TUNEL test: moćan alat za procjenu ozljede bubrega

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

sažetak:Terminalni test deoksinukleotidil transferaze dUTP nick-end marking (TUNEL) je dugo uspostavljen test koji se koristi za otkrivanje fragmentacije DNK povezane sa ćelijskom smrću (3'-OH DNK termini) endonukleazama. Budući da su ovi enzimi posebno aktivni u bubrezima, TUNEL se široko koristi za identifikaciju i kvantifikaciju fragmentacije DNK i ćelijske smrti u uzgojenimbubreg ćelije i bubrezi životinja i ljudi koji nastaju iztoksične ili hipoksične ozljede. Rana karakterizacija TUNEL-a kao apoptotičkog eseja dovela je do brojnih pogrešnih tumačenja mehanizamaćelija bubrega povreda.Ipak, TUNEL postaje sve popularnijipovreda bubregaprocjenu jer se može univerzalno koristiti u kultiviranim i tkivnim ćelijama i za sve mehanizme ćelijske smrti. Nadalje, osjetljiv je, precizan, kvantitativan, lako se povezuje s određenim stanicama ili dijelovima tkiva i može se kombinirati s imunohistohemijom kako bi se omogućila pouzdana identifikacija tipova stanica ili vjerovatnih mehanizama ćelijske smrti. Tradicionalno, TUNEL analiza je ograničena na prisustvo ili odsustvo TUNEL signala. Međutim, dodatne informacije o mehanizmu ćelijske smrti mogu se dobiti analizom TUNEL obrazaca.

Liječenje bubrežnog poremećaja seksualnog uzbuđenja s cistanche suplementom u prahu

Uvod DNK je jedini molekul u ćeliji koji se može popraviti, ali se nakon oštećenja ne može u potpunosti ponovo sintetizirati. Destrukcija DNK je jedna od završnih faza procesa smrti ćelije u više koraka, koji je potencijalno reverzibilan do tačke terminalne fragmentacije DNK. Stoga je ovo drugo uobičajeni atribut i mehanistički marker ireverzibilne ćelijske smrti [1,2]. Fragmentacija DNK povezana sa ćelijskom smrću obično se "vizuelizira" testom terminalnog deoksinukleotidil transferaze dUTP nick-end labeling (TUNEL), DNK ljestvicama ili testom kometa [3]. Elektroforeza u pulsnom polju [4] i esej random oligonukleotid-primed synthesis (ROPS) [5] su još dva rijetko korištena sekundarna testa. Upotreba kometnog testa ograničena je samo na in vitro (kultivisane ćelije), a njegova kvantifikacija je radno intenzivna [6]. Izvođenje kometnih testova u izolovanim ćelijskim jezgrima je moguće, ali je povezano sa dodatnim zbunjujućim faktorima tokom izolacije jezgara. Drugi, test DNK ljestvice, nije kvantitativna metoda, a početna nada da će ljestvičasti uzorak od razmaza napraviti razliku između apoptoze i nekroze, respektivno, raspršena je jer se ovaj pristup pokazao nepouzdan [7]. Od tri glavne metode, TUNEL je najosjetljiviji, najmanje dugotrajan i najuniverzalnije primjenjiv. Može se koristiti u kultivisanim ćelijama i tkivima i za sve mehanizme ćelijske smrti. On je precizan, kvantitativan, lako se povezuje sa određenim ćelijama ili odjeljcima tkiva i može se kombinirati s imunohistohemijom kako bi se omogućila pouzdana identifikacija tipova ćelija ili mehanizama oštećenja ćelija povezanih sa TUNEL-pozitivnim signalima [2].

