Serum/PDGF zavisna melanogena uloga minutnog nivoa onkogene kinaze PAK1 u ćelijama melanoma dokazana testom visoko osetljive kinaze

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Sažetak:Prethodno smo pokazali da je onkogena kinaza PAK4, koju i melanomi i normalni melanociti eksprimiraju na vrlo visokom nivou, neophodna za njihovomelanogeneza. U ovoj studiji, koristeći visoko osjetljivi test kinaze "Macaroni-Western" (IP-ATP-Glo), istražili smo melanogeni potencijal druge onkogene kinaze PAK1, koju stanice melanoma (B16F10) eksprimiraju samo na vrlo maloj razini. Nakon transfekcije ćelija melanoma sa PAK1-shRNA za utišavanje gena PAK1, sadržaj melanina,tirozinazaaktivnost i aktivnost kinaze PAK1 upoređivani su između divljeg tipa i transfektanata. Otkrili smo da (i) PAK1 značajno aktiviraju melanogeni hormoni kao što su IBMX (3-izobutil-1-metil ksantin) i -MSH (hormon koji stimulira melanocite), (ii) utišava endogeni gen PAK1 u ćelije melanoma putem PAK1-specifične shRNA smanjuju i sadržaj melanina itirozinazaaktivnost u prisustvu i serumskih i melanogenih hormona do bazalnog nivoa, (iii) egzogeno dodani divlji tip PAK1 u stanicama melanoma povećava nivo melanina koji se inducira -MSH za nekoliko puta bez utjecaja na bazalni nivo, i (iv) - Melanogeneza izazvana MSH/IBMX teško se odvija u odsustvu seruma ili PAK1, što jasno ukazuje da je PAK1 esencijalan uglavnom za serum i -MSH/IBMX zavisnemelanogeneza, ali ne i bazalni, u ćelijama melanoma. Ishod ove studije mogao bi pružiti prvu naučnu osnovu za objašnjenje zašto su veliki broj biljnih blokatora PAK1- kao što su CAPE (fenetil ester kafeinske kiseline), kurkumin i šikonin u kozmetici korisni zaizbjeljivanje kože.

Ključne riječi:PAK1,melanogeneza, melanomi,tirozinaza, MITF,izbjeljivanje kože, serum

Cistanche proizvodi za izbjeljivanje kože

Uvod

Boju dlačica, šarenice očiju i kože kontroliše porodica pigmenata zvanih melanini. Intracelularni izvor melanina je tirozin koji se pretvara u melanin nizom enzimske oksidacije (hidroksilacije) koja uključujetirozinaza, TRP (protein vezan za tirozinazu) 1 i TRP2. Za ekspresiju gena koji kodiraju ove melanogene enzime potrebna su najmanje dva onkogena/melanogena faktora transkripcije (MTF): beta-katenin i MITF (transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom). Većina biljnih jedinjenja uizbjeljivanje kožekozmetika ili direktno inhibira ove melanogene enzime ili smanjuje MTF-ove. Analogi tirozina kao što je kojična kiselina spadaju u prvu kategoriju (tirozinazainhibitori), dok većina ostataka kao što su CAPE (fenetil ester kafeinske kiseline), kurkumin i šikonin spada u drugu kategoriju (MTF regulatori) (1,2). Zanimljivo je da je poznato da mnogi od ovih MTF regulatora uključujući CAPE, kurkumin, šikonin i kukurbitacin blokiraju onkogenu/stareću kinazu PAK1 (RAC/CDC42-aktivirana kinaza 1) (3-5). Stoga je najvjerovatnije da je PAK1 uključen u aktivaciju ovih melanogenih/onkogenih faktora transkripcije u ćelijama kose, šarenicama oka ili melanocitima kože. Zaista, barem beta-katenin je među direktnim supstratima PAK1 (6). PAK1 fosforilira beta-katenin na Ser 675 za aktivaciju, što dovodi do maligne transformacije. Nadalje, beta-katenin je neophodan za aktivaciju MITF-a, što dovodi domelanogenezaili/i onkogeneza melanocita (7).

Zanimljivo je, međutim, da je nedavno otkriveno da nokautiranje gena PAK1 per se kod pigmentiranih miševa ne uspijeva proizvesti nijednog albino miša (Hong He et al., neobjavljeno zapažanje), što jasno ukazuje da je barem bazalna melanogeneza u stanicama kose i oku šarenice su nezavisne od PAK1, iako doprinos PAK1 kožimelanogenezaostaje da se razjasni.

Ranije smo pokazali da je onkogena kinaza PAK4 (CDC42-zavisna kinaza 4) visoko eksprimirana i u melanomu i u normalnim ćelijskim linijama melanocita, i odgovorna za njihovu melanogenezu, aktivirajući CREB/beta-catenin-MIFT-tirozinazaputa, dok PAK2 (RAC/CDC42-aktivirana kinaza 2), još jedan visoko eksprimirani član porodice PAK, ne igra nikakvu ulogu u njihovoj melanogenezi (8).

