Upotreba rezultata modula zajedničkog odbacivanja tkiva u transplantaciji bubrega kao objektivne mjere upale alografta

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Arya Zarinsefat 1*, Jose M. Arreola Guerra2 , Tara Sigdel 1 , Izabella Damm1, Reuben Sarwal 1 , Chitranon Chan-on1 , Gyula Szabo3 , Jorge L. Aguilar-Frasco4, Xicohtencatl- Ixtlapal 4

Carlos Salinas-Ramos 4 , Leonardo Ramirez-Martinez 4, Claudio Ramirez 4 , Mario Vilatoba4 , Luis E. Morales Buenrostro4 , Josefifina M. Alberu5 i Minnie M. Sarwal 1

Odsjek za hirurgiju, Univerzitet Kalifornije, San Francisco, CA, Sjedinjene Američke Države,

2 Odjel za internu medicinu, bolnica Centenario Miguel Hidalgo, Aguascalientes, Meksiko,

3 Odsjek za patologiju, Univerzitet Kalifornije, San Francisco, CA, Sjedinjene Američke Države,

4 Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricio´ n Salvador Zubira´ n, Meksiko Siti, Meksiko,

5 Medicinsko odeljenje, Tecnologico de Monterrey, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Meksiko Siti, Meksiko

Dugotrajna transplantacija bubrega(KT) rezultati alografta se nisu poboljšali kako se očekivalo uprkos boljem razumijevanju odbacivanja i poboljšanoj imunosupresiji. Prethodni rad je potvrdio izračunati rezultat odbacivanja, zajednički modul odbacivanja tkiva (tCRM), mjeren procjenom 11 gena zasnovanom na amplifikaciji iz uzoraka biopsije fiksiranih u parafin (FFPE), što omogućava kvantitativnu, nepristrasnu procjenu imunološkog sistema. povreda. Primijenili smo tCRM u prospektivnom ispitivanju na 124 KT primatelja, a kontrastna procjena pomoću tCRM-a i histologije očitava 2 nezavisna patologa o protokolu i uzroku biopsije nakon transplantacije. Četiri 10- mm brijanja uzoraka FFPE biopsije korištena su za ekstrakciju RNK i amplifikaciju qPCR-om 11 tCRM gena, iz kojih je izračunat tCRM rezultat. Biopsijske dijagnoze ili akutnog odbacivanja (AR) ili graničnog odbacivanja (BL) smatrale su se da imaju prisutnu upalu, dok stabilne biopsije nisu imale upalu. Od 77 biopsija koje su pročitala oba patologa, bilo je prisutno ukupno 40 nepodudarnosti u dijagnozi. Srednja vrijednost tCRM rezultata za AR, BL i stabilnu dijagnozu iznosila je 4,87, 1,85 i 1,27, respektivno, sa ukupnom značajnom razlikom među svim histološkim grupama (Kruskal-Wallis, p < 0.0{="" {34}}01).="" postojale="" su="" značajne="" razlike="" u="" tcrm="" rezultatima="" između="" patologa="" koji="" su="" oba="" pronalazila="" upalu="" naspram="" neslaganja="" (p="0.003)," i="" oba="" su="" pronalazila="" upalu="" naspram="" oba="" koja="" nisu="" pronalazila="" upalu="" (p="">< 0.001),="" zajedno="" sa="" ukupnim="" značajem="" između="" svih="" rezultata="" (="" kruskal-wallis,="" p="">< 0,001).="" logistički="" regresijski="" model="" koji="" predviđa="" upalu="" grafta="" koristeći="" različite="" varijable="" kliničkog="" prediktora="" i="" tcrm="" otkrio="" je="" tcrm="" skor="" kao="" jedini="" značajan="" prediktor="" upale="" grafta="" (or:="" 1,90,="" 95="" posto="" ci:="" 1,40–2,68,="" p="">< 0,0001).="" precizna,="" kvantitativna="" i="" nepristrasna="" procjena="" odbacivanja="" kliničkog="" uzorka="" je="" kritična.="" s="" obzirom="" na="" nepodudarne="" dijagnoze="" između="" patologa="" na="" istim="" uzorcima,="" pojedinci="" bi="" mogli="" koristiti="" tcrm="" rezultat="" kao="" rezultat="" u="" nejasnim="" situacijama.="" predlažemo="" da="" kvantitativni="" rezultat="" tcrm="" može="" pružiti="" nepristrasnu="" kvantifikaciju="" upale="" transplantata,="" a="" njegova="" brza="" procjena="" pomoću="" pcr-a="" na="" ffpe="" brijanju="" može="" postati="" kritičan="" dodatak="" koji="" pomaže="" u="" donošenju="" kliničkih="" odluka="" i="" isporuci="">

Ključne riječi:transplantacija bubrega, akutno odbacivanje, biomarkeri, transkriptomika, formalin fiksirani parafin-embedded (FFPE), upala grafta

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

UVOD

Transplantacija bubrega(KT) ostaje preferirani tretman za pacijente sa završnom stadijumom bubrežne bolesti, sa smanjenom stopom smrtnosti u poređenju sa pacijentima na listi čekanja i poboljšanim preživljavanjem među različitim demografskim grupama (1-3). Uprkos značajnim poboljšanjima u jednoj godinibubregpreživljavanje alografta (4), stopa hroničnog gubitka grafta nakon prve godine nakon transplantacije ostaje značajna. Ovo je uočeno uprkos boljem razumevanju odbacivanja alografta, zajedno sa pojavom poboljšane imunosupresije. Trenutne metode klasifikacije histološkog odbacivanja pate od greške uzorkovanja i nemogućnosti da se precizno kvantifikuje inflamatorno opterećenje u alograftu, što je važan prediktor dugoročne funkcije i preživljavanja grafta (5-9). Važno je da su prethodne studije pokazale da patološka korelacija patologije renalnog alografta koji je rangirana po Banffu ima značajna odstupanja između interpretacija biopsije (10, 11).

