Dio 1|Hiperaktivnost glikogen sintaze kinaze 3b u urinarnim eksfolijiranim stanicama predviđa progresiju dijabetesne bolesti bubrega

Xianhui Liang, et al

1Centar za pročišćavanje krvi, Institut za nefrologiju, Prva pridružena bolnica Univerziteta Zhengzhou, Zhengzhou, Kina; 2Odjel za medicinu, Odsjek za bubrežne bolesti i hipertenziju, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, SAD; i 3 Odsjek za medicinu, Odsjek za nefrologiju, Medicinski fakultet Univerziteta Toledo, Toledo, Ohajo, SAD

Za više informacija kontaktirajte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Sve veći dokazi ukazuju na to da je glikogen sintaza kinaza (GSK)3b ključni igrač u različitimbolesti bubrega. Međutim, kao ključnog transduktora signalnog puta inzulina, uloga GSK3b kod dijabetičarabubreg bolestostaje neizvesno. Kod DB/DB miševa, bubrežna ekspresija ukupnog i aktiviranog GSK3b bila je sve više povišena. To je prethodilo razvoju dijabetičarabubreg bolesti u korelaciji sa progresijom znakovadijabetičarbubregozljede, uključujući albuminuriju i nakupljanje ekstracelularnog matriksa u glomerulima i tubulointersticijalnim. In vitro, izlaganje glomerularnih podocita, mezangijalnih ćelija i bubrežnih tubularnih ćelija dijabetičkom miljeu izazvalo je GSK3boverekspresiju i hiperaktivnost, što se čini neophodnim i dovoljnim za izazivanjedijabetičarćelijska oštećenja u ćelijama bubrega, jer je citopatski efekat dijabetičkog miljea ublažen obaranjem GSK3b, ali je oponašan ektopičnom ekspresijom konstitutivno aktivnog GSK3b čak iu normalnom okruženju. Nedosljednost, uzorci biopsije bubrega dobiveni od pacijenata s različitim stadijumima dijabetičke nefropatije otkrili su pojačanu ekspresiju ukupnog i aktiviranog GSK3b u glomerulima i bubrežnim tubulima, povezanu s ozbiljnošću dijabetičke nefropatije. Štaviše, u retrospektivnim kohortama pacijenata sa dijabetesom tipa 2 koji su praćeni više od pet godina, relativna aktivnost GSK3b u ćelijama eksfolijiranih urinarnih ćelija predstavljala je nezavisni faktor rizika za razvoj ili progresiju oštećenja bubrega. Nadalje, analiza operativne krivulje prijemnika pokazala je da aktivnost GSK3b u ćelijama eksfolijiranih u mokraći daje mnogo bolju snagu od albuminurije kod pacijenata sa dijabetesom s progresivnim oštećenjem bubrega od onih sa stabilnom funkcijom bubrega. Dakle, bubrežna ekspresija i aktivnost GSK3b se pojačavaju u eksperimentalnoj i kliničkoj dijabetičkoj nefropatiji. Dakle, GSK3b u ćelijama eksfolijiranih urina može poslužiti kao novi biomarker za predviđanje dijabetesabubregbolestprogresija.

