Ekstrakcija fenolnih kiselina, flavonola i flavan{1}}ola uz pomoć ultrazvuka iz ljuske i sjemenki grožđa muskadina korištenjem prirodnih dubokih eutektičkih rastvarača i prediktivnog modeliranja umjetnom neuronskom mrežom

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

AbstractCilj ovog istraživanja bio je ispitati efikasnost ekstrakcije 9 prirodnih dubokih eutektičkih rastvarača (NDES) uz pomoć ultrazvuka zafenolne kiseline, flavonolai flavan{0}}oli u kožici i sjemenkama muskadinog grožđa (Carlos) u poređenju sa 75 posto etanola. Umjetna neuronska mreža (ANN) je primijenjena za optimizaciju sadržaja vode u NDES-u, vremena ultrazvučne obrade, omjera čvrste tvari i otapala i temperature ekstrakcije kako bi se postigli najveći prinosi ekstrakcije za elaginsku kiselinu, katehin i epikatehin. Novo formulisani NDES (#1) sastoji se od kolin hlorida:levulinska kiselina: etilen glikol 1:1:2 i 20 procenta vode ekstrahovali su najveću količinu elaginske kiseline u koži od 22,1 mg/g. Ovaj prinos je bio 1.73-put veći od 75 posto etanola. Modificirani NDES (#3) koji se sastoji od kolin klorida: prolina: jabučne kiseline 1:1:1 i 30 posto vode ekstrahirao je najveću količinu katehina (0.61 mg/g) i epikatehina (0,89 mg/g) u koži, odnosno 2,77 mg/g i 0,37 mg/g u sjemenu. Optimalni prinos elaginske kiseline u koži upotrebom NDES #1 bio je 25,3 mg/g (promatrano) i 25,3 mg/g (predviđeno). Optimalni prinos (katehin plus epikatehin) u sjemenu korištenjem NDES #3 bio je 9,8 mg/g (promatrano) i 9,6 mg/g (predviđeno). Ova studija je pokazala visoku efikasnost ekstrakcije odabranih NDES za polifenole pod optimizovanim uslovima.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Uvod

Prirodna duboka eutektička otapala (NDES) pripremaju se miješanjem donora vodonične veze s akceptorima vodikove veze u odgovarajućem molarnom omjeru [1]. Tačka topljenja jedne komponente treba da bude niža od tačke topljenja druge [1]. Nakon zagrijavanja i miješanja, ovaj medij postaje tekućina na sobnoj temperaturi. Voda se dodaje kako bi se smjesa stabilizirala i polarizirala. Istraživanja u oblasti fitokemijske ekstrakcije pomoću NDES-a su se proširila zbog njihove efektivne ekstrakcije i rastvorljivosti. Ipak, više faktora igra značajnu ulogu kada se NDES poredi sa organskim rastvaračima, uključujući prinos, cenu, oporavak i toksičnost. Prethodno istraživanje je istraživalo NDES o ekstrakciji različitih polifenola iz različitih matrica hrane. Na primjer, Bubalo et al. (2016) uporedili su 5 NDES, vodu, 70 posto metanola (v/v) i zakiseljeno 70 posto metanola (v/v) kako bi ekstrahirali antocijanine, katehin i kvercetin{8}}O-glukozid iz kore crvenog grožđa. Utvrđeno je da je NDES koji se sastoji od holin hlorida: oksalne kiseline (1:1) sa 25 posto vode (v/v) najefikasniji rastvarač za ekstrakciju [2]. U drugoj studiji, Pani´c et al. (2019) testirali su 8 NDES i zakiselili 70 posto etanola i uočili kolin hlorid: limunsku kiselinu (2:1) sa 30 posto vode (v/v) kao najbolji NDES za ekstrakciju antocijana iz komine grožđa [3]. Muscadine grožđe (Vitis rotundifolia) porijeklom je iz jugoistočnih država i prvo je uzgajano divlje grožđe u Sjedinjenim Državama [4]. Muscadine grožđe se proizvodi u 12 država i ukupno ima oko 5000 hektara [5]. Postoji 100 sorti muskadinskog grožđa i svaka se razlikuje po fizičkim, senzornim ili hemijskim karakteristikama [4]. Među njima, Carlos je široko zasađeno grožđe muskadino zbog svojih visokih prinosa i konzistencije rasta [4]. Grožđe Carlos Muscadine je srednje veličine, bronzane boje, deblje u kožici i sadrži u prosjeku četiri sjemenke [6]. Muskadno grožđe sadrži značajne količinepolifenoliza koje je poznato da smanjuju upalu [7], inhibiraju rast tumora prostate [8] i poboljšavaju metaboličke odgovore dijabetičara [9]. Komina grožđa muskadina, nusproizvod cijeđenja soka od grožđa ili proizvodnje vina, sastoji se od kore i