Prethodni rad u našoj laboratoriji analizirajući podatke mikromreža cijelog genoma iz 1.030bubreg, identificirane biopsije alografta srca, pluća i jetre acommon immunModul odgovora (CRM) od 11 gena koji definiraju akutno odbacivanje (AR) kod različitih alografta (12-14) i naknadno je potvrđen nabubregbiopsije alografta (15, 16). Iako su ovi podaci pokazali potencijalnu korisnost korištenja objektivne mjere kao što je CRM skor za pomoć u dijagnozi biopsije, to su bile retrospektivne analize prethodno postavljenog tkiva. Osim toga, nisu napravljena nikakva poređenja između višestrukih zaslijepljenih očitavanja patologije iste biopsije, ili potencijalne sposobnosti CRM rezultata da se koristi kao objektivni faktor ili pomoćni podaci koji pomažu u postizanju robusnije dijagnoze.

U ovoj analizi, pogledali smo serijskibubregbiopsije koje su dobijene u sklopu kliničkog ispitivanja u KT. Primijenili smo naš protokol koji mjeri ekspresiju gena 11 CRM gena iz RNK izolovane iz četiri 10-mikrona obrijana sa formalinom fiksiranog parafin-embedded (FFPE) bloka sa histološki potvrđenim fenotipovima AR, graničnog odbacivanja (BL), i stabilne dijagnoze. Ovaj rezultat nazivamo tkivnim CRM (tCRM) s obzirom na primenu CRM rezultata na tkivo biopsije (15, 16). Zatim smo uporedili dijagnoze od 2 zaslijepljena patologa i uporedili ih sa tCRM skorom za svaku biopsiju. Pretpostavili smo da bi se tCRM skor mogao koristiti kao podatkovna tačka za pomoć u dijagnozi biopsije, a možda i kao objektivna prelomnica kada postoji neslaganje među patolozima.

cistanche korist: protuupalno

METODE

Upis pacijenata i dizajn studija

Pacijenti i uzorci su prikupljeni kao dio kliničkog ispitivanja TITRATE (Testing Immunosuppression Threshold in Renal Allografts To Extend eGFR). Njegova metodologija se može konsultovati na portalu ClinicalTrials.gov (identifikator: NCT02581436). Ukratko, ovo je prospektivno, slijepo, kontrolirano kliničko ispitivanje na 124 KT primatelja koji su raspoređeni na dvije vrste manevara kako bi se ocijenila efikasnost i sigurnost u smislu pravovremenog otkrivanja AR, brzine glomerularne filtracije (GFR) i indeksa fibroze. u protokolarnim biopsijama 12 mjeseci nakon KT. Praćenje bubrežne funkcije je bazirano na GFR i biopsijama grafta obavljenim po protokolu 3 i 12 mjeseci nakon KT i za uzrok. Indukcijska imunosupresija (IS) je dodijeljena na osnovu imunološkog rizika s baziliksimabom (niskog rizika), anti-timocitnim globulinom (visoki rizik) ili bez indukcijske terapije kod pacijenata koji dijele dva haplotipa. IS održavanja baziran je na takrolimusu, mikofenolatu i prednizonu.

Trenutna studija je bila pomoćna analiza za tCRM gene (15) u svim dostupnim KT biopsijama. Za našu studiju, nakon isključivanja biopsija nultog dana, bilo je dostupno ukupno 136 biopsija sa podudarnom histologijom biopsije, što je sve interpretirao patolog na Nacionalnom institutu medicinskih nauka u Meksiku. Od ovih 136 biopsija, 77 je takođe poslato u UCSF, kako bi se zaslijepljeno očitavanje radi dalje procjene korelacije patologa. Biopsije su interpretirane na osnovu najnovijih Banffovih kriterija u vrijeme studije (17). Bilo koji oblik AR transplantata (akutni ćelijski ili posredovan antitijelima) je kombinovan u jednu kategoriju AR. Za biopsije koje je očitao UCSF, bilo je dostupno više granularnih histopatoloških dijagnostičkih podataka, uključujući tip odbacivanja posredovanog antitijelima (ABMR) i tip odbacivanja posredovanog T-ćelijama (TCMR).

Totalna ekstrakcija RNK

Pratili smo prethodno objavljen protokol za ekstrakciju RNK iz FFPE tkiva (18). Na osnovu našeg prethodnog iskustva, koristili smo sekcije debljine 4 × 10 mm za ekstrakciju ukupne RNK iz FFPE uzoraka pomoću PureLink FFPE Total RNA Isolation it (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA). Kvalitet RNK podataka je procijenjen omjerom apsorpcionog signala 260/280 i RIN brojem.