Prekidi DNK mjerljivi pomoću TUNEL-a proizvode se uglavnom apoptotičkim endonukleazama. Najaktivnije endonukleaze u bubrezima su deoksiribonukleaza 1 (DNase I) i endonukleaza G (EndoG) [8–10]. DNaza I je najaktivnija i najzastupljenija apoptotička endonukleaza kod sisara [11]. Bubrezi, pljuvačne žlijezde, gušterača i crijeva su organi za koje se zna da proizvode velike količine DNaze I. Epitelne ćelije u pljuvačnim žlijezdama, pankreasu i crijevima luče DNazu I kao probavni enzim u probavnom traktu. Neka stanična DNaza I se bori protiv "strane" DNK koja napada ćelije domaćina [12]. Ne-sekretirana DNaza I predstavlja skrivenu opasnost za DNK ćelije domaćina, ali DNaze normalno ne deluju na DNK ćelije domaćina sve do povrede ili smrti ćelije. U bubrezima, DNazu I luče tubularne epitelne ćelije, vjerovatno da bi uništile viruse i bakterije u urinu. Ova funkcija se vjerovatno odvija u sprezi sa proteinazama, posebno meprinom, koji je glavna proteinaza u urinu [13]. Iako štiti od infekcije, prisustvo visoko aktivne DNaze u bubrezima čini ovaj organ osjetljivim na ozljede, pri čemu je poznato da je aktivnost DNaze citotoksična za stanice domaćina. DNaze pospješuju ćelijsku smrt izazvanu toksičnim ili hipoksičnim podražajima i uništavaju sve DNK stanice bubrega domaćina oslobođene kao rezultat ćelijske smrti.

Bubrezisu organi za filtriranje koji uklanjaju toksične spojeve iz tijela. Visoka aktivnost DNaze I u bubrezima čini stanice bubrega vrlo osjetljivim na ozljede toksičnim spojevima i njihovim metaboličkim proizvodima. Ovo čini TUNEL najprikladnijom i najprimenljivijom metodom za merenje povrede bubrega. U ovom pregledu ćemo se fokusirati na TUNEL kao široko korišćen, informativan i precizan test za merenje ćelijske smrti i povrede tkiva u bubregu. Razgovarat ćemo o aspektima TUNEL-a koji se primjenjuje na bubrežne bolesti i ozljede i identificirati kvalitete, tehnike i nedovoljno korištene karakteristike TUNEL-a kako bismo promovirali produktivnu i odgovarajuću upotrebu ovog moćnog testa u istraživanju, dijagnostici i terapiji bolesti bubrega. Također ćemo razgovarati o različitim TUNEL uzorcima slika koji se mogu povezati s mehanizmima ćelijske smrti. Stavke istaknute u ovom pregledu su široko primjenjive za upotrebu TUNEL-a u organima koji nisu bubrezi.

Ključne riječi:TUNEL; smrt ćelije; bubreg; DNaze; endonukleaze; povreda tkiva

TUNEL PrinciplesTUNEL test su razvili 1992. godine Gorczyca et al. [14] i Gavrieli et al. [15], koristeći označavanje fluorohromom i avidin-peroksidazom, respektivno. U to vrijeme, postojala je očajnička potreba za novim metodama za procjenu apoptoze, a TUNEL je uspješno popunio ovu prazninu. Prvobitno plasiran na tržište kao test za prekide DNK lanca tokom ili u vezi sa apoptozom [14,16], u nedostatku boljih testova, TUNEL je brzo postao standardni test za apoptozu [17,18]. Međutim, istraživači su gotovo odmah prepoznali da TUNEL neselektivno mjeri bilo kakvu fragmentaciju DNK, a ne samo onu povezanu s apoptozom [19–21]. Ipak, potreba za apoptotičkim testovima bila je tolika da su rijetki izvještaji da je TUNEL nespecifičan za apoptozu uglavnom ignorisani. To je dovelo do enormne količine lažno pozitivnih izvještaja o apoptozi u bubrezima i drugim organima, do stepena gdje je do 20 posto ukupnih ćelija prijavljeno kao apoptotično čak i bez povreda [22–25] kada se promjene kao mali čak 0,01 posto mogao bi biti statistički značajan dokaz ozljede tkiva.