sjemenki. Prethodna istraživačka studija koristila je mješavinu aceton:voda:octena kiselina (70:29.7:0.3, v/v) za ekstrakciju fenolnih jedinjenja iz sjemenki, kože i pulpe osam sorti muskadinskog grožđa uzgojenog na Floridi, uključujući Carlosa [10]. Međutim, upotreba zapaljivih organskih rastvarača i njihova niska efikasnost ekstrakcije ometali su praktičnu primjenu. Većina komine muskadinske grožđa se još uvijek odbacuje kao otpad. Umjetna neuronska mreža (ANN) je sistem nelinearnog mapiranja koji se sastoji od različitih osnovnih procesorskih jedinica povezanih ponderisanim asocijacijama. Ove jedinice za obradu nazivaju se "neuroni" [11]. Umjetna neuronska mreža je pristup strojnog učenja za predviđanje ili predviđanje odgovora na osnovu višestrukih inputa [11]. Prethodno istraživanje je primenilo metode odzivne površine (RSM) za optimizaciju i predviđanje ekstrakcije. Međutim, nekoliko studija je koristilo ANN u istu svrhu. Na primjer, Sinha et al. (2013) sugeriraju da ANN ima bolje performanse predviđanja od RSM za ekstrakciju prirodne boje iz sjemena Bixa Orellana (Annatto) [12]. U sličnoj studiji Ćirić i sar. (2020) izvijestili su da je model ANN bolji od RSM za predviđanje ekstrakcije fenolnih jedinjenja iz bijelog luka [13]. Cilj ovog istraživanja bio je da se uz pomoć ultrazvuka ispita efikasnost ekstrakcije 9 NDES za fenolne kiseline, flavonole i flavan{17}}ole u odnosu na 75 posto etanola. ANN je primijenjen za predviđanje i optimizaciju uvjeta ekstrakcije na prinos fenola. Hipoteza je bila da NDES sa specifičnim sastavima ekstrahuje veće količine fenolnih kiselina, flavonola i flavan{19}}ola od 75 posto etanola, a najveća efikasnost ekstrakcije može se postići prediktivnim modeliranjem zasnovanim na ANN.

2. Materijali i metode 2.1. Hemikalije i reagensi Holin hlorid, levulinska kiselina, 1,2-propandiol, DL-jabučna kiselina, oksalna kiselina, hlorovodonična kiselina i mravlja kiselina dobijeni su od Acros Organics (Morris Plains, NJ, SAD). Mliječna kiselina, etilen glikol, glicin, HPLC acetonitril, metanol i etanol su kupljeni od Fishers Scientific (Waltham, Massachusetts, SAD). L-prolin i betain hidrohlorid su nabavljeni od Alfa Aesar (Ward Hill, MA, SAD). HPLC standardi za elaginsku kiselinu, galnu kiselinu, ferulnu kiselinu, (plus )-katehin, (-)-epikatehin, miricetin, kvercetin i kempferol nabavljeni su od Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SAD).

2.2. Dizajn NDES-aNDES #1–2 u Tabeli 1 dizajnirani su u našoj prethodnoj studiji [14]. Holin hlorid u NDES #1–2 odabran je kao akceptor vodonika, dok su dva različita donora vodonika odabrana za svaki novi NDES. U preliminarnim eksperimentima određeni su molarni odnosi između donora vodonika i sadržaja akceptora i vode. NDES #3–9 u Tabeli 1 odabrani su iz literature jer su ih prethodne studije označile kao efikasne NDES u ekstrakciji polifenola. Sadržaj vode u NDES #3 je izmijenjen iz citirane literature. Za pripremu NDES-a primijenjena je metoda grijanja [15]. Ukratko, akceptor vodonične veze pomiješan je sa svakom od komponenti donora vodonične veze u Erlenmeyerovim tikvicima pomoću šipke za miješanje. Smjesa u tikvici je zatvorena i zagrijavana na 5{29}} ◦C oko 30 min ili dok se ne formira bistra tekućina koja je ostala stabilna na sobnoj temperaturi. Sadržaj vode u Tabeli 1 izračunat je prema konačnoj zapremini NDES smjesa. pH NDES navedenog u Tabeli 1 izmjeren je pomoću pH metra (AB15, Accumet, Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). 