Sinteza cDNA i kvantifikacija ekspresije gena pomoću qPCR

Ukupno 50 ng RNK je reverzno transkribirano u komplementarnu DNK (cDNK) korištenjem SuperScript VILO (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA), a zatim je amplificirano u koraku specifičnog amplifikacionog cilja za svih 11 gena koristeći TaqMan PreAmp Master Mix i TaqMan prajmeri i sonde (Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA) za ukupno 18 ciklusa pojačanja. qPCR reakcije su izvedene u Fluidigm BioMark FD sistemu (Fluidigm, Južni San Francisco, Kalifornija) koristeći 18S gen za održavanje domaćinstva i Human XpressRef Universal Total RNA (Qiagen, Valencia, CA) kao referentnu RNK za 40 ciklusa. Dobijeni podaci o čipu su inicijalno analizirani za kontrolu kvaliteta korišćenjem BioMark Analysis Software Version 2.0 (Fluidigm, South San Francisco, CA) i vrednosti Ct su izvezene u tabelu. Normalizacija podataka obavljena je u dva koraka. Vrijednosti Ct pojedinačnih gena su normalizirane u odnosu na vrijednost Ct od 18S za svaki gen da bi se dobile vrijednosti dCt. dCt vrijednosti svakog uzorka su normalizirane u odnosu na dCt vrijednosti referentnog uzorka kako bi se dobile ddCt vrijednosti koje su naknadno korištene za izračunavanje vrijednosti promjene puta (RQ) za svaki gen u svakom uzorku. tCRM skor je izračunat uzimanjem geometrijske sredine 11 CRM gena za svaki uzorak, kao što je prethodno opisano (12).

Statistička analiza

Svi podaci su uvezeni u R verziju 3.6.2 (R fondacija, Beč, Austrija) za naknadne analize. Demografija pacijenata (Tabela 1) prikazana je na osnovu tCRM skora većeg ili manjeg od 2,2, naše prethodno utvrđene granice sa optimalnim AUROC za predviđanje AR (15). Statističko testiranje izvršeno je Studentovim t-testom za kontinuirane varijable i hi-kvadrat testom za kategoričke varijable. Bubble i bar plotovi tCRM skora za svaku patološku dijagnostičku grupu napravljeni su pomoću paketa ggplot2. Značajne razlike između svih patoloških grupa i parne razlike između svake grupe utvrđene su Kruskal-Wallisovim testom. Izvršeno je nenadzirano hijerarhijsko grupisanje koristeći različite patološke grupe i tCRM gene, sa naknadnim toplotnim mapama napravljenim korištenjem paketa toplotne karte. Smatrali smo da tCRM rezultati veći od 2,2 imaju molekularnu dijagnozu odbacivanja. Definirali smo biopsiju kao pozitivnu na upalu ako je patološka dijagnoza bila AR ili BL i negativnu na upalu ako je dijagnoza bila stabilna. Zatim smo napravili varijablu dogovora između patologa, gdje su obojica izjavili da je upala prisutna, obojica su rekli da nema upale ili se nisu složili ako je bilo kakva upala prisutna. Potom su napravljene trake i toplotne karte za tCRM rezultate među varijablom dogovora kako je gore opisano.

Izračunali smo model logističke regresije da bismo predvidjeli binarni ishod upale na biopsiji. Unosimo dob primatelja, indeks tjelesne mase (BMI), odgođenu funkciju transplantata (DGF), spol, režim indukcije, status živog donora, muškog donora primaocu, prethodni KT, dijalizu prije KT i tCRM rezultat kao prediktorske varijable u model.

Dobili smo delta GFR svakog pacijenta, izračunatu kao promjena GFR u njihovom vremenu biopsije u odnosu na konačnu GFR dvije godine nakon KT. Koristili smo Pearsonov koeficijent korelacije da povežemo delta GFR sa pacijentovim tCRM rezultatom koji je dobijen iz biopsije. Ovo je ponovljeno nakon što su isključeni rezultati tCRM manji od 2. Koristili smo najviše nivoe specifičnih antitijela (DSA) za donora koji su izmjereni citometrijom za svakog pacijenta, predstavljen kao srednji intenzitet fluorescencije FL (MFI), da bismo izvršili korelaciju sa rezultatima tCRM i izračunati pridruženi Pearsonov koeficijent korelacije. Ova korelacija je također predstavljena u formatu dijagrama raspršenosti. Za analizu serijskih rezultata, ucrtali smo pacijente sa serijskim tCRM rezultatima po danima nakon transplantacije, fokusirajući se na četiri pacijenta koji su imali originalnu dijagnozu AR, liječeni su, a zatim su praćeni naknadnom biopsijom. Dva dodatna pacijenta koji su imali povišene tCRM rezultate za koje je očitano da imaju stabilnu dijagnozu, ali su potom razvili novu dijagnozu AR na svojim naknadnim biopsijama također su ucrtani. Dizajn studije i naknadna analiza su dalje sumirani u slikovnom obliku (Slika 1).