TUNEL test je doživio renesansu posljednjih godina od kraja buma studija apoptoze prije nekoliko godina. Naša PubMed pretraga članaka u časopisima koji uključuju termine "bubreg" i "TUNEL" dala je preko 1500 rezultata od 1992. do 2020. U 2019. objavljeno je 170 članaka, najveći broj u jednoj godini u posljednjih 28 godina (Slika S1) i koji čine većinu članaka anketiranih za ovu recenziju. Brojne studije su koristile TUNEL-pozitivnost kao univerzalnu mjeru ćelijske smrti povezane s fragmentacijom DNK u drugim tipovima ćelijske smrti osim apoptoze. Na primjer, feroptoza, novootkriveni oblik programirane, ne-apoptotičke ćelijske smrti izazvane oksidativnim oštećenjem koje se javlja tokom bubrežne ishemije-reperfuzije (IR) kod miševa, može se otkriti pomoću TUNEL-a [26]. Pokazalo se da je piroptoza, koja je upalni oblik programirane ćelijske smrti koja se razlikuje od apoptoze i nekroze, povezana s TUNEL-pozitivnim signalima [27,28]. TUNEL-pozitivnost je uočena tokom nekroptoze koja je doprinijela progresivnom iscrpljivanju ćelija bubrežnih tubula kod pacova podvrgnutih subtotalnoj nefrektomiji [29]. U bubrezima i drugim tkivima pronađeni su pozitivni TUNEL signali u nekrozi [30,31], disreguliranoj autofagiji [32–35], anoikisu [36,37], mitotičkoj katastrofi [35,38], autolizi [39], autolizi [39], proptoza [40] i aponeuroza [30], pokazujući da je TUNEL zaista univerzalni test za ireverzibilnu smrt ćelije.

TUNEL test se zasniva na obeležavanju 3'OH krajeva pomoću enzima DNK koji je specifičan za 3'OH kraj, terminalne deoksinukleotidil transferaze (TdT) (slika). Upotreba DNK polimeraze ili DNK polimeraze Klenow fragmenta umjesto TdT može pomoći u određivanju vrste 3'OH krajeva (urezi, praznine ili previsoki oligos) jer DNK polimeraze trebaju šablon (suprotan DNK lanac) i stoga neće označiti viseći ili izbočeni krajevi DNK. Važno je zapamtiti da proizvodnja krajeva 3ZOH DNK nije jedinstvena za apoptotičke (degradirajuće DNK) endonukleaze. 3'OH DNK krajevi su glavni "komunikacijski" signal, zajednički imenitelj većine DNK enzima. Proizvode ih i koriste gotovo svi DNK enzimi u eukariotima, uključujući endonukleaze za popravku DNK (apurinske/apirimidinske, AP), egzonukleaze, DNK polimeraze, DNK ligaze, DNK transferaze i topoizomeraze. Pored toga, 3'Id 3z-šećer, ili 3z-proteinski konjugati mogu se konvertovati u 3'OH krajeve fosfatazama, glikozilazama i proteinazama, respektivno. Zbog toga je za uspješnu primjenu TUNEL-a i interpretaciju njegovih rezultata neophodno precizno razumijevanje onoga što se mjeri.

U poređenju s dvije druge primarne metode mjerenja fragmentacije DNK, DNK ljestvicom i testom kometa, TUNEL ima prednost što se zasniva na identifikaciji završetaka DNK, a ne na fragmentima (slika 2). Teoretski, TUNEL bi trebao biti osjetljiviji i linearniji za identifikaciju početne (niske) fragmentacije DNK od DNK ljestvice ili komete, od kojih oba imaju period kašnjenja akumulacije malih fragmenata velike pokretljivosti. U svakom slučaju, studije koje kombinuju TUNEL sa kometom )41,42] ili DNK lestvicom [43,44] imaju neku prednost u hvatanju rane fragmentacije DNK sa maksimalnom osetljivošću.

TUNEL aplikacijeTUNEL se koristi za identifikaciju i kvantificiranje ozljede bubrega u kliničkim i osnovnim toksikološkim studijama u različitim primjenama, uključujući medicinske tretmane [45], okolišne [46], poljoprivredne [41] i industrijske [47] izloženosti i životinjske [48] ] i nauke o hrani [49]. TUNEL je primjenjiv na sve tipove stanica, organe i vrste koje imaju DNK i DNaze, što uključuje gotovo sve vrste. TUNEL se koristi za identifikaciju i kvantifikaciju oštećenja bubrega kod širokog spektra životinja, uključujući zebricu [50], japansku rižu ribu [51], piliće [48], gerbile [52], miševe [41], pacove [45], zečevi [53], mini-svinje [54] i ljudi [55]. Važna prednost TUNEL-a je da se može koristiti u fiksnim kultivisanim ćelijama kao iu fiksnim tkivima. Ovo obezbeđuje metodološku konzistentnost za poređenje in vitro i in vivo rezultata u studijama u kojima se mehanizmi mogu istražiti u kultivisanim ćelijama bubrega, dok se in vivo implikacije procenjuju u bubrezima životinja. Može se koristiti i bilo šta između celih ćelija i tkiva, uključujući kultivisane ćelijske sferoide [56] i ex vivo rezove bubrega [57,58].