U ovoj studiji pružamo prve biohemijske dokaze za specifičnu ulogu druge onkogene kinaze zvane PAK1 u kožimelanogeneza, uprkos činjenici da je nivo njegove ekspresije mali: shRNA-indukovano utišavanje gena PAK1 u melanocitima (B16F10) izvedenih iz melanoma miša značajno je smanjilo -MSH/IBMX-inducibilnomelanogenezana bazalni nivo, dok je prekomjerna ekspresija PAK1 gena pojačala melanogenezu inducibilnu -MSH bez utjecaja na bazalnu. Nadalje, otkrili smo da je melanogeneza inducibilna -MSH/IBMX zahtijeva serumski faktor koji je najvjerovatnije PDGF (trombocitni faktor rasta). U mediju bez seruma, samo bazalnomelanogenezaodvija.

cistanchesmanjuju aktivnost tirozinaze

2. Materijali i metode

2.1. Materijali

Ćelije melanoma B16F10 kupljene su od American Type Culture Collection (Rockville, MD, SAD). PAK1-SureSilencing plazmidi, atraktivna transfekcija, endofree® plazmid maxi kit kupljeni su od Qiagena (Valencia, CA 91355, SAD). Primarna PAK1-antitijela, biotinilirana sekundarna antitijela, signalfireTM ECL reagens su dobijeni od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD). Kinase Glo reagens i ATP (ATP_Glo kinase kit) su kupljeni od Promega (Madison, Wisconsin, SAD). Kompetentne ćelije za lipofektamin i JM109 su kupljene od Invitrogena i Life Technology. AG1295 i AG1478 su kupljeni od Calbiochema (San Diego, CA, SAD). Sve ostale hemikalije uključujući ljudski PDGF-bb kupljene su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

2.2. Utišavanje gena PAK1 u melanocitima miša (B16F10) stabilnom transfekcijom mišjim PAK1-specifičnim shRNA

2.2.1. Ćelijska kultura

Ćelije melanoma B16F10 su uzgajane u DMEM sa dodatkom 10 posto toplinom aktiviranog FBS-a i 1 posto penicilina/streptomicina (10,000 U/mL i 100 µg/mL) na 37 stepeni u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5 posto CO2.

2.2.2. Stabilna transfekcija pomoću mišje PAK1-specifične shRNA

ShRNA transfekcija ćelijske linije B16F10 izvedena je u osnovi istom procedurom koja je prethodno opisana (9), ali sa mišjim PAK1-specifičnim shRNA (# KM04553, Qiagen). Za transfekciju su korištena sljedeća četiri različita klona shRNA: klon 1 (CCAGAGAAGTTGTCAGCTATT), klon 2 (CATCAAGAGTGACAATATTCT), klon 3 (GTACACACGGTTCGAGAAGAT) i klon 4 (GTACCACCAGTGTCAGAAGAT) kao i negativna kontrola (neciljna kontrola)shWRNA . Međutim, u ovoj studiji pokazalo se da su klonovi 1 i 2 efikasniji od klonova 3 i 4 za utišavanje mišjeg gena PAK1 u ovoj liniji melanocita (podaci nisu prikazani). Stabilni transfektanti su odabrani u prisustvu G418 (1 mg/mL) koji ubija više od 99 posto netransficiranih ćelija.

2.2.3. Western-blot analiza nivoa proteina PAK1 i in vitro test za aktivnost kinaze PAK1 u transfektantima

2.2.3.1. Western blot analiza

Kako bismo kvantificirali ekstremno nizak nivo PAK1 u kontrolnoj (WT) ćelijskoj liniji i PAK1-utišanim transfektantima (G418-otporni), minimiziranjem nivoa "nespecifične buke", sproveli smo zapadni blot analiza korištenjem zečjeg poliklonskog antitijela protiv PAK1 (#2062, Cell Signaling Technology) kao primarnog antitijela. Ukratko, svaki klon je zasejan u koncentraciji od 2 × 105 ćelija/jažici u ploču sa 6 jažica, prethodno kultivisan 48 h, a ćelijski lizati su kuvani u 25 µL SDS-PAGE pufera 5 minuta. Osam µL (sadrži 15 µg ukupnog proteina) svakog supernatanta po slotu je korišteno za SDS-PAGE. Nitroceluloza je prekrivena anti-PAK1 IgG (1:1,000 razrjeđenje kao primarno antitijelo), a kao sekundarna antitijela, HRP-vezani anti-zečji IgG i anti-biotin IgG (#7074, # 7075, Cell Signaling) korišteni su za detekciju i PAK1 i -aktinskih traka koji su na kraju vizualizirani pomoću ECL sistema iz Amershama. Western blot testovi bili su reprezentativni za tri nezavisna eksperimenta.