REZULTATI

Nalazi biopsije alografta bubrega od dva nezavisna, slijepa patologa

Demografija pacijenata i kliničke varijable od interesa nisu pokazale veće razlike između pacijenata koji su imali tCRM skor veći ili manji od 2,2, osim u većoj dobi donora kod pacijenata s povišenim tCRM skorima na posttransplantacijskim biopsijama (Tabela 1). Oba centra su očitala ukupno 77 biopsija, pri čemu je patolog 1 (Meksiko) dijagnosticirao 16 AR, 21 BL i 40 stabilnih biopsija, dok je patolog 2 (UCSF) dijagnosticirao 10 AR, 39 BL i 28 stabilnih biopsija (Tabela 2) . Bilo je ukupno 40 neusklađenih dijagnoza između patologa, pri čemu je najveći dio ovih neusklađenosti proizašao iz razlika u BL kategoriji.

Modul zajedničkog odbacivanja tkiva kao prelomni faktor razlikuje između patoloških dijagnoza

Zatim smo pogledali sposobnost tCRM skora da napravi razliku između patoloških dijagnoza za jednog patologa (koristeći biopsije očitane na UCSF, s obzirom da smo imali najdetaljnije dostupne histopatološke podatke). Gledajući tCRM rezultate histološkom dijagnozom, vidjeli smo jasno razdvajanje s višim tCRM rezultatima kod pacijenata sa AR u poređenju sa BL/stabilnim, i sa većim udjelom rezultata > 2,2 kod pacijenata s AR (slika 2A). Srednji tCRM rezultati i interkvartilni rasponi (IQR) za AR, BL i stabilne dijagnoze bili su 4,87 (IQR: 2,44–6,99), 1,85 (IQR: 1,21–2,48) i 1,27 (IQR: 0.96 2.14). Dodatno, postojala je ukupna značajna razlika među svim histološkim grupama (p < 0.001),="" zajedno="" sa="" značajnim="" razlikama="" između="" ar="" naspram="" bl="" i="" ar="" naspram="" stabilnih="" parnih="" poređenja="" (slika="" 2b).="" ovo="" naglašava="" korelaciju="" tcrm="" rezultata="" s="" banff-gradiranom="">

Kada se vrši nenadzirano hijerarhijsko grupisanje tCRM gena, vidimo relativno tačno grupisanje prema patološkoj dijagnozi (slika 2C). Prilikom pomnog pregleda svake biopsije, čak i kada grupiranje prema dijagnozi pokazuje heterogenost u grupisanim grupama, odgovarajući tCRM skor (prikazan kao gradijent boje) ima tendenciju da korelira sa dijagnozom. Vidimo više rezultate sa dijagnozama koje odražavaju veće nivoe upale, što označava sposobnost tCRM-a da diskriminira i objektivno kvantifikuje upalu u alograftu bez pristrasnosti. Kada smo iskoristili tCRM graničnu vrijednost od 2,2 (molekularna dijagnoza upale), vidimo snažno grupiranje molekularnom dijagnozom. Bez obzira na to, većina AR i BL klaster zajedno sa visokom ekspresijom gena i visokim tCRM skorom, sa suprotnim za većinu histološki gradiranih stabilnih biopsija.

Modul zajedničkog odbacivanja tkiva razlikuje specifične vrste odbacivanja transplantata

Zatim smo pogledali sposobnost tCRM skora da razlikuje različite vrste odbijanja: C4d-pozitivan (n=9) i negativan ABMR (n=4), TCMR (n=3) , BL (n=21) i stabilne (n=40) biopsije. Srednji tCRM rezultati i IQR za C4d pozitivan ABMR, C4d negativan ABMR, TCMR, BL i stabilne dijagnoze bili su 4,22 (IQR: 3,80–5,98), 3,47 (IQR: 1,71–6,51), 2.{ {23}} (IQR: 2,58–3.05), 1,91 (IQR: 1,32–2,88) i 1,37 (IQR: 0,99–2.00), respektivno. Dodatno, postojala je ukupna značajna razlika među svim histološkim grupama (p < 0,001),="" zajedno="" sa="" značajnim="" razlikama="" među="" poređenjima="" u="" paru="" gledajući="" c4d-pozitivan="" abmr="" naspram="" tcmr,="" c4d-pozitivan="" abmr="" naspram="" bl,="" c4d-pozitivan="" abmr="" naspram="" stabilnog="" ,="" tcmr="" naspram="" stabilnih="" i="" bl="" naspram="" stabilnih="" grupa="" (slika="" 3a).="" ovo="" još="" jednom="" naglašava="" korelaciju="" tcrm="" rezultata="" sa="" specifičnom="" banff-gradiranom="">

Prilikom obavljanja nenadziranog hijerarhijskog grupiranja tCRM gena, vidimo slične obrasce grupiranja na osnovu upale grafta kao što je prethodno opisano (slika 3B). Sa specifičnijim dijagnostičkim kategorijama C4d-pozitivnog i negativnog ABMR-a i TCMR-a, vidimo najprimetnije homogeno grupisanje među ABMR grupama. Kao i ranije, kada se pomno pregleda svaka biopsija, čak i kada grupiranje prema dijagnozi pokazuje heterogenost u grupisanim grupama, odgovarajući tCRM skor (prikazan kao gradijent boje) ima tendenciju da korelira sa dijagnozom. Vidimo više rezultate sa dijagnozama koje odražavaju veće nivoe upale, što označava sposobnost tCRM-a da diskriminira i objektivno kvantifikuje upalu u alograftu bez pristrasnosti. Konačno, prva grana našeg nenadziranog grupiranja sadržavala je većinu uzoraka koji su imali bilo koji stepen upale grafta, posebno bilo koji slučaj ABMR, TCMR ili BL (Slika 3B).