Intenzitet TUNEL-a u smislu jačine signala ili broja TUNEL pozitivnih ćelija može varirati između vrsta u zavisnosti od aktivnosti DNaza. Prema našem iskustvu, bubreg pacova ima aktivniju DNazu I od bubrega miša, a jačina TUNEL-pozitivnog signala korelira s tim. Kada se bubreg uporedi sa drugim organima, njegov TUNEL-pozitivan signal je veoma intenzivan i sličan drugim organima sa visokom aktivnošću DNaze I, kao što su creva i pljuvačne žlezde. Na drugom kraju spektra, najniža TUNEL-pozitivna snaga signala je uočena u mozgu i ćelijama tumora/karcinoma, gdje je ekspresija DNaze I najvjerovatnije inaktivirana alternativnim spajanjem u kodirajućoj regiji [59]. TUNEL-pozitivan signal se uočava u svim tipovima ćelija u bubregu. U prosjeku, tubularni epitel je oštećen češće nego glomeruli, posebno kod akutnih ozljeda (slika 3A). Ovo dobro korelira sa aktivnošću DNaze I koja prevladava u ovim tipovima ćelija. Sudeći po spolnim i starosnim razlikama uočenim u našim eksperimentima, DNaza I je zastupljenija i aktivnija kod mužjaka nego kod ženki i životinja srednjeg doba u poređenju sa životinjama starijeg ili novorođenčeta. Međutim, nikakva jasna razlika u TUNEL-pozitivnosti nije evidentna u odnosu na pol ili godine, vjerovatno zato što su istaknuti ili dominiraju drugi faktori. U nekim modelima bubrega (kao što je ishemija-reperfuzija), DNaza I je indukovana [9]; dok kod drugih nije i čak može biti potisnut (na primjer, kod toksičnosti cisplatina) [10]. Pokazalo se da se aktivacija endonukleaza, ako je prisutna, javlja u prvih 24 h nakon povrede bubrega [9,60,61]. Stoga nije bilo iznenađujuće da je najmanje polovina TUNEL aplikacija u istraživanju bubrega u ovom pregledu korištena za akutnu ozljedu bubrega (AKI) budući da se procjena AKI često vrši unutar 24 do 72 h nakon ozljede kada su endonukleaze najaktivnije. . Lista AKI studija je duga i uključuje toksične, septičke, transplantacijske i hipoksične ozljede. U ovom radu smo ispitali modele, vrste izloženosti, tretmane, vremenske okvire procjene i tipove ćelija na koje su uticale ove studije. Istraživanja su obuhvatila akutne i mješovite akutno-hronične oblike oštećenja bubrega i kronične bolesti bubrega.

Da li se povreda bubrega sa TUNEL-pozitivnim signalom uočava u tubulima ili glomerulu zavisi od vrste štetnog agensa ili bolesti. Na primjer, lupus nefritis kod ljudi i oštećenje nanočestica nikla opisani su kao striktno glomerularni TUNEL-pozitivni signali [62,63]. S druge strane, ishemija-reperfuzija i dijabetička nefropatija izazvana streptozotocinom kod štakora su proizvele TUNEL-pozitivne ćelije samo u tubulima [64,65]. Proksimalni tubuli, Henleova petlja, distalni tubuli i kolektivni kanali su često TUNEL-pozitivni u modelima ishemije-reperfuzije. TUNEL-pozitivne ćelije u glomerulima i tubulima opisane su kod štakora izloženih lekovima kao što su ciklosporin A [66] i doksorubicin [67] ili materijalima potrošačkih proizvoda kao što su nanočestice cink oksida [68] i u štakorskom modelu dijabetes melitusa [ 69]. AKI izazvan septičkim šokom kod ljudi je takođe bio povezan sa glomerularnim i tubularnim TUNEL-pozitivnim ćelijama [70]. zadavljena opstrukcija tankog crijeva zatvorene petlje izazvala je TUNEL-pozitivnost u bubregu za 3h [87].