2.3. Priprema uzoraka / Ekstrakcija uz pomoć ultrazvuka. Smrznute kore i sjemenke grožđa muskadinskog grožđa (Vitis rotundifolia) (kultivar: Carlos) obezbijedili su Paulk Vineyards (Wray, Georgia, SAD). Nakon uklanjanja ljuski, listova ili peteljki, komina je odvojena na sjemenke i kožicu. Uzorci su zatim sušeni pomoću vakuumske peći (Isotemp, Model 285A, Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, SAD) na 60 ◦C i vakuumskom pritisku nižem od −30 in.Hg. Zatim su uzorci homogenizirani u fini prah korištenjem himerične mljevenja (A1{{105}}00, RRH Inc., 2800 W, Zhejiang, Kina). Koristeći početni omjer čvrste tvari i rastvarača od 1:20 (g: mL), 0,50 g ili muskadinske kožice ili sjemenki grožđa pomiješano je u 10 mL NDES ili 75 posto etanola u tri primjerka. Uzorci su zatim stavljeni u vodeno kupatilo (60 ◦C) i sonikirani (VCX 1500, Sonics & Materials Inc., 1500-Watt, 50/60 Hz, Newtown, CT, SAD) 30 minuta na 100 posto amplituda za dva kruga (15 min/runda). Zatim su uzorci odmah centrifugirani (Sorvall ST 8, Fisher Scientific, Suzhou, Kina) na 3.260 g dok se ne dobije bistri supernatant. Na kraju, supernatanti su sakupljeni i pohranjeni u zamrzivaču na -20 ◦C za HPLC analizu fenolnih kiselina (elaginska kiselina, galna kiselina, ferulna kiselina), flavonola (miricetin, kvercetin i kempferol) i flavan{45}}ola (katehin i epikatehin). 2.4. HPLC analize fenolnih kiselina, flavonola i flavan{48}ola Fenolne kiseline, flavonola i flavan{49}ola analizirane su na HPLC sistemu (Agilent Technologies 1200, Waldbronn, Njemačka) prema metodi opisanoj u Sandhu i Gu (2013) [16]. HPLC sistem se sastoji od binarne pumpe, autosamplera, termostatirane kolone, detektora diode i detektora fluorescencije. Ekstrakti kožice ili sjemenki grožđa hidrolizirani su prije analize fenolnih kiselina i flavonola. Hidroliza je izvedena miješanjem 1 ml ekstrakta sa 4 mL rastvora za hidrolizu (1,2 M HCl koji sadrži 50 posto metanola) i stavljen u vodeno kupatilo (Precision, Model 2837, 400 W, 50/60 Hz, Thermo Scientific, Marietta , OH, SAD) na 90 ◦C tokom 80 min. Zatim su uzorci ohlađeni na 25 ◦C nakon čega je rađena sonikacija u trajanju od 5 minuta. Hidroliza ekstrakta nije bila potrebna za analizu katehina i epikatehina. Hidrolizovani i nehidrolizovani ekstrakti su filtrirani kroz 0,45 μm politetrafluoroetilensku (PTFE) membranu pre HPLC analize. Za analizu elaginske kiseline, galne kiseline, ferulne kiseline, miricetina, kvercetina, kempferola, katehina i epikatehina, 10 µL je ubrizgano u kolonu SB-C18 (4,6 × 250 mm, 5 µm, Zorbax, Agilent, Santa Clara, SAD). Mobilne faze su bile (A) 0,5 posto mravlje kiseline i (B) 100 posto acetonitrila. Brzina protoka je bila 1 mL/min sa 25 min modifikovanim gradijentom kako slijedi: 0–5 min, 10–30 posto B; 5–10 min, 30–40 posto B; 10–20 min, 40–50 posto B; 20–25 min, 50–10 posto B; nakon čega slijedi 5 min ekvilibracije. Temperatura kolone je postavljena na 30 ◦C. Talasna dužina detekcije bila je 260 nm za elaginsku kiselinu, galnu kiselinu i ferulnu kiselinu i 360 nm za miricetin, kvercetin i kempferol na detektoru fotodiodnog niza. Ekscitacija i emisija za katehin i epikatehin bile su 230 nm, odnosno 321 nm, uz korištenje fluorescentnog detektora. Polifenolna jedinjenja su kvantifikovana korišćenjem standardnih krivulja elaginske kiseline, galne kiseline, ferulne kiseline, miricetina, kvercetina, kempferola, katehina i epikatehina. Sve standardne krive imale su 7 bodova i R2 > 0,99. 2.5. Prilagođeni dizajn za umjetnu neuronsku mrežu Četiri nezavisne varijable ekstrakcije sa četiri nivoa: sadržaj vode (15–60 posto), vrijeme ultrazvučne obrade (5–35 min), omjer čvrste tvari i rastvarača (1:5–1:20) i ekstrakcija temperatura (30–60 ◦C) (Tabela S1) primijenjena je za optimizaciju prinosa ekstrakcije fenolnih kiselina, flavonola i flavan{122}}ola. Za razliku od klasičnih dizajna kao što je dizajn površine odgovora, dizajn zasnovan na ANN-u ne zahtijeva ponavljanje i preferira drugačiju strukturu podataka. U našoj prethodnoj studiji [14], ANN je bio pouzdaniji metod za predviđanje prinosa ekstrakcije od RSM. Stoga je ANN odabran u ovoj studiji za predviđanje prinosa ekstrakcije elaginske kiseline, katehina i epikatehina. Prilagođeni dizajn sa 40 pokretanja (Tabela S2) generiran je na JMP Pro (verzija 