Modul zajedničkog odbacivanja tkiva diskriminira prema slaganju/neslaganju patologa

Zatim smo pogledali tCRM rezultate za slaganje i neslaganje među patolozima, što je definisano kao što je prethodno objašnjeno. Od 77 biopsija nakon transplantacije koje su pročitala oba patologa, obojica su izjavila da postoji upala u 33,8 posto, bez upale u 22,1 posto, a nisu se složili sa prisustvom upale u 44,2 posto uzoraka. Prilikom ispitivanja tCRM rezultata, primijetili smo povećanje rezultata kako je varijabla slaganja napredovala od odsustva upale, neslaganja i slaganja u pogledu prisutnosti upale (Slika 4A). Postojale su značajne razlike u tCRM rezultatima između patologa koji su oba pronalazila upalu nasuprot neslaganja (p=0.00}3), i oba su pronalazila upalu naspram oba koja su otkrila da nema upale (p < 0,001="" ),="" zajedno="" sa="" ukupnim="" značajem="" između="" svih="" rezultata="" (p=""><>

Prilikom obavljanja nenadziranog hijerarhijskog grupiranja tCRM gena, vidjeli smo grupiranje uzoraka biopsije na osnovu varijable slaganja (Slika 4B). Možemo vidjeti da klasteri visoke ekspresije gena odgovaraju tome da se oba patologa slažu oko prisutnosti upale, dok nasuprot tome, niska ekspresija gena odgovara tome da se oba patologa slažu da nema upale ili neslaganja između njih. Osim toga, vidimo da odgovarajući tCRM skor za svaku biopsiju ima tendenciju da favorizuje više i niže rezultate gdje su se patolozi složili da postoji upala ili da nema upale, respektivno. Iako grupisanje nije savršeno, vidljiv je jasan trend.

Zajednički modul odbacivanja tkiva kao prediktor odbacivanja i funkcije transplantata Iznad, pokazujemo kliničku korisnost tCRM-a u vezi sa postavljanjem tačnih patoloških dijagnoza. Iako se njegova primjena tamo odnosi na ono što je tradicionalno dijagnoza dokazana biopsijom, željeli smo istražiti upotrebu tCRM-a u modelu za predviđanje odbacivanja/upale. Koristeći našu binarnu varijablu upale (AR i BL biopsije), kreirali smo model logističke regresije za predviđanje binarnog ishoda upale na biopsiji. Korištene kliničke varijable su prethodno opisane (Tabela 3). Zanimljivo je da je jedini značajan prediktor upale kako je dijagnosticirana patologijom bio tCRM skor (OR: 1,90, 95 posto CI: 1,40–2,68, p < 0.{{16="" }}01),="" dok="" je="" prisustvo="" muškog="" donora="" za="" primaoca="" bilo="" protektivno="" sa="" graničnim="" značajem="" (or:="" 0,27,="" 95="" posto="" ci:="" 0,07–0,98,="" p="">

Zatim smo pogledali sposobnost tCRM-a da predvidi dugoročne promjene GFR-a. Povezali smo delta GFR (od GFR u vrijeme biopsije do konačnog GFR) sa pacijentovim tCRM rezultatom iz te biopsije (Pearsonov koeficijent korelacije=0.21, p=0.{{6} }25). Zatim smo ovo ponovili nakon što smo isključili tCRM rezultate manje od 2, tako da smo gledali samo najpovišene vrijednosti tCRM da bismo vidjeli učinak na delta GFR, što je rezultiralo povećanjem koeficijenta korelacije na 0,32 (p=0. 05). Takođe smo pogledali korelaciju najvišeg nivoa DSA svakog pacijenta sa njihovim povezanim tCRM skorom (dopunska slika 1), da vidimo da li postoji bilo kakva povezanost između nivoa DSA i rezultata tCRM, za koje nismo ustanovili da su korelirani (Pearsonov koeficijent korelacije { {11}}, p=0.99).

Konačno, pogledali smo pacijente koji su imali serijske biopsije i tCRM rezultate. Serijski tCRM rezultati su ucrtani po pacijentu prema danima nakon transplantacije (Slika 4C). Bilo je četiri pacijenta koji su imali originalnu dijagnozu AR i liječeni su, a zatim je uslijedila naknadna biopsija (Slika 4C, crvene linije). Primijetili smo da su sva četiri pacijenta u početku imala povišen tCRM skor, a nakon tretmana je njihov rezultat bio smanjen, pri čemu je samo jednom pacijentu dijagnosticiran AR na drugoj biopsiji. Treba napomenuti da su dva pacijenta koja su imala povišene tCRM rezultate za koje je patolog pročitao da imaju stabilnu dijagnozu razvila povećanje svog tCRM rezultata i novu dijagnozu AR na svojim naknadnim biopsijama (Slika 4C, plave linije).