2.2.3.2. "Macaroni-Western" (IP-ATP_Glo) test kinaze za PAK1 u ćelijama melanoma

Aktivnost kinaze PAK1 u WT melanocitima i shRNA transfektantima (SHs) mjerena je značajnom modifikacijom (5) decenije stare metode (koju smo skovali "Macaroni-Western") koju je razvila italijanska grupa (1{{39 }}). Ukratko, ćelijske linije B16F10 melanoma (WT ili SHs, 2 × 105 ćelija/mL) su prethodno kultivisane na 6-ploči sa jažicom 24 h. Zatim su ćelije tretirane sa 100 nM -MSH ili 100 µM IBMX tokom 48 h. Ćelije su razbijene puferom za lizu koji je sadržavao 50 mM Tris HCl pH 7,5 i 150 mM NaCl i 1 posto Triton-X. Za imunoprecipitaciju (IP) PAK1, očišćeni ćelijski lizati su inkubirani sa anti-PAK1 IgG (razrijeđenje 1:50) i zrncima protein A-agaroze tokom 1-2 h u hladnoj prostoriji uz kontinuirano mućkanje rotirajućim mikserom (Nissin, Suginami-ku, Tokio, Japan). Dobijeni IP (PAK1) iz svakog lizata je inkubiran sa kompletom za analizu ATP Glo kinaze (Promega) u prisustvu ATP-a i MBP (baznog proteina mijelina) 1 h na 37 stepeni, a preostali nivo ATP-a je meren pomoću ATP-a. zavisna reakcija Luciferin-Luciferaza koja na kraju stvara luminescenciju (10). Konačna suspenzija je centrifugirana, a supernatant je prebačen u 96-ploču za čitanje. Luminescenciju je zabilježio MTP-880Lab čitač mikroploča (Corona, Hitachinaka-ku, Ibaraki, Japan) sa vremenom integracije od 0,5 s po jažici.

2.3. Mjerenje sadržaja melanina i aktivnosti tirozinaze u transfektantima

2.3.1. Mjerenje sadržaja melanina

Sadržaj melanina je određen kao što je prethodno opisano (11). Ukratko, B16F10 ćelije (divljeg tipa ili PAK1-specifični shRNA transfektanti) su stavljene na ploče sa gustinom od 2 × 104 ćelija/jažici u 24-ploču sa jažicom. Nakon 24 h kulture, dodato je 100 µM izobutil{10}}metilksantina (IBMX) ili 100 nM -MSH i inkubirano dodatnih 72 h na 37 stepeni. Ćelije su dva puta isprane fosfatnim puferom, zatim lizirane sa 500 µL rastvora koji sadrži 1 M NaOH i 10 procenata DMSO i inkubirane na 80 stepeni tokom 1 h, da bi se melanin rastvorio, a sadržaj melanina je meren na 490 nm. Da bi se uporedio sadržaj melanina u ćelijama divljeg tipa i transficiranim ćelijama, ukupna količina melanina koju proizvode melanociti divljeg tipa smatrana je kontrolnom (100 procenata), i u skladu sa tim je izračunata količina melanina koju su proizveli transfektanti.

2.3.2. Ispitivanje intracelularne aktivnosti tirozinaze

tirozinazaaktivnost je određena kao što je prethodno opisano (12), uz malu modifikaciju. B16F10 ćelije (divljeg tipa ili transfektanti) su postavljene na gustinu od 2 × 104 ćelije/jažici, a nakon 24 h kulture dodano je 100 µM IBMX ili 100 nM -MSH i inkubirano dodatnih 72 h na 37 stepeni. . Ćelije su zatim isprane ledeno hladnim fosfatnim puferom i lizirane fosfatnim puferom (pH 6,8) koji je sadržavao 1 posto Triton-X (500 µL/jažici). Ploče su zamrznute na -80 stepeni 30 minuta. Nakon odmrzavanja, 100 µL 1 posto L-DOPA je dodano u svaku jažicu. Nakon inkubacije na 37 stepeni tokom 2 h, apsorbancija je izmjerena na 490 nm.

2.4. Mjerenje sadržaja melanina u melanocitima divljeg tipa i melanocita sa prekomjernom ekspresijom PAK1- nakon tretmana -MSH

Koristeći Myc vektor (2 µg), melanociti (B16F10) su prolazno transficirani ili divljim tipom (WT) PAK1 ili takozvanim "konstitutivno aktiviranim" (CA) PAK1 koji nosi mutaciju T423E. Nakon 3 dana kulture, svaki transficirani klon je sakupljen za daljnji eksperiment. Utjecaj prekomjerne ekspresije PAK1- na sadržaj melanina mjeren je istim procedurama koje su prethodno opisane (8). Ukratko, melanociti, bilo divlji tip ili prekomjerna ekspresija PAK1-koji eksprimiraju ili divlji tip PAK1 ili njegov CA mutant, inkubirani su sa 100 nM -MSH 3 dana. Ćelije su lizirane otopinom koja sadrži 1 M NaOH i 20 posto DMSO da bi se melanin otopio, a njegov sadržaj je određen na 405 nm.

2.5. Melanogeneza u mediju bez seruma

B16F10 ćelije (divljeg tipa ili PAK1-specifični shRNA transfektanti) su postavljene na gustinu od 2 × 104 ćelije/jažici u ploču sa 24-jažicom u prisustvu 10 posto FBS. Nakon 24 h inkubacije, medij za kulturu se zamjenjuje podlogom bez seruma i uzgaja se dodatnih 72 h sa ili bez 100 µM IBMX ili 100 nM -MSH radi mjerenja sadržaja melanina.