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD) kako bi se pružili podaci posebno za ANN prediktivno modeliranje. Randomizacija 40 serija je primijenjena kako bi se eliminisala bilo kakva pristranost. Glavna jednačina ANN-a je prikazana na sljedeći način:=∑jj=1 wh jpg plus bhk, k=1toK (1) gdje je h broj neurona u skrivenom sloju, j i k su broj ulaznih varijabli i skrivenih neurona, respektivno, p je ulazna varijabla, bh je pristrasnost skrivenog sloja, a wh je težina u skrivenom sloju. Ekstrakcijski prinosi elaginske kiseline, katehina i epikatehina u odnosu na četiri nezavisne varijable analizirani su korištenjem ANN-a tako što se prvo obučavaju podaci, a zatim se odabiru najbolji tip aktivacije i broj neurona koji rezultira adekvatnim uklapanjem podataka. Za procjenu uspjeha modela predviđanja, procijenjene su tri vrijednosti: R-kvadrat, kvadratni korijen srednje kvadratne greške predviđanja (RASE) (jednačina (2)) i prosječna apsolutna greška (AAE). RASE je RASE=̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ SSE/n √ (2) Gdje SSE donira za kvadrat i zbir grešaka predviđanja (razlike između stvarnih odgovora i predviđenih odgovora) i n za brojne opservacije. R-kvadrat blizu 1 sa RASE i AAE blizu nule znači bolje uklapanje podataka u model. 2.6. Statistika Prinosi ekstrakcije fenolnih kiselina, flavonola i flavan{142}}ola su upoređeni sa jednosmjernom ANOVA-om praćenom Studentovim t-testom na p manjem ili jednakom 0,05 koristeći JMP Pro (Verzija 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD). Svaki nde i 75 posto etanola su upoređeni korištenjem Dunnett-ovih testova na p manjem ili jednakom 0,05. Analiza glavnih komponenti (PCA) izvedena je na JMP Pro (verzija 14.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, SAD) za fenolna jedinjenja ekstrahovana iz muskadinske kožice i sjemenki grožđa. 3. Rezultati i diskusija 3.1. Polifenoli ekstrahovani od strane NDES-a iz muskadinske ljuske grožđa. Devet NDES-a i 75 posto etanola korišteni su za ekstrakciju polifenola iz ljuski muskadinskog grožđa. U tabeli 2 prikazan je prinos ekstrakcije elaginske kiseline, galne kiseline, ferulne kiseline, miricetina, kvercetina, kempferola, katehina i epikatehina. Elaginska kiselina bila je najzastupljeniji polifenol koji se može ekstrahirati u kožici grožđa, a slijede ga galna kiselina i ferulna kiselina, respektivno. Ovaj nalaz je u skladu s prethodnim studijama [17,18]. NDES #1, #8, #7, #3, #2 i #9 ekstrahirali su značajno veće količine elaginske kiseline u kožici grožđa od 75 posto etanola. Najveći prinos ekstrakcije elaginske kiseline je postignut NDES #1, a zatim NDES #8 sa 22,1 ± 2,2 mg/g i 21,3 ± 2,5 mg/g, respektivno (Tabela 2). Međutim, nije bilo značajne razlike između NDES #1 i NDES #8 prema Studentovom t-testu. Zanimljivo je da je NDES #1 najmanje efikasan NDES za ekstrakciju antocijana iz

komina brusnice [14]. Ovo sugerira da NDES #1 može selektivno ekstrahirati elaginsku kiselinu ili elagitanine iz matriksa hrane koji također sadrže antocijanidine. Takva selektivnost se može pripisati razlikama u molekularnim interakcijama između NDES i specifičnih fenolnih klasa. Slika S1 (panel A) prikazuje HPLC hromatogram galne kiseline, elaginske kiseline i ferulinske kiseline ekstrahovane iz kožice grožđa pomoću NDES #1 i detektovane na 260 nm. 75-postotni etanol ekstrahirao je 12,7 ± 1,2 mg elaginske kiseline po gramu kožice grožđa. Najmanji prinos ekstrakcije elaginske kiseline uočen je u NDES #4 na 7,44 ± 0.6 mg/g. Prinos ekstrakcije galne kiseline prema NDES #9, #8, #1, #4, #7 i #3 bio je uporediv i značajno veći od 75 posto etanola. Najveću količinu galne kiseline ekstrahirao je NDES #9 na 10,4 ± 0,5 mg/g, dok je najmanja količina od 5,55 ± {{40}} .1 mg/g ekstrahirano je pomoću NDES #5. Najveću količinu ferulinske kiseline ekstrahirao je NDES #1 na 6,32 ± 0,7 mg/g, a najmanju količinu ekstrahirao NDES #5 na 3,11 ± 0.