ekstrakt cistanche tubulosa:poboljšati funkciju bubrega

DISKUSIJA

Pretpostavili smo da bi se tCRM skor mogao koristiti kao podatkovna tačka za pomoć u dijagnozi biopsije, a možda i kao objektivna prelomnica kada postoji neslaganje među patolozima. Iznad pokazujemo da tCRM skor može razlikovati patološke dijagnoze. tCRM je u stanju da razlikuje kombinovane AR naspram BL naspram stabilnih uzoraka i takođe može da razlikuje specifičnije AR dijagnoze kao što su ABMR naspram TCMR i ABMR naspram BL, kao što smo gore pokazali. Jedan od poznatih nedostataka kombinovane subjektivne/objektivne prirode Banfovih kriterijuma je da mogu postojati neslaganja između patologa koji gledaju identične uzorke biopsije. Gore smo pokazali da je neslaganje između patologa u pogledu upalnog opterećenja u biopsijama bubrega uobičajeno. Pokazujemo da kada postoji slaganje među patolozima o prisutnosti ili odsustvu upale, to ima tendenciju da bude u ekstremnim granicama tCRM rezultata. Dio korisnosti u tCRM rezultatu može biti ovdje, u njegovoj sposobnosti da pruži objektivnu mjeru upale, ali i služi kao prelomnica u slučajevima kada dijagnoza nije jasna, ali tCRM rezultat jasno ukazuje na ovaj ili onaj način. Na primjer, patolog koji čita biopsiju za koju nije siguran da će je klasificirati kao AR ili BL, ali s vrlo visokim tCRM rezultatom, mogao bi biti objektivniji i precizniji u postavljanju dijagnoze AR.

Osim toga, ova studija ukazuje da se tCRM skor može koristiti za predviđanje dugoročnijih kliničkih ishoda. Iako je korelacija između promjena GFR i viših tCRM rezultata slaba, pokazali smo statistički značajnu pozitivnu korelaciju između njih, s još većom korelacijom kada smo filtrirali za tCRM rezultate veće od 2, što sugerira da više povišeni rezultati sugeriraju veći stupanj alografta ozljeda koja može predvidjeti dugoročno smanjenu funkciju grafta (veća delta GFR). Zanimljivo je da nismo pronašli korelaciju između nivoa DSA kod pacijenata i tCRM rezultata. Ovo može biti dijelom zbog činjenice da mnogi pacijenti sa DSA ne razvijaju nužno ABMR, zajedno sa saznanjem da različiti DSA mogu predstavljati različite rizike od stvarnog razvoja ABMR. Dodatno, praćenjem pacijenata sa serijskim biopsijama i tCRM rezultatima, pokazali smo da je većina pacijenata s povišenim tCRM rezultatima i AR imala naknadno smanjenje svojih rezultata, zajedno s poboljšanjem upale grafta na narednim biopsijama (naknadna histologija je otišla od AR do stabilne ). Značajno, postojala su 2 slučaja u kojima su tCRM rezultati bili značajno povišeni, ali je patološka dijagnoza bila stabilna na biopsiji. Oba ova slučaja su rezultirala još više povišenim tCRM rezultatom na naknadnoj biopsiji, uz odgovarajuću patološku dijagnozu AR. Ovo ukazuje na mogućnost ili pogrešne dijagnoze zbog subjektivne prirode histološke klasifikacije, ili da povećana ekspresija tCRM gena koji su u korelaciji s upalom grafta, može prethoditi stvarnim patološkim nalazima koji bi rezultirali dijagnozom AR. Bez obzira na to, ovo sugerira korisnost objektivnijeg tCRM rezultata u pomaganju u postavljanju dijagnoze AR.

Molekularnu kvantifikaciju ukupnog inflamatornog opterećenja u bubrežnom alograftu važno je utvrditi u vrijeme invazivne biopsije (5, 6, 9). Naša metoda olakšava korištenje već dostupnih uzoraka biopsije na efikasan način (ukupno vrijeme eksperimenta je 4-6 h za prikazane testove). Dok se neinvazivni testovi, kao što je DNK bez ćelija (dd-cfDNA), predlažu za ranu dijagnozu AR (19-23), jedan nedostatak ovih testova je što ne ispituju direktno ciljno tkivo interes, čak i ako se dd-cfDNA oslobodi iz alografta. Uz tCRM, tkivo za biopsiju koje se već dobija može se obraditi koristeći minimalno tkivo iz svježih biopsija ili arhiviranih FFPE blokova, čuvajući većinu roditeljskog FFPE bloka za dodatne histološke analize.

Naša studija je djelimično ograničena invazivnom prirodom tCRM-a. Biopsije ostaju zlatni standard i često se dobijaju, omogućavajući molekularno profilisanje pomoću tCRM-a, ali na kraju, prelazak na neinvazivne testove na krvi ili urinu bi bio najidealniji za pacijente. Naša laboratorija trenutno radi na upotrebi CRM gena u urinu za pomoć u dijagnostici odbacivanja transplantata (14). Osim toga, dok je ova studija bila prospektivno ispitivanje, primjena tCRM-a nije korištena za kliničko odlučivanje, već je umjesto toga bila istraživačka analiza. Naš budući rad bi imao koristi od razmatranja tCRM rezultata kao moguće krajnje tačke ili stvarnog uračunavanja rezultata prilikom odlučivanja o konačnoj patološkoj dijagnozi za uzorak biopsije. Osim toga, dok su uzorci naše studije uključivali TCMR dijagnoze, većina naših dostupnih uzoraka za analizu bili su ABMR uzorci. Dok pokazujemo da je tCRM skor povišen bez obzira na vrstu prisutne AR, budući rad će morati koristiti veći broj uzoraka unutar svake kategorije specifičnog tipa AR.