2.6. Učinak inhibitora PDGF/EGF receptora na melanogenezu zavisnu od seruma

2 × 104 B16F10 ćelije su posađene u svaku jažicu tokom 24 h u medijumu sa 10% FBS, a zatim kultivisano dodatnih 72 h u svežem mediju koji sadrži 100 nM -MSH i sledeće: (1) bez seruma, (2) Samo 10 posto FBS, (3) 10 posto FBS plus 2 µM AG1295 (inhibitor PDGF receptora) i (4) 10 posto FBS plus 400 nM AG1478 (inhibitor EGF receptora), za mjerenje sadržaja melanina.

2.7. Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti sa njihovim standardnim greškama. Statistička poređenja su obavljena jednosmjernom ANOVA-om praćenom Duncanovim testom višestrukog opsega. Statistička analiza je provedena korištenjem SAS-a (izdanje 9.2; SAS Institute, Cary, NC, USA), a p manje od ili jednako 0.05 smatrano je značajnim.

maca ginseng cistanche

3. Rezultati

3.1. Aktivacija PAK1 u ćelijskoj liniji melanoma (B16F10) melanogenim hormonima

Dva melanogena hormona, -MSH (hormon koji stimuliše melanocite) i IBMX (3-izobutil-1-metil ksantin) se često koriste za stimulacijumelanogenezau melanocitima kao što je ćelijska linija melanoma B16F10. Stoga smo prvo ispitali da li ovi hormoni mogu da aktiviraju PAK1 u ovoj ćelijskoj liniji, iako je nivo proteina PAK1 tamo izuzetno nizak u poređenju sa PAK2 i PAK4 (8). Kako bismo pratili promjene u aktivnosti kinaze PAK1 u stanicama, nedavno smo razvili visoko osjetljiv/specifičan test kinaze nazvan "Macaroni-Western" (IP ATP-Glo) protokol kinaze kombiniranjem imunoprecipitacije (IP) PAK1 iz stanice lizati i Promega-in ATP_kit Glo kinaza (5). Koristeći ovaj test kinaze, otkrili smo da i -MSH (100 nM) i IBMX (100 µM) aktiviraju PAK1 u ćelijama melanoma, pri čemu je -MSH jači od IBMX-a (vidi sliku 1). Međutim, trebali bismo podsjetiti čitaoce da je preklopna aktivacija PAK1 prikazana ovdje samo prividna, jer bi tokom ovog dugotrajnog testa IP i kinaze u epruveti (ukupno preko 3 h) koji se odvijao bez ovih melanogenih hormona, PAK1 bi se postepeno normalizirao tokom vrijeme. Drugim riječima, ne možemo zamrznuti tačan status kinaze PAK1 na kraju ćelijske kulture tretirane ovim stimulatorima, a aktivacija nabora je samo podcijenjen odraz aktivacije PAK1 koja se dogodila tokom ćelijske kulture pomoću ovih simulatora.

3.2. Utišavanje gena PAK1 pomoću shRNA u ćelijskoj liniji mišjeg melanoma

Kako bi se dalje biohemijski istražilo da li PAK1 doprinosimelanogenezau ćelijama kože (melanocitima), stabilno smo transficirali ćelijsku liniju melanoma B16F10 sa mišjim PAK1-specifičnim shRNA kako bismo selektivno utišali gen PAK1.

3.2.1. Utišavanje gena PAK1 u melanocitima

Naša preliminarna Western blot analiza je sugerirala da su u dva različita PAK{0}}utišana klona (SH1 i 2) nivoi proteina PAK1 značajno smanjeni (za oko 75 posto), ali stopa rasta ove ćelijske linije melanoma per se nije bila značajno utječe na utišavanje PAK1 (podaci nisu prikazani). Međutim, precizna kvantifikacija nivoa PAK1 proteina skeniranjem ovog western blota bila je prilično teška, uglavnom zbog visokog pozadinskog šuma oko PAK1 pojasa u nastojanju da se vizualizuje njegov ekstremno nizak nivo ekspresije. Umjesto toga, koristeći "Macaroni-Western" kinazni test (5,10), potvrdili smo da je aktivnost kinaze PAK1 u oba SH1 i 2 klona samo oko 25-30 posto one u kontrolnim (WT) ćelijama ( vidi sliku 2A).

3.2.2. Smanjenje melanogeneze utišavanjem gena PAK1

Naše sljedeće kritično pitanje je da li takvo smanjenje aktivnosti kinaze PAK1 utječemelanogeneza. Tako je sadržaj melanina u ovim klonovima (SH1 i 2) upoređen sa ćelijama melanoma divljeg tipa (WT), nakon tretiranja svih ovih ćelija sa -MSH, melanogenim induktorom, tokom 72 h. Kao što je prikazano na slici 2B, sadržaj melanina u ovim melanocitima s nedostatkom PAK1- (SH1 i 2) smanjen je za oko 50 posto (51-55 posto), dostižući bazalni nivo u WT bez melanogenog hormona. Kako bismo vidjeli da li je ovo smanjenje sadržaja melanina povezano sa supresijom aktivnosti tirozinaze, izmjerili smotirozinazaaktivnost u ćelijama sa nedostatkom PAK1- (klonovi SH1 i 2), u poređenju sa WT. Kao što je prikazano na slici 2C, aktivnost tirozinaze u ćelijama sa nedostatkom PAK1-je samo oko 45 procenata (33-58 procenata) one u WT, ponovo dostižući bazalni (nestimulisani) nivo, što jasno ukazuje da je PAK1 neophodan za proizvodnju melanina izazvanu -MSHtirozinazau melanocitima. Nadalje, na vrlo sličan način melanogeneza izazvana IBMX-om također je smanjena utišavanjem gena PAK1 u ovoj ćelijskoj liniji melanoma (podaci nisu prikazani). Međutim, uzimajući u obzir sljedeća dva faktora, najvjerovatnije je samo polovinamelanogenezau melanocitima je zavisan od PAK1-, a preostali (uglavnom "osnovni") je zavisan od PAK4-: (i) PAK4 je također bitan za melanogenezu izazvanu -MSH u melanocitima (8), i (ii) čini se da je oko 25 posto gena PAK1 još uvijek eksprimirano u ovim transfektantima (SH1 i 2). Međutim, ostaje da se energično razjasni da li je PAK1 odgovoran za hormonski induciran ili bazalnimelanogeneza.

