebrafiša u vremenu i na način zavisan od doze (figura 3(d)). Ovi rezultati sugerisalo da je sitogluside inhibirao melanogenezu in vitro i in vivo.

3.6. Effects of Sitogluside on TYR Expression.

Iz prethodnih rezultata, sitogluside može učinkovito smanjiti sadržaj melanina, ali kako regulira ovaj proces je još uvijek nepoznat i stoga od interesa. Zapadno blotting je izvedeno da detektira izraz gena povezanih s melanogenezom (TYR, MITF, TRP1, TRP2 i RAB27A) na nivou proteina. Rezultati analiza su dokazali da je tyr izraz znatno snižen, a MITF i TRP1 izrazi su bili umjereno sniženi nakon sitoglusidea liječenja (na 4. Pošto su MAPK i PKA ključ uzvodno signalne puteve koji regulišu TYR, dalje istraživao promjene ključnih proteina u ova dva puta. Nakon što su MNT1 i B16F0 ćelije tretirane sitoglusidom 2 dana, razine fosforilacije ERK-a i P38 bile su značajno snižena, dok nije bilo značajnih promjena u ukupnom nivou CREB-a, ERK-a, JNK-a, i p38 proteina ili razine fosforilacije JNK i CREB (4(b), S1A). Prema rezultatima CCK8 eksperiment, otkrili smo da PMA ispod 100 ng/mL nije otrovne za obje ćelije (slična S1B), a 25 ng/mL PMA može Ocigledno povecati nivo fosforilacije ERK-a. U fosforilacijska razina ERK postupno se sniћavali nakon 4 sati (sliv S1C-D). Kroz Fontana-Masson melanin mrlja, otkrili smo da PMA može značajno povećati sadržaja melanina MNT1 i B16F0 ćelija. Zapadna rezultati blottinga također sugeriraju da PMA može upreguliti razine fosforilacije ERK-a, a sitoglusajd može smanjiti nivo fosforilacije ERK-a koji je upregulirao PMA. Pored inhibirajući nivo fosforilacije ERK-a i smanjenje proteinski nivoTYR, sitogluside smanjuje melanin sadržaj povećan pma (figure 4(c) i 4(e), Figure S2A). U isto vrijeme, pronašli smo da anisomicin ima slične rezultate. Anisomicin ispod 8 nM nije otrovan za obje ćelije, a 2 nM anisomicin može značajno povećati fosforilacijski nivo p38. U 8 sati, fosforilacijska razina p38 je još uvijek visoka (figura S1B, Figure S1E-F). Rezultati Fontana-Masson melanina mrlja i zapadno blotiranje također sugeriraju da sitogluside može inhibirati fosforilacijski nivo p38 nepregulisanog anisomicinom, smanjujući sadržaj TYR proteina, i inhibicijepigmentacija(Figures 4(d) and 4(f), Figure S2B). Stoga, sitogluside može smanjiti TYR izraz za inhibicije ERK/MAPK i p38/MAPK puteva. Međutim, mehanizam kojim sitogluside inhibicije Ovi signalni putevi ostaju nejasni. Pratili smo uzvodno membranski receptori ovih signalnih puteva i koristila molekularno prisipanje za istraživanje mehanizma regulišu nizvodne puteve. Vezivajuće energije između sitogluside i šest membranskih receptora, viz. opioid u, melanokortin 1, faktor stem ćelija, endotelin B, adrenergic β, a receptori prostaglandina su bili -7,8, -5.8, -5.5, -5.4, -3.4, odnosno 0 kal/mol. Kroz molekularno pristajanje, otkrili smo da među šest membranskih receptora, sitogluside je imao vrlo visoke afiniteta sa opioidom u, melanokortinom 1, i rastom stem stanica faktorskih receptora (figura 4(g)). Nagađamo da sitogluside može inhibirati puteve ERK/MAPK i p38/MAPK putem vezivanje za ranije pomenute membranske receptore, time se umanjuje TYR izraz.