Pokazali smo da tCRM skor može razlikovati patološke dijagnoze, koristeći već dostupne FFPE uzorke. Važno je da postoji varijabilnost među različitim patolozima, što je pokazano u našim podacima na osnovu dva zaslijepljena patologa koji postavljaju dijagnoze. Kao takvi, pokazujemo da ne samo da tCRM može pomoći u patološkoj dijagnozi, već posebno kada postoji neslaganje ili nesigurnost, rezultat se može koristiti za postizanje konačnog, robusnijeg zaključka.

korist cistanche tubulosa: liječenje bolesti bubrega

IZJAVA O DOSTUPNOSTI PODATAKA

Sirove podatke koji podržavaju zaključke ovog članka autori će staviti na raspolaganje, bez nepotrebnih rezervi.

ETIČKA IZJAVA

Studije koje su uključivale ljudske učesnike pregledao je i odobrio UCSF IRB. Pacijenti/učesnici su dali svoj pismeni informirani pristanak za učešće u ovoj studiji.

DOPRINOSI AUTORA

AZ je doprinio dizajnu analize, analizi podataka, interpretaciji, pisanju rukopisa i uređivanju rukopisa. JG je doprinio dizajnu studije, prikupljanju podataka i pregledu rukopisa. TS je doprinio analizi podataka i uređivanju rukopisa. ID je doprinio obradi uzorka. RS i GS su doprinijeli obradi uzorka. CC je doprinio obradi i pregledu uzorka. JF, XC, CSR, LM i CR doprinijeli su prikupljanju uzoraka i baze podataka. MV je doprinio upisu pacijenata i transplantaciji. LB je doprinijela upisu pacijenata. JA je doprinio dizajnu studije, prikupljanju podataka i pregledu rukopisa. MS je doprinio dizajnu studije, prikupljanju podataka, dizajnu analize i pregledu rukopisa. Svi autori dali su doprinos članku i odobrili dostavljenu verziju.

poboljšati funkciju bubrega cistanche tubulosa

REFERENCE

1. Wolfe RA, Ashby VB, Milford EL, Ojo AO, Etenger RE, Agodoa LY, et al. Poređenje mortaliteta svih pacijenata na dijalizi, pacijenata na dijalizi koji čekaju transplantaciju i primalaca prve kadaverične transplantacije.N englJ Med(1999) 341(23):1725–30. doi: 10.1056/NEJM 199912023412303

2. Meier-Kriesche HU, Ojo AO, Port FK, Arndorfer JA, Cibik DM, Kaplan B. Poboljšanje preživljavanja među pacijentima sa završnom stadijumom bubrežne bolesti: trendovi tokom vremena za primaoce transplantacije i pacijente na čekanju.J Am Soc Nefrol(2001) 12(6):1293–6. DOI: 10.1111/j.1600-6143.2004.00332.x

3. Oniscu GC, Brown H, Forsythe JLR. Utjecaj kadaverične transplantacije bubrega na preživljavanje pacijenata na listi za transplantaciju.J Am Soc Nephrol(2005) 16 (6):1859–65. DOI: 10.1681/ASN.2004121092

4. Hariharan S, Johnson CP, Bresnahan BA, Taranto SE, McIntosh MJ, Stablein D. Poboljšano preživljavanje grafta nakon transplantacije bubrega u Sjedinjenim Državama, 1988-1996.N englJ Med(2000) 342(9):605–12. DOI: 10.1056/NEJM 200003023420901

5. Pineda S, Sigdel TK, Liberto JM, Vincenti F, Sirota M, Sarwal MM. Karakterizacija rizika od odbacivanja bubrega prije transplantacije i nakon transplantacije sekvenciranjem imunološkog repertoara B ćelija.Nat Commun(2019) 10(1):1906. DOI: 10.1038/s41467-019-09930-3

6. Halloran PF, Famulski K, Reeve J. Molekularni fenotipovi odbacivanja u biopsijama transplantacije bubrega.Curr Opin Orgulje Transplant (2015) 20(3):359–67. DOI: 10.1097/MOT.0000000000000193

7. Li L, Khatri P, Sigdel TK, Tran T, Ying L, Vitalone MJ, et al. Dijagnostički test periferne krvi za akutno odbacivanje kod transplantacije bubrega.Am JTransplant(2012) 12(10):2710–8. DOI: 10.1111/j.1600-6143.2012. 04253.x

8. Roedder S, Sigdel T, Salomonis N, Hsieh S, Dai H, Bastard O, et al. Kratki test za otkrivanje pacijenata sa transplantiranim bubregom s visokim rizikom od akutnog odbacivanja: rezultati multicentrične AART studije.PloS Med(2014) 11(11): e1001759. DOI: 10.1371/journal.pmed.1001759