Nadalje, potvrdili smo da je endogeni PAK1 značajno aktiviran melanogenim induktorima kao što su IBMX i -MSH u ovoj ćelijskoj liniji melanoma (vidi sliku 1), ali bez ikakvih značajnih promjena u njegovoj autofosforilaciji na Thr 423 kako je ocijenjeno prema anti-pPAK1 antitijela (podaci nisu prikazani).

3.3. Povećanje -MSH-inducibilne melanogeneze prekomjerno eksprimiranim PAK1

Prekomjernom ekspresijom divljeg tipa (WT) gena PAK1 u melanocitima (ćelijska linija B16F10) transfekcijom, otkrili smo da egzogeno dodat gen PAK1 povećava nivo melanina koji se indukuje -MSH za nekoliko puta (vidi lijevo na slici 3, uporedi staze 2 i 4), dok gotovo da ne utiče na nezavisni "bazalni" nivo melanina sam po sebi (uporedite trake 1 i 3 na lijevom panelu na slici 3), sugerirajući da PAK1 uglavnom doprinosi -MSH/IBMX-ovisnommelanogeneza, a ne bazalna melanogeneza bez egzogenog(ih) stimulatora(a).

3.4. Efekat seruma na -MSH/IBMX-inducibilnu melanogenezu

Još zanimljivije, otkrili smo da indukcija melanogeneze pomoću -MSH/IBMX zahtijeva 10 posto FBS (fetalnog goveđeg seruma) pored PAK1. Kao što je prikazano na slici 4A, u mediju bez seruma, ili -MSH ili IBMX jedva da su izazvalimelanogenezau WT ćelijama, iako je samo 10 posto FBS (bez -MSH/IBMX) izazvalomelanogenezaznačajno (za oko 60 posto). Zanimljivo je da je melanogeneza u SH transfektantima (ćelije sa nedostatkom PAK1-) u prisustvu ili odsustvu seruma bila na istom nivou kao i u WT ćelijama u odsustvu seruma (vidi Sliku 4B), što sugerira da melanogeneza zavisna od seruma također zahtijeva PAK1. U prilog ovoj ideji, sam serum značajno aktivira aktivnost kinaze PAK1 u WT ćelijama, ali -MSH-ovisna aktivacija PAK1 u WT ćelijama zahtijeva serum (vidi sliku 4C).

Što se tiče hemijske prirode melanogenog serumskog faktora koji sam aktivira PAK1, nagađamo da je to PDGF (trombocitni faktor rasta) iz sljedećih razloga: (i) prije više od jedne decenije pokazali smo da je PDGF jedini faktor rasta u serum koji aktivira PAK1 kroz transaktivaciju EGF (epidermalnog faktora rasta) receptora PDGF receptorom (13,14), a vrlo nedavno su drugi dokazali da ili PDGF ili EGF sami zaista stimulirajumelanogenezamelanocita (15,16).

3.5. Melanogeneza zavisna od seruma/PDGF zahtijeva EGF receptor

U pokušaju da identifikujemo specifičnu hemijsku prirodu ovog melanogenog serumskog faktora, testirali smo efekat ili AG1295 (inhibitor specifičan za PDGF receptor) ili AG1478 (inhibitor specifičan za EGF receptor) na serum zavisanmelanogenezau melanocitima. Kao što je prikazano na slici 5, ili 2 µM AG1295 ili 400 nM AG1478 snažno su smanjili serum-ovisnimelanogenezado nivoa koji je ekvivalentan osnovnoj (bez seruma) melanogenezi. Budući da je PDGF obilno prisutan u serumu, ali ne i EGF i AG1295 ne inhibira EGF receptor, dok AG1478 ne inhibira PDGF receptor (13), najvjerovatnije je da PDGF u serumu aktivira svoj receptor koji zauzvrat transaktivira EGF receptor koji na kraju aktivira PAK1 koji je neophodan za melanogenezu zavisnu od seruma (za detalje pogledajte sliku 6). Na osnovu ove pretpostavke, kasnije ćemo raspravljati o najvjerovatnijem mehanizmu koji leži u osnovi očigledne sinergije između -MSH i seruma/PDGF za aktivaciju PAK1, što dovodi do snažne melanogeneze.