Dijabetička bolest bubrega(DKD) i dalje je vodeći uzrok završnog stadijuma zatajenja bubrega u Sjedinjenim Državama i drugim razvijenim zemljama.1,2 Međutim, ne razvijaju svaki pacijent sa dijabetesom melitus dijabetičku nefropatiju (DN), o čemu svjedoči niz dugotrajnih termin epidemiološke studije praćenja.3 Razlog za ovaj heterogeni ishod nije u potpunosti shvaćen, ali je naizgled multifaktorski, uključujući različite uzročne faktore, uključujući genetiku, okruženje, već postojećebubregbolesti ozbiljnost dijabetesa.4,5 Loša kontrola glikemije je dobro poznati faktor rizika za albuminuriju i DN. Ipak, značajan dio pacijenata i dalje razvija DN uprkos strogoj kontroli glikemije.6 U kliničkoj praksi, neophodno je usvojiti osjetljiv i precizan biomarker za stratifikaciju dijabetičara kod kojih postoji rizik od napredovanja do oštećenja bubrega. Godinama se albuminurija smatrala surogat markerom bubrežnih komplikacija kod dijabetesa.7,8 Ipak, sve veći broj dokaza sugerira da albuminurija možda nije tačna.9,10 Zapažena je značajna neslaganja između albuminurije i oštećenja bubrega u DN. 11,12 Prema podacima Prospektivne studije o dijabetesu Ujedinjenog Kraljevstva,13 od onih pacijenata koji su razvili oštećenje bubrega, 61 posto nije imalo albuminuriju prije, a 39 posto nikada nije razvilo albuminuriju tokom studije. Isto tako, od onih pacijenata koji su razvili albuminuriju, samo 24 posto je kasnije razvilo oštećenje bubrega tokom studije. Drugim riječima, kod pacijenata s mikroalbuminurijom ili makroalbuminurijom, preovlađujuća većina možda neće razviti oštećenje bubrega. Ovi podaci stoga osporavaju klasičnu paradigmu albuminurije koja uvijek prethodi oštećenju bubrega tokom progresije DKD. Kao takav, imperativ je identificirati nove biomarkere.

za predviđanje DN ili za ranu dijagnozu DN. U protekloj deceniji testiran je niz novih molekula.14–16 Među njima, glikogen sintaza kinaza 3 (GSK3) se pojavila kao atraktivan kandidat. GSK3 je visoko očuvana, sveprisutno eksprimirana serin/treonin-protein kinaza koja je prvobitno bila okarakterisana kao ključni transduktor inzulinske signalne kaskade i upravlja glikogenezom. Interes za GSK3 se uvelike povećao sa spoznajom da on djeluje i kao tačka konvergencije za višestruke ćelijske signalne puteve uključene uupala, imunomodulacija, embriogeneza, ozljeda tkiva, popravak i regeneracija.17–19 GSK3 postoji kao 2 izoforme: GSK3a i GSK3b. U različitim tkivima organa, 2 izoforme su različito izražene. U korteksu bubrega, b izoforma je pretežno eksprimirana i locirana u glomerulima i proksimalnim tubularnim ćelijama.20,21 Bubrežna prekomjerna aktivnost GSK3b povezana je s različitim nizom bolesti bubrega, uključujući proteinurične glo-neuropatije i progresivnu hroničnu bolest bubrega.22 Ipak , kao ključnog transduktora inzulinskog signalnog puta, uloga GSK3b u patogenezi DN je još nepoznata. Ostaje da se razjasni da li je disregulacija GSK3b u bubrezima uključena u DN. Kako bi se riješio ovaj problem, ova studija je ispitala profile ekspresije ukupnog i aktiviranog GSK3b u uzorcima bubrega dobijenim iz dB/dB mišjih modela neinzulinsko-zavisne DN i u tkivima biopsije bubrega pacijenata sa različitim stadijumima DN tipa 2. Pored toga, u retrospektivnim grupama pacijenata sa dijabetesom tipa 2, izmjereni su nivoi ekspresije ukupnog i aktiviranog GSK3b u ćelijama eksfolijiranih urina, koje su uzorkovane kao tečna biopsija bubrega na bazi urina. Ispitivali smo odnos između nivoa ekspresije GSK3b ili njegovog aktiviranog oblika u osnovnim urinarnim eksfolijiranim ćelijama i razvoja ili progresije oštećenja bubrega kod pacijenata sa dijabetesom.

REZULTATI

GSK3b je prekomjerno eksprimiran i hiperaktivan u bubrežnim parenhimskim stanicama kod db/db miševa, povezan s progresijom albuminurije i dijabetičkom ozljedom bubrega