3.7. Efekat Sitoglusidea na TYR Activity.

OtkadTYRje kljucni enzim u sintezi melanina , on je najistaknutija meta za inhibiciju melanogeneze. Najkomercijalnije dostupne kozmetike ili agensi za munjenje kože, kao što su HQ, arbutin, i kojic kiselina, su TYR inhibitori. Koristili smo sitogluside i neke klinički korištenebeljenje kozeagensima (arbutin, nikotinamid, kojic kiselina, HQ, i askorkbicna kiselina) da Provesti molekularno prisijanje sa TYR-om. Detaljne interakcije između sitoglusidea i gore spomenutih agenata saTYRprikazani su na 5.(a). Vezivajuće energije od ovih šest spoja bili su -6,2, -6,4, -5,6, -5,7, -5,4, i -5,4 kcal/mol, odnosno. Generalno se vjeruje da kada je energija afiniteta -4, ukazuje na obavezujuću silu, i kada je ≥-7,0, ukazuje na jaku obavezujucu silu. Sitogluside je bio drugi po afinitetu, nešto slabiji od arbutina, izlažući relativno izvanrednu sposobnost kombinacije.

U isto vrijeme, L-DOPA eksperiment za konverziju je bio koristi se za otkrivanje aktivnosti TYR-a, koristeći kojic kiselinu kao pozitivnu kontrolu. Rezultati su pokazali da je sitogluside inhibirao AKTIVNOST TYR-a u ćelijama MNT1 i B16F0 na način zavisan od koncentracije, a grupa visoke koncentracije (200 μM) pokazala je ekvivalentni inhibitorijni učinak tom prikazana sa 200 μM kojic kiseline (figure 5(b) i 5(c)). U osim toga, rezultati eksperimenta tyr sonde pokazali su da kako je povećana koncentracija sitogluside, fluorescencija intenzivnost se postepeno umanjala u ćelijama, a fluorescenciju intenzivnost grupe visoke koncentracije bila je blizu toga od 200 μM kojic kiseline u ćelijama MNT1 i B16F0 (5(d), S2C). Ovi rezultati upućuju na to da sitogluside može učinkovito inhibiTYRaktivnost u MNT1 i B16F0 ćelije. Štoviše, nagađamo da sitogluside, kao prirodni sterol spoj, može direktno prodrijeti u ćeliju membranu i veže za TYR i inhibira njegovu aktivnost, time inhibiciju melanogeneze.

4. Diskusija

U ovoj studiji koristili smo mrežnu farmakologiju za istraživanje mehanizmi potencijalabeljenje kozepronađeni sastojci u 14 TCM-ova, dokumentiran u Ben-Cao-Gang-Mu i u narodni recepti , u inhibicijipigmentacija. Studija je također predložio inovativnu metodu koja koristi prosječan "stepen" topološki parametar svakog aktivnog sastojka da procijeniti potencijalnu učinkovitost bilja. Prema do prosječnog "stepena", Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, a Paeoniae Radix Alba su odabrana, a kroz KEGG analizu obogaćivanja geni regulirani ovih pet TCM-ova, to je bilo neočekivano da je 25% obogaćenim signalnim putevima bilo povezano za upalu, uključujući IL-17, TNF, HIF-1, PI3K-Akt, i MAPK signalnim putevima.