Na kraju, treba istaći da "bazalni" sadržaj melanina bez -MSH nije značajno promijenjen prekomjerno eksprimiranim CA (konstitutivno aktivnim) mutantom PAK1 koji nosi mutaciju T423E (vidi lijevi panel na slici 3, traka 5) kao ako je bio ili DN (dominantno negativan) ili neaktivni mutant. U stvari, -MSH uopće nije inducirao fosforilaciju WT PAK1 na Thr 423 (podaci nisu prikazani). Dakle, moglo bi se zaključiti da autofosforilacija PAK1 na Thr 423 nema nikakve veze sa -MSH-indukovanom aktivacijom PAK1, što dovodi do robusnogmelanogenezau ćelijama melanoma. Pošto je poznato da je T423E mutant PAK1 visoko onkogen (6), možda bi autofosforilacija na Thr 423 mogla poslužiti za prebacivanje sa "melanogenog" na "onkogeno" signaliziranje.

4. Diskusija

Iz našeg zapažanja o PAK{0}}zavisnoj i PAK{1}}zavisnoj melanogenezi u ćelijama melanocita/melanoma, pojavljuju se dva potencijalno zanimljiva pitanja na koja treba ukazati: (i) "specifična" melanogena aktivnost PAK1 ( samo sitno izražen) mora biti daleko veći od PAK4 (visoko izražen) u ćelijama melanoma. (ii) Čini se da je PAK1 uglavnom odgovoran za melanogenezu izazvanu serumom, dok je PAK4 uglavnom odgovoran za intrinzičnu (bazalnu)melanogeneza. Drugim riječima, iako je nedostatak PAK4-embrionalno smrtonosan kod miševa, dok sam nedostatak PAK1-ne uspijeva proizvesti "albino" miševe, očigledna razlika u originalnoj boji kože (osnovnamelanogeneza) između crnih i bijelih ljudi, na primjer, može biti barem dijelom odraz razlike u nivou ekspresije PAK4, kao i razlike u nivou melanogenihtirozinazas.

In vivo, koristeći HRM-2 (pigmentirane ali bez dlake) miševe, nedavno smo pokazali da krema koja sadrži 10 μM PF3758309 (PAK1/PAK4-inhibitor) smanjuje melanogenezu izazvanu UV zračenjem u njihovoj koži na bazalnom nivou, iako ostaje da se razjasni da li je PAK4 ili PAK1 odgovoran za UV-indukciju melanogeneze (8). Budući da je PAK1 odgovoran za inducibilnu, ali ne i bazalnu, melanogenezu, bilo bi vrijedno testirati da li PAK1 značajno doprinosi UV-inducibilnojmelanogeneza(tamnjenje na suncu) također, koristeći rijetki PAK1 KO (knock-out) mutant izveden iz C57B16 soja miševa koji nose tamne dlake i oči (Hong He et al., neobjavljeno zapažanje), u pokušaju da se shvati da li različiti biljni PAK1 blokatori u kozmetici su korisni za sredstva za zaštitu od sunca ili ne. Zanimljivo je da se PAK1 aktivira UV zračenjem i drugim agensima koji oštećuju DNK (17).

Pokazalo se da -MSH aktivira Tyr kinazu JAK2 (18), koja zauzvrat aktivira PAK1 fosforilacijom na Tyr 285, (umjesto Thr 423), što dovodi do interakcije PIX-PAK1 (19). Ovo bi moglo objasniti zašto ni -MSH-zavisna aktivacija PAK1 ni melanogeneza ne uključuju autofosforilaciju PAK1 na Thr 423. Stoga smo nedavno istražili da li je PAK1-zavisna melanogeneza blokirana snažnim biljnim JAK2- inhibitor zvan kukurbitacin I (CBI) iz gorke dinje (Goya) koji direktno inhibira JAK2 (20) i otkrio je da CBI inhibiramelanogenezau prisustvu melanogenih hormona za više od 70 posto, što ukazuje na mogućnost da CBI blokira ne samo PAK1 već i PAK4 (5). U ovom kontekstu, bilo bi od velikog interesa napomenuti da biljni blokatori PAK{4}} kao što su CAPE, kurkumin, šikonin i FTY 720 mogu inhibirati melanogenezu izazvanu -MSH u stanicama mišje ili ljudske kože samo do 50 posto čak i u njihovim koncentracijama gdje je PAK1 gotovo potpuno blokiran (1,2), dok sintetički pan-PAK-blokator PF3758309, inhibira i PAK1 i PAK4, ukidamelanogenezau ćelijama kože za oko 90 posto pri 300 nM (8). Drugim riječima, melanogeni sistem u melanocitima izazvan -MSH mogao bi razlikovati blokatore specifične za PAK1- od pan PAK-blokatora. Do sada nisu identifikovani biljni blokatori specifičnih za PAK4- (osim PAK4-specifičnih siRNA). Međutim, nedavno se pokazalo da vrlo moćan kvasinoid zvan glaukarubinon dobijen iz gorkog drveta uzgojenog u džunglama Amazona blokira i PAK1 i PAK4, inhibirajući rast stanica raka gušterače i in vitro i in vivo (21). Stoga bi bilo od velikog interesa testirati da li ovaj biljni blokator PAK-a gotovo u potpunosti potiskuje melanogenezu stanica kože kao što to čini PF3758309.