db/db miševi s nedostatkom receptora leptina su dobro uspostavljeni modeli za dijabetes melitus tipa 2 i DN. Već u dobi od 10 sedmica, db/db miševi spontano razvijaju rane znakovepovrede bubrega, karakteriziran progresivnom albuminurijom i akumulacijom matriksa u glomerulima.23 Nasuprot tome, kontrolni miševi prilagođene dobi (db/m) imaju normalnu glikemiju i nema vidljivih dokaza obolest bubrega. U eksperimentu koji je počeo sa 10 sedmica starosti, bubrežna ekspresija ukupnog (Slika 1) i aktiviranog (Slika 2) GSK3b (fosforiliranog na Y216 [p-GSK3B]) kod db/db miševa u odnosu na kontrolne db/m miševe je progresivno povišena ( Slika 1b i 2b). Ovo je uglavnom bilo lokalizirano na podocite i mezangijalne ćelije u glomerulima (Slika 1a) i na tubularne epitelne ćelije u tubulointersticijalnim (Slika 2a), kao što je prikazano imunohistohemijskim bojenjem. Morfološki nalazi su potkrijepljeni imunoblot analizom homogenata cijelog bubrega (Slike 1c i 2c). Regresiona analiza je pokazala da je intenzitet bojenja ukupnog (Slika 1d) i aktiviranog (Slika 2d) GSK3b u glomerulima pozitivno korelirao sa izlučivanjem albuminurije u urinu kod db/db miševa u različitim godinama. Čak iu ranoj fazi dijabetesa kod db/db miševa, kao što je 10 ili 14 sedmica starosti, aktivnost GSK3b je bila izrazito povišena u bubrezima, što se odražava značajnom indukcijom p-GSK3b (Slika 2). Čini se da se hiperaktivnost GSK3b u bubrezima db/db miševa u ranoj fazi u velikoj mjeri može pripisati posttranslacijskim modifikacijama, kao što je fosforilacija na Y216, ali u kasnijoj fazi, uglavnom je posljedica povećane ekspresije ukupnog GSK3b.

Progresija DN karakteriše povećanje akumulacije ekstracelularnog matriksa u glomerulima i intersticijalu. Zaista, kao što je pokazano FL fluorescentnim imunohistohemijskim bojenjem, db/db mišji bubrezi su pokazali progresivno povećanu ekspresiju fibronektina u glomerulima i intersticijalu (Slika 3a). Ovo je dalje potvrđeno imunoblot analizom homogenata bubrega na fibronektin i kolagen IV (Slike 3b i c). Štaviše, ekspresija ukupnog i aktiviranog GSK3b u pozitivnoj je korelaciji sa ekspresijom fibronektina utkiva bubrega(Slika 3d).

Da bi se dalje utvrdilo da li pojačana aktivacija GSK3b prethodi razvoju DKD, db/db i db/m miševi su praćeni u odvojenom eksperimentu počevši od 4 sedmice starosti tokom faze predijabetesa. U sedmici 7, db/db miševi su pokazali evidentnu hiperglikemiju (dodatna slika S1A), što ukazuje na dijabetes, ali bez znakova DKD, što pokazuje normalna albuminurija (dodatna slika S1B). Treba napomenuti da je čak iu tako ranoj fazi dijabetesa, bubrežna ekspresija GSK3b i p-GSK3b, kao i relativna aktivnost GSK3b izražena kao omjer p-GSK3b/GSK3b, promjenjivo povećana, što je mjereno imunoblot analizom tkiva bubrežne biopsije. nakon čega slijedi denzitometrija (dodatna slika S1C i D). Pored toga, linearna regresiona analiza je pokazala da je aktivnost GSK3b bubrega u sedmici 7 pozitivno korelirala s razvojem albuminurije i DKD u 13. sedmici (dodatna slika S1E). Štaviše, analiza krivulje operativnih karakteristika prijemnika (ROC) pokazala je da je aktivnost bubrežnog GSK3b kod db/db miševa u dobi od 7 sedmica, kada nije bilo znakova DKD, pruža odličnu preciznost i moć u predviđanju razvoja albuminurije i DKD (dodatna slika S1F).