{{5{{52 }}}} mg/g. Nadalje, nije bilo značajne razlike između NDES #1 i 75 posto etanola u ekstrakciji ferulne kiseline (Tabela 2). Najveću količinu katehina i epikatehina ekstrahirao je NDES #3 na 0.61 ± 0.1 mg/g i 0.89 ± 0.1 mg/ g, respektivno (tabela 2). U međuvremenu, NDES #3 i #6 ekstrahirali su značajno veće količine epikatehina od 75 posto etanola. Slika S2 (panel A) prikazuje HPLC hromatogram katehina i epikatehina ekstrahovanih pomoću NDES #3 iz kožice grožđa. Međutim, katehin nije otkriven u 75-postotnom ekstraktu etanola. Najmanje količine katehina (0.02 mg/g) i epikatehina ({{90}}.14 mg/g) ekstrahovane su NDES #2 i NDES # 5, respektivno. Miricetin je bio najzastupljeniji flavonol, a najmanje kempferol. Dunnettov test je otkrio da su NDE i 75 posto etanola uporedivi u ekstrakciji miricetina, kvercetina i kempferola (tabela 2). Najveća količina miricetina ekstrahirana je pomoću NDES #1 (1,84 mg/g), zatim 75 posto etanola (1,73 mg/g), a zatim NDES #8 (1,67 mg/g). Najveća količina kvercetina ekstrahirana je sa 75 posto etanola (0.41 mg/g), NDES #1 (0.40 mg/g) i NDES #8 ({ {143}}.38 mg/g). Nasuprot tome, najniže količine miricetina i kvercetina ekstrahovane su pomoću NDES #5 na 0.87 mg/g i 0.27 mg/g, respektivno. Ovaj nalaz dodatno naglašava ukupnu slabu sposobnost NDES #5 da izvuče polifenole iz ljuske grožđa. Najveća količina kempferola ekstrahirana je sa 75 posto etanola (0.05 mg/g), a najmanja je ekstrahirana pomoću NDES #5 i NDES#6 (0,03 mg/g). Slika S1 (panel B) prikazuje HPLC hromatogram miricetina, kvercetina i kempferola ekstrahovanih iz kožice grožđa pomoću NDES #1 detektovan na 360 nm. Najveća zbirna količina fenolnih kiselina, flavonola i flavan{103}ola bila je 40,7 mg/g ekstrahovanih sa NDES #1, a zatim 39,8 mg/g ekstrahovanih sa NDES #8, dok je najmanja suma iznosila 18,4 mg/g ekstrahovanih od strane NDES #5 (Tabela 2). pH NDES se kretao između 0,3 i 3,3 (Tabela 1). Rsquared korelacija između pH NDE-a i prinosa fenolnih kiselina, flavonola i flavan{119}}ola navedena je u Tabeli 2. Nedostatak korelacije između pH i prinosa ekstrakcije sugerira da pH nije utjecao na efikasnost ekstrakcije. 3.2. Polifenoli ekstrahovani NDES-om iz sjemenki grožđa muskadina Ukupni prinosi ekstrakcije fenolnih kiselina, flavonola i flavan{123}}ola iz sjemenki grožđa bili su primjetno niži od onih iz kožice (Tabela 3). Najzastupljeniji polifenoli koji se mogu ekstrahirati u sjemenu su bili katehin i epikatehin, dok kempferol nije detektovan. Kompleksna matrica sjemenki koja sadrži ulje (13 posto, w/w suhe baze) je moguće objašnjenje niske sposobnosti ekstrakcije fenolnih spojeva iz sjemenki grožđa [19]. Najveća količina katehina ekstrahirana je pomoću NDES #3 u količini od 2,77 mg/g (Tabela 3). Ovaj prinos je bio značajno veći od svih ostalih NDES i 75 posto etanola. Slika S2 (panel B) prikazuje HPLC hromatogram katehina i epikatehina ekstrahovanih pomoću NDES #3 iz sjemenki grožđa. Najmanja količina katehina ekstrahirana je pomoću NDES #5 pri 0,30 mg/g. Svi NDES osim NDES #1, #2 i #9 ekstrahirali su značajno veće količine epikatehina od 75 posto etanola (tabela 3). Najveće koncentracije epikatehina ekstrahovane su NDES #4 (0,71 mg/g) i NDES #5 (0,68 mg/g), dok je najniže ekstrahovano 75 posto etanolom (0,11 mg/g). Galna kiselina je bila najzastupljenija fenolna kiselina koja se može ekstrahirati u sjemenkama grožđa, a slijede je ferulna kiselina i elaginska kiselina, respektivno. Najveću količinu galne kiseline ekstrahirao je NDES #4 sa 0,45 mg/g, a zatim NDES #9 i NDES #8. Ovi NDE ekstrahovali su znatno veće količine galne kiseline od 75 posto etanola. Najmanja količina galne kiseline (0,2 mg/g) ekstrahirana je pomoću NDES #3. Najveća ekstrakcija