Nedavno su razne upalne posrednike pokazuje da aktivira ili inhibira signaliziranje povezano s melanogenezom puteva koji promiče ili inhibira kožupigmentacija[6]. U kulturan B16F10 stanica melanoma, TNF-α smanjio je izrazTYRi aktivnost TRP1 i TYR na način zavisan od doze [44]. IL-17 i TNF-α mogu smanjiti ekspresija gena vezanih za melanogenezu u melanocita, i IL-17 mogu značajno poboljšati inhibitorijalno dejstvo TNF-α na melanogenezi. Nakon liječenja etanerceptom (anti-TNF), geni povezani s melanogenezom bili su značajno upreguliran u kožnim lezijama bolesnika s psorijazom [45]. HIF-1, snažan transkripcioni faktor koji regulira upalni odgovor, prijavljeno je da je uključen u regulaciji faktora kao što su IL-17 i TNF-α [46–48]. Stoga, HIF-1 će, po svojoj priči, učestvovati u regulaciji melanogeneze uticanjem na upalu. Ostali citokini kao što su IL-18, IL-33, GM-CSF, i IL-1α može promovirati melanogenezu aktivirajući PKA, MAPK, ili druge signalne puteve, dok IFN-γ, IL-1β, IL-4, i IL-6 smanjuju melanogenezu inhibijući STAT1, NF-κB, i JAK2-STAT6 signalnim putevima [6]. Naši nalazi predlažem da prvih pet TCM-ova (Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum Maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, and Paeoniae Radix Alba) mogu da iznude anti-pigmentacioni efekat uglavnom putem anti-upalne puteve. Spomenuta je i prethodna literatura da ovih pet najboljih TCM-ova imaju snažne anti-upalne i antiaging efekata [49, 50]. To također podržava naše pretpostavke da TCM-i mogu igrati ne-zanemarivu ulogu u postinflammatory pigmentaciji.

Dok je perusing literature 148 sastojaka pronađenih u 14 TCM-ova, također smo otkrili da među 35 prijavljenih sastojaka, skoro 70% njih je potvrđeno bilo smanjiti sadržaj melanina ili inhibira aktivnost TYR-a. Ovo nije samo potvrđuje da su zapisi o receptima za beljenje kože u drevnim knjigama su uglavnom pouzdane ali i pokazuju da je referenca na drevnu literaturu pouzdana metoda za dobivanje poznavanje TCM-ova. Još uvijek ima 95 spoja koji ostaju neistraženi, koji imaju potencijal da se oduprepigmentacija. Kroz analizu Vennih dijagrama prvih pet TCM-ova, dobiveno je 13 zajedničkih sastojaka. Među njima su in vitro eksperimenti potvrdili da je daidzein, rutin, i (+)-katehin može smanjiti sadržaj melanina [51–53]. Sakroza remeti pravilno sazrijevanje melanosoma inducirajući osmotski stres i inhibirajući put PI3 kinaze, time ometa melanogenezu [54]. Quercetin smanjuje oksidativnu melanogenezu izazvanu stresom [55]. U osim toga, hemijske i fizikalne metode kao što su spektroskopske i strukturno-aktivnosti analize potvrdile su da lupeol i kaempferol može inhibi-TYRi smanjiti melanogenezu [56, 57]. Ovo ukazuje na to da možda mrežna farmakologija je izvodljiva metoda za iskopatiizjeljenjesastojaka. Četiri TCM-i u prvih pet TCM-ova sadržavali su sitogluside, a tamo nisu izvještaji o tome da li sitogluside regulira pigmentaciju ili njegov srodni mehanizam. Stoga smo izabrali sitogluside za ove studije.