Izloženost stanica bubrega dijabetičkom miljeu uzrokuje prekomjernu ekspresiju i hiperaktivnost GSK3b, što rezultira dijabetičkim citopatskim promjenama

Da bi se utvrdilo da li dijabetičko stanje direktno pojačava aktivaciju GSK3b ućelije bubrega, in vitro kulture različitih ćelijskih linija bubrega, uključujući mišje podocite, mezangijalne ćelije i tubularne epitelne ćelije, korištene su i izložene dijabetičkom miljeu koji se sastoji od visoke razine glukoze u okruženju i transformirajućeg faktora rasta (TGF) b1. Izloženost podocita dijabetičkom miljeu rezultirala je upečatljivom ozljedom podocita, obilježenom gubitkom proteina markera podocita sinaptopodina. Ovo je u skladu sa najamninom sa izraženom indukcijom ukupnog i aktiviranog GSK3b, kao što je prikazano FL fluorescentnim imunocitohemijskim bojenjem (Slike 4a i b) i potvrđeno imunoblot analizom

(Slika 4c i d). U kultivisanim mezangijalnim ćelijama, ekspresija ukupnog (Slika 5a) i aktiviranog (Slika 5b) GSK3b je takođe povećana nakon izlaganja dijabetičkom miljeu, paralelno sa povećanom ekspresijom molekula ekstracelularnog matriksa kao što je fibronektin (Slika 5). Slično, kultivisane bubrežne tubularne epitelne ćelije prekomjerno su ekspresirale ukupni i aktivirali GSK3b nakon tretmana dijabetičkog miljea, a to je bilo praćeno disfunkcijom i dediferencijacijom tubularnih stanica, obilježeno smanjenom i poremećenom ekspresijom epitelnih čvrstih spojnih molekula kao što su ZO{6} -1) (Slika 6a–d). Nasuprot tome, kao kontrola osmolaliteta, tretman manitolom svih stanica bubrega rezultirao je efektom koji se nije razlikovao od onoga što je prenio normalan milje koji sadrži normalnu ambijentalnu glukozu. Ljudski dijabetes uključuje ne samo hiperglikemiju već i insulinsku rezistenciju. Iako je nemoguće potpuno odvojiti hiperglikemiju od inzulinske rezistencije na životinjskim modelima ili kod pacijenata, in vitro modeli su korišteni da ispitaju izolirani učinak visoke glukoze u odnosu na inzulinsku rezistenciju. Da bi se oponašalo stanje insulinske rezistencije, b izoforma inzulinskog receptora je srušena u kultivisanim podocitima, mezangijalnim ćelijama i bubrežnim tubularnim ćelijama (dopunska slika S2A-C), a to je pojačalo ekspresiju i aktivnost GSK3b čak i u normalnom miljea, kao što pokazuje imunoblot analiza i denzitometrija. Ovo djelovanje je pojačano nakon izlaganja dijabetičkom miljeu, označavajući sinergistički učinak inzulinske rezistencije i visoke glukoze na aktivaciju GSK3b.

Hiperaktivnost GSK3b je neophodna i dovoljna za ozljedu i disfunkciju bubrežnih stanica izazvanu dijabetičkim miljeom

Da bismo istražili da li je hiperaktivnost GSK3b uključena u citopatske promjene u stanicama bubrega, aktivnost GSK3b ukultivisani bubregćelijama se umjetno manipulira interferencijom RNK

(RNAi) ili prekomjerna ekspresija gena. Kao što je prikazano na slici 7a, RNAi pomoću male interferentne RNK jedva utiče na citopatski efekat dijabetičkog miljea u svim ćelijama bubrega. Nasuprot tome, utišavanje GSK3b značajno je poništilo supresiju sinaptopodina u podocitima izazvanu dijabetičkim miljeom, indukciju fibronektina u mezangijalnim stanicama i poremećaj ZO-1 u bubrežnim tubularnim stanicama, što sugerira da je GSK3b vjerovatno neophodan za pokretanje promjena povezanih s dijabetesom u citopatima. ćelije bubrega. Da bi se utvrdilo da li su prekomjerna ekspresija i hiperaktivnost GSK3b dovoljni za citopatske efekte izazvane dijabetičkim miljeom, stanice su prolazno transficirane ili praznim vektorom ili vektorom koji kodira konstitutivno aktivni mutant GSK3b (S9A). Iako transfekcija praznog vektora nije imala nikakve efekte, ektopična prekomjerna ekspresija S9A rezultirala je gubitkom ekspresije sinaptopodina u podocitima, povećanom proizvodnjom fibronektina u mezangijalnim stanicama i smanjenom ekspresijom ZO-1 u bubrežnim tubularnim stanicama čak iu normalnom miljeu (Slika 7b), što podsjeća na citopatski efekat dijabetičkog miljea.