prinos elagične kiseline je dobijen pomoću NDES #9 (0.26 mg/g) nakon čega slijedi NDES #6 (0.17 mg/g), koji su bili značajno veći od 75 posto etanola. Slično, NDE #3 ekstrahira najmanju količinu elaginske kiseline na 0.05 mg/g. Osim toga, NDES #6, #7 i #3 ekstrahirali su znatno veće količine ferulne kiseline od 75 posto etanola. Najniži prinos ekstrakcije ferulne kiseline bio je 0,5 mg/g prema NDES #5. Nadalje, ferulna kiselina nije otkrivena u ekstraktu NDES #9. Ovo je vjerovatno zato što je rastvorljivost ferulinske kiseline bila niža u NDES #9 nego u drugim NDE. Najveći ekstrakt miricetina dobijen je sa 75 posto etanola i NDES #7 na 0.18 mg/g, što je više od svih NDE. Najveći prinos ekstrakcije kvercetina bio je kod NDES #6 (0.14 mg/g) i NDES #3 (0,13 mg/g) i oba NDES su bila bolja od 75 posto etanola. Slično, pH NDES nije utjecao na prinos ekstrakcije kao što pokazuje niska korelacija (R-kvadrat) između pH vrijednosti NDE i prinosa fenolnih kiselina, flavonola i flavan{31}}ola navedenih u Tabeli 3. 3.3 . Urađena je analiza glavnih komponenti (PCA) kako bi se povezao prinos ekstrakcije različitih fenolnih jedinjenja u kožici i sjemenkama grožđa sa NDE i 75 posto etanola (slika 1). PCA je izveden na korelacionoj matrici kako bi se otkrila moguća selektivnost nekih NDE prema ekstrakciji specifičnih fenolnih spojeva ili grupa. Oko 85 posto varijanse podataka o koži objašnjeno je glavnim komponentama 1 i 2. Grafikon opterećenja (slika 1B) pokazuje visoku korelaciju između fenolnih kiselina (elaginska kiselina, galna kiselina, ferulna kiselina) i flavonola (miricetin, kvercetin, i kempferol). Za ekstrakciju ovih grupa, najbolji rastvarači su NDES #1, #8, #7 i 75 posto etanola kao što je prikazano na grafikonu rezultata (slika 1A). U međuvremenu, izgledalo je da su katehin i epikatehin odvojeni od ostalih fenolnih grupa. Kao što je prikazano na slici 1A, NDES #3 je bio selektivan da ekstrahuje katehin i epikatehin iz kore grožđa. Ovo je bilo zanimljivo zapažanje jer je NDES#3 bio među najmanje efikasnim NDES za ekstrakciju proantocijanidina, koji su oligomeri i polimeri katehina i epikatehina [14]. Ovo sugerira da NDES #3 može biti selektivan za proantocijanidine manjih molekulskih veličina. Grupisanje fenolnih jedinjenja na plohi opne (slika 1B) bilo je drugačije od semena (slika 1D) bez obzira na niske prinose ovih jedinjenja u semenkama grožđa. Prva i druga glavna komponenta objasnile su oko 73 posto varijanse podataka o sjemenu. Kvercetin, miricetin i ferulična kiselina su ekstrahovani efikasnije pomoću NDES #6, #7 i 75 posto etanola, kao što je prikazano na grafikonu rezultata (slika 1C). Elaginska kiselina i galna kiselina su efikasnije ekstrahovane pomoću NDES #9. Još jednom, katehin je ekstrahovan sa najvećom efikasnošću pomoću NDES #3, što je bilo slično onom uočenom kod ljuski grožđa. Epikatehin je ekstrahovan sa većom efikasnošću pomoću NDES #5, #4 i NDES #8.

3.4. Optimizacija ekstrakcije fenolnih kiselina i flavonola iz muskadinske ljuske grožđa i modeliranje predviđanja ANN Kolin hlorid: levulinska kiselina: etilen glikol 1:1:2 (NDES #1) pokazao je najveći prinos ekstrakcije za elaginsku kiselinu, te je stoga izabran za dalju optimizaciju i predviđanje. Za ekstrakciju fenolnih kiselina i flavonola procijenjeni su utjecaji četiri faktora, uključujući sadržaj vode, vrijeme ultrazvučne obrade, omjer čvrste tvari i rastvarača i temperaturu ekstrakcije. Nadalje, četiri nivoa za svaki faktor ekstrakcije primijenjena su u ukupno 40 randomiziranih serija. Eksperimentalni prinos ekstrakcije elaginske kiseline, galne kiseline, ferulne kiseline, miricetina i kvercetina, zajedno sa zbirom ovih pet, prikazan je u Tabeli 4. Sveukupno, raspon razlike u prinosu ekstrakcije između najnižeg i najvišeg bio je relativno velik za fenolne kiseline. Na primjer, najniži prinos za elaginsku kiselinu bio je 9.03 mg/g (pokus #17), a najveći je bio 25,3 mg/g (pokus #15), što je rezultiralo razlikom od 16,2 mg/g (trčanje #17). Štaviše, najniži zbir prinosa bio je 20,7 mg/g, a najveći 71,5 mg/g. Ovo ilustruje