Glavni cilj ove studije bio je da se fokusira na specifičnu melanogenu ulogu PAK1, a ne da detaljno istražuje kako PAK1 aktivira melanogeni signalni put uključujući melanogene enzime i MTF. Međutim, najvjerovatnije je da PAK1 direktno aktivira beta-katenin fosforilacijom na Ser 675, što dovodi do aktivacije MITF-a koji je neophodan za ekspresiju gena koji kodiraju melanogene enzime kao što sutirozinaza(Tyr).

Nedavno smo otkrili da je PAK4 (CDC42-zavisna kinaza 4) također uključena umelanogenezaiste ćelijske linije melanoma aktiviranjem dva faktora transkripcije, CREB i beta-katenina, od kojih su oba neophodna za MIFT aktivaciju (8). Budući da je poznato da CREB aktivira LIM kinaza (22,23) koja je, poput beta-katenina, među uobičajenim direktnim supstratima i PAK1 i PAK4 (6,18), najvjerovatnije je da PAK1 i PAK4 dijele isti CREB /beta-catenin-MITF signalni putevi za aktiviranje gena melanogenog enzima.

Međutim, detaljni signalni putevi koji vode do -MSH/IBMX-ovisne aktivacije PAK1 mogu se značajno razlikovati od onih koji vode do aktivacije PAK4, uglavnom zato što prvi uključuje serumski faktor (PDGF). Sam serum je sposoban da aktivira PAK1 (13) i takođe pojačava -MSH/IBMX zavisnu aktivaciju PAK1. Drugim riječima, postoji jasna sinergija između seruma i ovih melanogenih hormona u aktivaciji PAK1 imelanogeneza.

Slijedi naša radna hipoteza o tome kako bi se ova sinergija mogla dogoditi. Glavni signalni put koji vodi do aktivacije PAK1 je onkogeni EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta)-RAS-PI 3 kinaza-RAC/CDC42-PAK1 kaskada. Međutim, samo ova kaskada nije dovoljna za potpunu aktivaciju. Potreban mu je još jedan faktor koji se zove PIX, SH3 adapter protein koji se direktno vezuje za PAK1 preko svog Pro bogatog motiva od 18 aminokiselina nazvanog PAK18. Za interakciju PIX-PAK1 potreban je treći protein koji se zove JAK2, Tyr-kinaza, koja fosforiliše PAK1 na Tyr 285. RAS pojačava regulaciju JAK2 kroz prolaktin. Prema nekoliko prethodnih nalaza naših i drugih (13-16), PDGF (faktor rasta izveden iz trombocita) je glavni melanogeni serumski faktor(i) bitan za -MSH/IBMX-induciranmelanogeneza, jer aktivira svoj receptor (PDGFR) Tyr-kinazu koja zauzvrat transaktivira EGFR (receptor epidermalnog faktora rasta=ErbB1) Tyr-kinazu, što dovodi do aktivacije PAK1 preko onkogene RAS-PI3 kinaze-RAC /CDC42 put (13). Dakle, PDGF samo u serumu može aktivirati PAK1 i inducirati melanogenezu do pola. Međutim, za potpunu aktivaciju PAK{12}}zavisne melanogeneze, -MSH/IBMX je neophodan za aktiviranje JAK2 putem cAMP-ovisnog puta (koji može uključivati ​​PKA) koji na kraju osigurava interakciju PIX-PAK1 (za detalje, vidi sliku 6).

U zaključku, ovdje predstavljamo prve biohemijske dokaze koji bi mogli objasniti kako različiti biljni blokatori PAK1- kao što su CAPE, kurkumin i šikonin u kozmetičkim kremama mogu doprinijeti "izbjeljivanje kože" efekti. Čeka se serija analognih studija s ljudskim melanocitima za daljnji dokaz ili potvrdu.

maca ginseng cistanche

Reference

1. Lee JH, Jang JY, Park C, Kim BW, Choi YH, Choi BT. Kurkumin potiskuje melanogenezu stimuliranu alfa-melanocitnim hormonom u B16F10 stanicama. Int J Mol Med. 2010; 26:101-106.

2. Lee JY, Choi HJ, Chung TW, Kim CH, Jeong HS, Ha KT. Fenetil ester kafeinske kiseline inhibira sintezu melanina izazvanu hormonom stimulirajućeg alfa-melanocita supresijom transaktivacijske aktivnosti transkripcionog faktora povezanog s mikroftalmijom. J Nat Prod. 2013; 76:1399-1405.

3. Maruta H. Biljni lekovi koji blokiraju onkogenu kinazu PAK1: praktičan pristup bolestima zavisnim od PAK1-a i dugovječnosti. Phytother Res. 2014; 28:656-672.

4. Nguyen BCQ, Taira N, Tawata S. Nekoliko biljnih jedinjenja u biljkama Okinawe direktno inhibiraju onkogenu/stareću kinazu PAK1. Drug Discov Ther. 2014; 8:238-244.

5. Nguyen BCQ, Be Tu PT, Tawata S, Maruta H. Kombinacija imunoprecipitacije (IP)-ATP_Glo kinaze i melanogeneze za procjenu moćnih i sigurnih blokatora PAK1- u ćelijskoj kulturi . Drug Discov Ther. 2015; 9:289-295.