Sitogluside, sterol glycoside koji je široko prisutan u biljke, prijavljeno je da iznude antitumor, antioksidativ, i neuroprotektivnih efekata [58–60]. U ovoj studiji otkrili smo da je sitogluside učinkovito smanjio sadržaj melanina in vitro i in vivo. Naknadno eksperimenti su dokazali da je može značajno smanjiti izraz TYR-a. Kojic kiselina korištena je kao pozitivna kontrola, a također može inhibira proteinske razine gena vezanih za melanogenezu kao što je TYR, MITF, i TYRP1 pod α-MSH stimulaciju, koja je bila jeon et al. [61]. S obzirom na odsustvo egzogenih stimulacija, 200 μM kojic kiselina je imala samo umjerenu inhibiciju efekti na ekspresiju gena u našoj studiji, već zato što kojic Kiselina ima veliku inhibitoriju tirozinaze, i dalje je koristimo. kao pozitivna kontrola u ovoj studiji. TYR izraz je bio izvještavaju da su direktno ili indirektno regulirani od strane MAPK-a ili PKA putevima, odnosno. Sve veći broj sa sastojcima je potvrđeno da imaju efekt izjeljivanja na koži inhibijući MAPK signalni put. Na primjer, fargesin smanjuje izrazTYRpored inhibicije puta P38/MAPK [62]. Ganoderma lucidum polisaharidi mogu odoljeti melanogenezi izazvanoj UVB snižavajući PUT MAPK [63]. Naša studija je otkrila da je sitogluside, u koncentraciji od 200 μM, imao potencijal za smanjenje TYR izraza inhibicijama ERK/- MAPK i P38/MAPK signalni putevi. Ovo je bilo prijavljen kroz molekularno prisipanje između uzvodno membranski receptori MAPK puteva [64] i sitogluside. Otkrili smo da se sitogluside snažno veže na opioid u, melanokortin 1, i faktor rasta stem ćelija receptora. Stoga, nagađamo da sitogluside može u interakciji s ovim membranskih receptora, inhibirati ERK/MAPK i P38/MAPK signalne puteve, i smanjiti izraz TYR.

Pošto je TYR ključni enzim u sintezi melanina čestice u melanocita, inhibicija aktivnosti katalitičke lokacije TYR je od suštinske važnosti za smanjenje kožepigmentacija[65]. Mnogi agensi za munjenje kože na tržištu su TYR inhibitori aktivnosti, kao što su HQ, arbutin, i kojic kiselina. U Ovu studiju, koristili smo molekularno prisipanje da istražimo vezivanje efekti sitoglusidea i pet uobicajenihbeljenje kozeaktivan sastojaka (arbutin, nikotinamid, kojic kiselina, HQ, i akorbna kiselina) [66] saTYR. Rezultati su pokazali da sitogluside ima jak afinitet vezanja prema TYR-u, slabiji od arbutin, ali jači od kojic kiseline, nikotinamida, HQ, i aškorbna kiselina. Arbutin je predig od HQ i prirodni proizvod koji može smanjiti ili inhibiciju sinteze melanina inhibicije TYR-a. Međutim, prirodni oblik arbutina je hemijski nestabilan i može se pretvoriti u HQ, koji se katalizira i metabolizira u benzen metabolite sa potencijalnom toksičnošću za koštanu srž [67]. Upotreba kojic kiseline u kozmetika je ograničena zbog svoje karcinogenosti i nestabilnost tokom skladištenja [68]. Stoga, sitogluside, prirodni sterol spoj izveden iz raznih biljaka, je Očekuje se da će djelovati kao potentan agens za munjenje kože. Međutim rastvorljivost sitogluside u DMSO je niska, što je također nedostatak ovog prirodnog sastojka. Naknadno eksperimentalna verifikacija je otkrila da je sitogluside siguran u MNT1 i ćelijskih linija B16F0, a grupa niske koncentracije imala je dobar inhibitori učinak na aktivnost TYR-a, dok visok koncentraciona grupa je imala isti efekat kao ista koncentracija kojic kiseline. Stoga se sitogluside može terapijski koristiti kao regulator za izljepljenje kože, koji ne samo da smanjuje izraz TYR-a ali i inhibira njegovu aktivnost (6.

5. Zaključci

Mrežna farmakologija je možda efikasan alat za otkriće prirodne kože-pigmentacija-smanjenje aktivne sastojaka i njihovih mogućih mehanizama. Fructus Ligustri Lucidi, Hedysarum multijugum maxim., Ampelopsis japonica, Pseudobulbus Cremastrae Seu Pleiones, i Paeoniae Radix Alba ima potencijalabeljenje kozesvojstva i može inhibicijepigmentacijaregulisanjem upale. Sitogluside je romanbeljenje kozeaktivni sastojak s dual regulatorni efekti, viz. inhibitingTYRizraz i Aktivnosti.

cistanche tablete