Progresija humanog DN poklapa se s prekomjernom ekspresijom GSK3b i hiperaktivnošću u bubrežnim glomerulima i tubulima

Da bi se dalje potvrdilo da li su gornji nalazi u modelima životinjskih i staničnih kultura također primjenjivi na klinički DN, arhivirana tkiva biopsije bubrega normalnih subjekata i pacijenata s različitim stadijumima DN obrađena su za peroksidazno imunohistohemijsko bojenje za GSK3b i p-GSK3b. Karakteristike kontrolnih subjekata i pacijenata sumirane su u Dodatnoj tabeli S1. Kao što je prikazano na slici 8a, bubrežni

ekspresija ukupnog i aktiviranog GSK3b se sve više povećavala zajedno sa progresijom DN prema patološkoj klasifikaciji na osnovu bojenja periodičnom kiselinom-Schiff. Ovo je u skladu sa podacima Nephroseq-a, koji takođe pokazuju značajno povećanu ekspresiju GSK3b u tkivima biopsije bubrega pacijenata sa DN (dodatna slika S3). Povećana ekspresija ukupnog i aktiviranog GSK3b bila je pretežno locirana u podocitima i mezangijalnim ćelijama u glomerulima i u bubrežnim tubularnim epitelnim ćelijama u tubulointersticijalnim (slika 8a), u skladu sa nalazima kod db/db miševa. Morfološki rezultati su dodatno potkrijepljeni kompjuteriziranom morfometrijskom analizom, koja je otkrila pozitivnu povezanost između nivoa ekspresije ukupnog (Slika 8b) ili aktiviranog (Slika 8c) GSK3b i težine DN.

GSK3b je hiperaktivan u eksfolijiranim ćelijama mokraće prikupljenim od dijabetičara i predviđa progresiju bubrežne insuficijencije, kako u fiziološkim tako iu bolesnim stanjima, promet i izlučivanje bubrežnih epitelnih ćelija, kao što su glomerularni podociti i tubularne epitelne ćelije, se dešavaju konstantno, što dovodi do kontinuiranog izlučivanja. parenhimskih ćelija bubrega u mokraću. Urinarne eksfolijirane ćelije uspješno su iskorištene kao neinvazivna tečna biopsija bubrega zasnovana na urinu za istraživačke i dijagnostičke svrhe.24,25 Uz prethodno spomenute nalaze da je ekspresija ukupnog i aktiviranog GSK3b povećana u bubrežnim parenhimskim stanicama kod pacijenata sa DN i u DB/DB Miševi čak i u ranoj fazi prije nego što se manifestirala albuminurija, pitali smo se može li se mjerenje GSK3b u ćelijama eksfolijiranih u urinu iskoristiti za predviđanje

razvoj ili napredovanje ljudske DKD. U tu svrhu koristili smo biobanku dijabetesa i proveli retrospektivnu kohortnu studiju. Ukupno, 127 pacijenata sa dijabetesom mellitusom tipa 2, koji su praćeni u Prvoj pridruženoj bolnici Univerziteta Zhengzhou od 2010. godine sa prikupljenim uzorcima frakcionisanog urina, pregledano je za uključivanje u ovu studiju. Od ovih pacijenata, 67 je isključeno, a 10 je izgubljeno zbog praćenja, 52 je imalo disfunkciju bubrega ili očiglednu proteinuriju na početku bolesti, a 5 je kasnije dijagnosticirano kao druge bolesti bubrega biopsijom ili snimanjem bubrega. Na kraju, 60 pacijenata je bilo uključeno u ovu retrospektivnu kohortnu studiju (Slika 9). Demografske i kliničke karakteristike ovih pacijenata na početku su sažete u Tabeli 1. Nijedan od pacijenata nije imao disfunkciju bubrega ili očiglednu proteinuriju na početku, i nijedan nije započeo terapiju dijalizom tokom perioda praćenja. Prema veličini albuminurije, bolesnici su kategorizirani u 2 podgrupe: normoalbuminurija i mikroalbuminurija. Osim nivoa izlučivanja albumina u urinu (UAE), 2 podgrupe pacijenata nisu se statistički razlikovale na početku u svim drugim kliničkim, biohemijskim i fiziološkim parametrima, uključujući trajanje dijabetesa, nivo glikiranog hemoglobina, funkciju bubrega, krvni pritisak i propisane tretmane . Nakon 5 godina praćenja, 29 od 60 pacijenata pokazalo je progresiju oštećenja bubrega, koja je definirana ili kao smanjenje procijenjene brzine glomerularne filtracije (eGFR) od 25% ili progresija statusa albuminurije što je naznačeno eskalacijom ozbiljnosti. albuminurije duž različitih kliničkih stadijuma DN, odnosno normoalbuminurije, mikroalbuminurije, mikroalbuminurije ili očigledne proteinurije. Nasuprot tome, preostali 31 pacijent nije pokazao znakove progresije bolesti bubrega (Slika 9). Osnovni podaci pacijenata su stratifikovani prema statusu progresije bubrežne insuficijencije nakon 5 godina praćenja (Tabela 2). Pacijenti sa progresijom oštećenja bubrega, u poređenju sa onima bez progresije, pokazali su značajno smanjenje eGFR i značajno povećanje UAE. Da bi se utvrdilo da li je GSK3b bio prekomjerno eksprimiran ili prekomjerno aktiviran u bubrežnim stanicama i