6. He H, Maruta H. Onkogenost PAK-a i njihovih supstrata. U: PAKs, RAC/CDC42 (p21)-aktivirane kinaze: ka izlječenju karcinoma i drugih bolesti zavisnih od PAK-a (Maruta H, ur.). Elsevier, Oksford, 2013; str. 23-51.

7. Widlund HR, Horstmann MA, Price ER, Cui J, Lessnick SL, Wu M, He X, Fisher DE. - Rast melanoma izazvan kateninom zahtijeva nizvodni ciljni transkripcijski faktor povezan s mikroftalmijom. J Cell Biol. 2002; 158:1079-1087.

8. Yun CY, You ST, Kim JH, Chung JH, Han SB, Shin EY, Kim EG. p21-aktivirana kinaza 4 kritički reguliše melanogenezu putem aktivacije CREB/MITF i -catenin/MITF puteva. J Invest Dermatol. 2015; 135:1385-1394.

9. Huynh N, Liu KH, Baldwin GS, He H. P21-aktivirana kinaza 1 stimulira rast ćelija raka debelog crijeva i migraciju/invaziju putem ERK- i AKT-zavisnih puteva. Biochim Biophys Acta. 2010; 1803:1106-1113.

10. Tagliati F, Bottoni A, Bosetti A, Zatelli MC, degli Uberti EC. Upotreba luminiscentne tehnologije za razvoj testa kinaze: Cdk4 kao model sistema. J Pharm Biomed Anal. 2005; 39:811-814.11. Yoon NY, Eom TK, Kim MM, Kim SK. Inhibicijski učinak florotanina izolovanih iz Ecklonia cava na aktivnost tirozinaze gljiva i formiranje melanina u ćelijama melanoma B16F10 miša. J Agric Food Chem. 2009; 57:4124-4129.

12. Li X, Guo L, Sun Y, Zhou J, Gu Y, Li Y. Baicalein inhibira melanogenezu kroz aktivaciju ERK signalnog puta. Int J Mol Med. 2010; 25:923-927.

13. He H, Levitzki A, Zhu HJ, Walker F, Burgess A, Maruta H. Faktor rasta izveden iz trombocita zahtijeva receptor epidermalnog faktora rasta da aktivira p21-aktivirane kinaze porodice kinaza. J Biol Chem. 2001; 276:26741-26744.

14. Saito Y, Haendeler J, Hojo Y, Yamamoto K, Berk BC. Hetero-dimerizacija receptora: Osnovni mehanizam za transaktivaciju receptora epidermalnog faktora rasta izazvanog faktorom rasta trombocita. Mol Cell Biol. 2001; 21:6387-6394.

15. Hirobe T, Shibata T, Fujiwara R, Sato K. Faktor rasta izveden iz trombocita reguliše proliferaciju i diferencijaciju ljudskih melanocita na način specifičan za fazu diferencijacije. J Dermatol Sci. 2016; 83:200-209.

16. Garcez RC, Teixeira BL, Schmitt Sdos S, Alvarez-Silva M, Trentin AG. Faktor epidermalnog rasta (EGF) potiče in vitro diferencijaciju ćelija neuralnog grebena do neurona i melanocita. Cell Mol Neurobiol. 2009; 29:1087-1091.

17. Roig J, Traugh JA. p21-aktivirana protein kinaza gama PAK se aktivira jonizujućim zračenjem i drugim agensima koji oštećuju DNK. Sličnosti i razlike sa alfa PAK-om. J Biol Chem. 1999; 274:31119-31122.

18. Buggy JJ. Vezivanje alfa-melanocit-stimulirajućeg hormona za njegov G-protein spojen receptor na B-limfocitima aktivira Jak/STAT put. Biochem J. 1998; 331:211-216.

19. Hammer A, Oladimeji P, De Las Casas LE, Diakonova M. Fosforilacija tirozina 285 iz PAK1 olakšava vezivanje PIX/GIT1 i preokret adhezije. FASEB J. 2015; 29:943-959.

20. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM. Otkriće JSI-124 (kukurbitacin I), selektivnog transduktora Janus kinaze/signala i aktivatora inhibitora signalnog puta transkripcije 3 sa snažnom antitumorskom aktivnošću protiv ljudskih i mišjih ćelija raka kod miševa. Cancer Res. 2003; 63:1270-1279.

21. Yeo D, Huynh N, Beutler JA, Christophi C, Shulkes A, Baldwin GS, Nikfarjam M, He H. Glaukarubinon i gemcitabin sinergistički smanjuju rast karcinoma pankreasa putem regulacije p21-aktiviranih kinaza. Cancer Lett. 2014; 346:264-272.

22. Dan C, Kelly A, Bernard O, Minden A. Citoskeletne promjene regulirane PAK4 serin/treonin kinazom posredovane su LIM kinazom 1 i kofilinom. J Biol Chem. 2001; 276:32115-32121.

23. Yang EJ, Yoon JH, Min DS, Chung KC. LIM kinaza 1 aktivira protein koji vezuje elemente koji reaguje na cAMP tokom neuronske diferencijacije besmrtnih hipokampalnih progenitor ćelija. J Biol Chem. 2004; 279:8903-8910.