9. Naesens M, Khatri P, Li L, Sigdel TK, Vitalone MJ, Chen R, et al. Progresivna histološka oštećenja bubrežnih alografta povezana su s ekspresijom gena urođenog i adaptivnog imuniteta.Kidney Int(2011) 80(12):1364–76. DOI: 10.1038/ki.2011.245

10. Furness PN, Taub N, Assmann KJM, Ban G, Cosyns JP, Dorman AM, et al. Međunarodne varijacije u histološkom gradiranju su velike, a uporne povratne informacije ne poboljšavaju reproduktivnost.Am J Surg Pathol (2003) 27(6):805–10. doi: 10.1097/00000478-200306000-00012

11. Veronese FV, Manfro RC, Roman FR, Edelweiss MI, Rush DN, Dance S, et al. Reproducibilnost Banffove klasifikacije u subkliničkom odbacivanju transplantata bubrega.ClinTransplant(2005) 19(4):518–21. doi: 10.1111/j.1399- 0012.2005.00377.x

12. Khatri P, Roedder S, Kimura N, De Vusser K, Morgan AA, Gong Y, et al. Zajednički modul odbacivanja (CRM) za akutno odbacivanje više organa identifikuje nove terapeutike za transplantaciju organa.J Exp Med(2013) 210 (11):2205–21. doi: 10.1084/jem.20122709

13. Sacreas A, Yang JYC, Vanaudenaerde BM, Sigdel TK, Liberto JM, Damm I, et al. Uobičajeni modul odbacivanja kod kroničnog odbacivanja nakon transplantacije pluća.PloS One(2018) 13(10):e0205107. doi: 10.1371/ journal.pone.0205107

14. Sigdel TK, Yang JYC, Bestard O, Schroeder A, Hsieh SC, Liberto JM, et al. Indeks zajedničkog modula odbacivanja urina (CRM) za neinvazivno praćenje transplantacije bubrega.PloS One(2019) 14(7):e0220052. doi: 10.1371/ journal.pone.0220052

15. Sigdel TK, Bestard O, Tran TQ, Hsieh SC, Roedder S, Damm I, et al. Računalni rezultat genske ekspresije za predviđanje imunoloških ozljeda kod bubrežnih alografta.PloS One(2015) 10(9):e0138133. doi: 10.1371/časopis. pone.0138133

16. Sigdel T, Nguyen M, Liberto J, Dobi D, Junger H, Vincenti F, et al. Procjena 19 gena i validacija CRM genskog panela za kvantitativnu transkripcionu analizu molekularnog odbacivanja i inflamacije u arhivskim biopsijama transplantacije bubrega.Front Med (2019) 6:213. doi: 10.3389/ feed.2019.00213

17. Haas M, Loupy A, Lefaucheur C, Roufosse C, Glotz D, Seron D, et al. Izvještaj sa sastanka o bubrezima Banff 2017: Revidirani dijagnostički kriteriji za kronično aktivno odbacivanje posredovano T stanicama, odbacivanje posredovano antitijelima i izgledi za integrativne krajnje tačke za klinička ispitivanja sljedeće generacije.Am J Transplant(2018) 18(2):293–307. doi: 10.1111/ajt.14625

18. Sigdel TK, Nguyen M, Dobi D, Hsieh SC, Liberto JM, Vincenti F, et al. Ciljano transkripciono profilisanje biopsija za transplantaciju bubrega.BubregIntRep(2018) 3(3):722–31. doi: 10.1016/j.ekir.2018.01.014

19. Bloom RD, Bromberg JS, Poggio ED, Bunnapradist S, Langone AJ, Sood P, et al. DNK bez ćelija i aktivno odbacivanje u alograftu bubrega.J Am Soc Nephrol(2017) 28(7):2221–32. doi: 10.1681/ASN.2016091034

20. Lee H, Park YM, We YM, Han DJ, Seo JW, Moon H, et al. Evaluacija digitalnog PCR-a kao tehnike praćenja akutnog odbacivanja u transplantaciji bubrega.GenomikaInform(2017) 15(1):2–10. doi: 10.5808/ GI.2017.15.1.2

21. Adamek M, Opelz G, Klein K, Morath C, Tran TH. Brza i jednostavna metoda za detekciju i kvantifikaciju DNK bez ćelija dobijene od donora u serumima primatelja čvrstih transplantiranih organa kao biomarker za funkciju grafta.Clin Chem Lab Med(2016) 54(7):1147–55. doi: 10.1515/cclm-2015-0622

22. Beck J, Oellerich M, Schulz U, Schauerte V, Reinhard L, Fuchs U, et al. DNK bez ćelija dobijena od donora je novi univerzalni biomarker za odbacivanje alografta u transplantaciji solidnih organa.Transplant Proc(2015) 47 (8):2400–3. doi: 10.1016/j.transproceed.2015.08.035

23. Beck J, Bureau S, Balzer S, Andag R, Kanzow P, Schmitz J, et al. Digitalni kapljični PCR za brzu kvantififikaciju donora DNK u cirkulaciji primaoca transplantata kao potencijalni univerzalni biomarker ozljede grafta.Clin Chem (2013) 59(12):1732–41. doi: 10.1373/clinchem.2013.210328