značajne uticaje različitih nivoa svakog faktora ekstrakcije na prinos ekstrakcije. Pokus #15 ekstrahirao je najveću količinu elaginske kiseline. Uvjeti ekstrakcije serije #15 bili su 45 mL /10{{130}} mL sadržaja vode, 25 min ultrazvučne obrade, 1:10 (g: mL) omjer čvrste tvari i rastvarača , i temperatura ekstrakcije od 60 ◦C. Slika S3 prikazuje HPLC hromatogram optimizovanih fenolnih kiselina ekstrahovanih iz ljuske grožđa pomoću NDES #1 (pokretanje #15 u tabeli 4). Najviša galna kiselina (18,7 mg/g) postignuta je korištenjem ekstrakcijskih uvjeta u ciklusu #24, a najniža je bila 6,63 mg/g korištenjem serije #40. Za ferulnu kiselinu, serija #22 ekstrahirala je najveću količinu od 19,2 mg/g, dok ferulna kiselina nije otkrivena u serijama #14, #17, #29 i #34. Rad #22 je ekstrahovan sa 60 mL /100 mL sadržaja vode, 5 min ultrazvučne obrade, 1:5 za odnos čvrste materije i rastvarača i temperaturom ekstrakcije od 60 ◦C. Pokus #2 ekstrahirao je najviše miricetina (10,1 mg/g) i kvercetina (1,87 mg/g). Uvjeti ekstrakcije u rundi #2 bili su 60 mL /100 mL sadržaja vode, 35 minuta ultrazvučne obrade, 1:20 za omjer čvrste tvari i rastvarača i temperatura ekstrakcije od 60 ◦C. Najniži moj određeni prinos (3,79 mg/g) ekstrahovan je u rundi br. 40. Konturni grafikoni na slici 2 pokazuju uticaj parametara ekstrakcije (X1, X2, X3 i X4) na predviđeni prinos elaginske kiseline ekstrahovane NDES #1 iz kožice grožđa. Predviđeni prinosi elaginske kiseline u Tabeli 4 korišteni su za konstruiranje ovih dijagrama brojanja. Svaki panel ilustruje uticaj 2 parametra ekstrakcije. Linije konture su označene prinosom elaginske kiseline (mg/g). Optimalni predviđeni sadržaj vode bio je oko 35-45 mL/100 mL NDES, kao što je prikazano na slikama 2B i 2C. Duže vrijeme ultrazvučne obrade povećalo je prinos elagične kiseline (slike 2D i 2E), što ukazuje na kritičnu ulogu ultrazvučne obrade u ekstrakciji NDES. Tokom ekstrakcije, miješanjem ljuske ili sjemenki grožđa sa NDES-om uvedene su čestice i plin, koji su dodali mjesta akustične kavitacije za ultrazvuk kako bi se stvorile brojne male mjehuriće u NDES-u. Impplodiranje ovih mjehurića dovelo je do ekstremne temperature, razlike tlaka, velike sile smicanja, makro-turbulencija i mikro-miješanja, što je efikasno uzburkalo NDES da ubrza difuziju i prijenos mase. Kada su kavitacijski mjehurići implodirali na površinu sjemenki grožđa ili čestica pokožice, rezultirajući mikro-mlazovi i sudari među česticama doveli su do površinskog ljuštenja, erozije, razgradnje čestica, sonoporacije i poremećaja stanica [20]. Svi ovi mehanički efekti kavitacije izazvane ultrazvukom intenzivirali su prodiranje NDE u unutrašnjost ćelije tako da su međućelijski fenoli iz matriksa hrane prešli u rastvarače. Optimalni odnos čvrste materije i rastvarača bio je 1:10, kao što je prikazano na slikama 2B, 2D i 2F. Na kraju, čini se da više temperature ekstrakcije do 60 ◦C imaju pozitivan efekat na ekstraktivnost elaginske kiseline kao što je prikazano na slikama 2C, 2E i 2F. Ovo ukazuje na direktnu vezu između temperature ekstrakcije i prinosa elaginske kiseline ekstrahirane iz kožice grožđa. Prinosi ekstrakcije elagične kiseline (Tablica 4) analizirani su za modeliranje predviđanja korištenjem umjetne neuronske mreže. Eksperimentalni podaci su nasumično podijeljeni u skup za obuku i set za validaciju. Razlog za uključivanje validacije postavljene od strane statističkog softvera je suzbijanje prekomjernog prilagođavanja. Da bi se predvidio prinos elagične kiseline (Y), procijenjena su ista četiri nezavisna faktora ekstrakcije (X1, X2, X3 i X4), 1-2 skrivena sloja s različitim brojem neurona i tri aktivacijske funkcije. Primijenjene aktivacijske funkcije bile su hiperbolička tangenta, linearna i gausova. Zatim su skupovi podataka obučeni dok se ne postigne visoka vrijednost R-kvadrata i za obuku i za validaciju. Generirani su podaci