mjereno da bi se procijenila osjetljivost i specifičnost GSK3b aktivnosti u urinarnim eksfolijiranim ćelijama u odnosu na početnu albuminuriju za predviđanje progresije bubrežnog oštećenja. Kao što je prikazano na slici 11, relativna aktivnost GSK3b u eksfolijiranim ćelijama urina, izražena kao p-GSK3b/GSK3b odnos, pokazala je odličnu tačnost i moć u razlikovanju pacijenata sa progresivnim oštećenjem bubrega od onih sa stabilnom funkcijom bubrega, sa površinom ispod ROC-a. kriva je 0.844 (95 posto intervala pouzdanosti, 0.747–0.941; P ¼ 0.001 ), što je bilo mnogo bolje od površine ispod ROC krive za osnovnu liniju Ln(UAE) ({{20}}.750; 95 posto intervala pouzdanosti, 0.626–0.874). Granica koja je maksimizirala Youdenov indeks bila je 1,24 za omjer p-GSK3b/GSK3b i 76 mg/24 h za UAE. Na ovim graničnim vrijednostima, osjetljivost i specifičnost su bile 69 posto i 87,1 posto za omjer p-GSK3b/GSK3b i 69 posto i 77,4 posto za Ln (UAE). Štaviše, kombinacija omjera p-GSK3b/GSK3b sa ukupnim nivoom GSK3b u urinarnim eksfolijiranim ćelijama značajno je poboljšala diskriminirajuću moć, pri čemu je površina ispod ROC krive iznosila 0,971 (95 posto intervala pouzdanosti, 0,931–1.{48} }). Ovi rezultati sugeriraju da mjerenja GSK3b aktivnosti u urinarnim eksfolijiranim ćelijama mogu pružiti mnogo bolju tačnost od UAE u predviđanju progresije oštećenja bubrega kod pacijenata sa dijabetesom.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Urinarne eksfolijirane ćelije prikupljene su na početku i ispitane su imunoblot analizom na GSK3b i p-GSK3b (dodatna slika S4A i B). Aktivnost GSK3b procijenjena je denzitometrijskim omjerima p-GSK3b prema ukupnom GSK3b za svaki uzorak u odnosu na vrijednost kontrolnih uzoraka (dodatna slika S4C).

Među različitim kliničkim/biohemijskim varijablama, aktivnost GSK3b (omjer p-GSK3b/GSK3b) u osnovnim urinarnim eksfolijiranim ćelijama je značajno viša kod pacijenata koji su razvili DKD nego kod onih koji nisu (Dopunska tabela S3). Štaviše, analiza ROC krive sugerira da je relativna aktivnost GSK3b (omjer p-GSK3b/GSK3b) u ćelijama eksfolijiranih u urinu pružila odličnu tačnost i moć u predviđanju razvoja DKD kod pacijenata sa dijabetesom u ranoj fazi (dodatna slika S4D).