predviđanja i model. Najbolja ANN struktura je odabrana analizom četiri ulaza (X1, X2, X3 i X4) sa jednim skrivenim slojem koristeći Gaussovu funkciju sa deset neurona (slika S5). R-kvadrat skupova za obuku i validaciju bio je 0,99, dok su RASE i AAE modela bili 0,062 i 0,044, respektivno. R-kvadrat validacije ANN elaginske kiseline u ovoj studiji (0,99) bio je veći od validacije ANN procijanidina (0,95) i antocijana (0,91) u prethodnoj studiji [14]. Međutim, ovo povećanje R2 može se pripisati bolje generiranom modelu uklapanja podataka u ovoj studiji, što bi moglo biti posljedica manjih eksperimentalnih grešaka. Prediktivni ANN modeli za ekstrakciju elagične kiseline koristeći NDES #1 prikazani su kao jednačina 3–13:

Cistanche za poboljšanje imuniteta

Zaključak

Trenutni nalazi predstavljaju dodatne dokaze o efikasnosti sposobnosti NDES-a da ekstrahuje polifenole iz nusproizvoda prehrambene industrije. Rezultati su podržali hipotezu o superiornoj ekstrakciji NDES uz pomoć ultrazvuka preko 75 posto etanola. NDES je efikasno ekstrahovao tri fenolne kiseline, dva flavonola i tri flavan{3}}ola iz ljuske i sjemenki grožđa. NDES #1 je bio najefikasniji NDES za ekstrakciju elaginske kiseline, dok je NDES #3 bio posebno selektivan prema ekstrakciji katehina i epikatehina. Uočljiv nedostatak NDES-a je njihova visoka viskoznost, što predstavlja izazove tokom rukovanja i oporavka. U ovoj studiji, umjetno neuronsko umrežavanje, bez obzira na ograničenja ishoda, pokazalo je praktičan pristup za prediktivno modeliranje. NDE su robusni mediji za oporavak fitokemikalija iz prehrambenih sistema. Neki NDE takođe predstavljaju manje toksičan rastvarač za proučavanje ovih fitokemikalija u živim ćelijama [21,22]. Konačno, prirodni duboki eutektički rastvarači su efikasna alternativa organskim rastvaračima.

Reference

[1] W. Bi, M. Tian, ​​KH Row, Evaluacija dubokog eutektičkog rastvarača na bazi alkohola u ekstrakciji i određivanjuflavonoidisa optimizacijom metodologije površine odziva, J. Chromatogr. A 1285 (2013) 22–30, https://doi.org/10.1016/j. chroma.2013.02.041.
[2] M. Cvjetko Bubalo, N. ´ Curko, M. Tomašević, K. Kovačević Ghani, I. Radojčić Redovniković, Zelena ekstrakcija fenola iz kožice grožđa korištenjem dubokih eutektičkih rastvarača, Food Chem. 200 (2016) 159–166, https://doi.org/10.1016/j. foodchem.2016.01.040.
[3] M. Panić, V. Gunjević, G. Cravotto, I. Radojčić Redovniković, Omogućavanje tehnologije za ekstrakciju antocijana iz komine grožđa korišćenjem prirodnih duboko eutektičkih rastvarača u šaržama od do pola litra ekstrakcija antocijana iz komine grožđa pomoću NADES-a, Food Chem. 300 (2019) 125185, https://doi.org/ 10.1016/j.foodchem.2019.125185.
[4] M. Hoffmann, et al., Vodič za proizvodnju grožđa Muscadine za jugoistok, Državni univerzitet Sjeverne Karoline, NC State Extension Publications, 2020 https://content. ces.ncsu.edu/muscadine-grape-production-guide (pristupljeno 18. januara 2021.). [5] Cline, B. i C. Fisk, Pregled površina muskadinskog grožđa, sorti i proizvodnih područja na jugoistoku SAD-a. Radionica muškatnog grožđa za savetodavne agente, u konzorcijumu malog voća južnog regiona. 2006: Southern Region Small Fruit Consortium.
[6] PC Andersen A. Sarkhosh D. Huff J. Breman 2020 6 10.32473/edis-hs100-2020.
[7] P. Greenspan, et al., Protuupalna svojstva muskadinskog grožđa (Vitis rotundifolia), J. Agric. Hrana. Chem. 53 (22) (2005) 8481–8484, https://doi.org/ 10.1021/jf058015.
[8] DN Ignacio, KD Mason, EC Hackett-Morton, C. Albanese, L. Ringer, WD Wagner, PC Wang, MA Carducci, SK Kachhap, CJ Paller, J. Mendonca, L. Li Ying Chan, Bo Lin, DK Hartle, JE Green, CA Brown, TS Hudson, ekstrakt kožice grožđa Muscadine inhibira ćelije raka prostate izazivanjem zaustavljanja ćelijskog ciklusa i smanjenjem migracije kroz protein toplotnog šoka 40, Heliyon 5 (1) (2019) e01128, https://doi .org/10.1016/j.heliyon.2019.e01128.