AKI se može pojaviti nakon transplantacije i hipoksičnih ozljeda. Odbacivanje alografta kod ljudi je obično povezano sa povećanjem TUNEL-pozitivnih ćelija [88,89]. Nakon hladne ishemije, TUNEL-pozitivne ćelije su obično opažene u roku od 2-24 h tokom reperfuzije [90], ili još uže, između 14 i 17 h nakon ishemije [91], a ponekad smo i dalje opaženi čak 7 dana u odbacivanje transplantata [92]. Slično, u modelima ishemije-reperfuzije, TUNEL-pozitivne ćelije su najčešće primećene 24 h nakon reperfuzije [44,93,94], ili u rasponu između 4 [95,96] i 72 h [97]. U studijama transplantacije i ishemijskog AKI, TUNEL-pozitivne ćelije bile su lokalizovane na distalne i proksimalne tubularne epitelne ćelije [44,93]. U mišububrezinakon ishemijsko-reperfuzijske povrede, TUNEL-pozitivne ćelije su opisane kao koncentrisane u kortikomedularnom spoju, uobičajenoj meti ishemijske povrede [98].

Mješovite akutne i kronične ozljede, gdje su izloženost toksičnosti, stanja bolesti i/ili procjene bile i akutne (tj. sati, dani) i kronične (tj. sedmice, mjeseci, godine) u istoj studiji, uočene su u transplantaciji ljudi odbacivanje (biopsija 1 tjedan do 3 godine nakon transplantacije) [88], infekcija virusom hepatitisa E svinja (7 i 14 dana nakon inokulacije) [52], CO2 pneumoperitoneum izazvan stres u hidronefrotskombubrezi(2 sedmice hidronefroza, 2 dana nakon pneumoperitoneuma) [53], mezangijalni proliferativni glomerulonefritis izazvan zmijskim otrovom (1 do 14 dana nakon injekcije) [99], jednostrana opstrukcija uretera (1 do 14 dana opstrukcije) [100], izlaganje uranil acetatu (1 do 28 dana izloženosti) [101], nefropatija aristoholne kiseline (5 i 30-dnevna izloženost) [102] i neonatalna hiperoksija (testirano 1 do 60 dana nakon rođenja, izložena hiperoksiji prvo 14 dana) [103]. Četrnaest dana nakon udara je vrlo uobičajena vremenska tačka za procjenu za ove vrstepovrede bubrega[52,53,99,101,103]. U većini slučajeva TUNEL-pozitivne ćelije bile su lokalizovane u tubulima i kolektivnim kanalima. Jedini izuzetak bila je toksičnost zmijskog otrova, koja je prvenstveno oštetila glomerule [99].

Hroničnibubregbolest (CKD), definisana kao prisustvobubregoštećenje ili smanjena brzina glomerularne filtracije (GFR) kod ljudi duže od 3 mjeseca, također je čest predmet za TUNEL procjenu, koja može utvrditi da li je CKD povezana s progresivnomoštećenje bubrega.Najčešće proučavana CKD kod koje se primjenjuje TUNEL je dijabetička nefropatija. Povreda identifikovana TUNEL-pozitivnošću desila se u tubulima i podocitima [69] kod pacijenata sa dijabetesom sa početkom dijabetesa pre TUNEL testiranja u rasponu od 7 do 30 godina [104,105] i 2 do 16 nedelja nakon tretmana streptozotocinom kod glodara [106,107]. Slična TUNEL-pozitivna histopatologija prijavljena je i kod imunoglobulinske A nefropatije [22]. Kod lupus nefritisa i membranoproliferativnog glomerulonefritisa, TUNEL-pozitivnost je viđena prvenstveno u glomerulima [62,108,109]. S druge strane, studije o sigurnosti lijekova cisplatina [110], hlorokina [45], doksorubicina [67], finasterida [23], takrolimusa [111] i levetiracetama [24] uočavale su uglavnom oštećenje tubula. Isto tako, kontinuirana akutna ozljeda identificirana tubularnim TUNEL-pozitivnim stanicama opisana je u studijama nefropatije mokraćne kiseline [112], nedostatka metionina [48], izloženosti toksinima iz okoliša mikrocistinu-LR [50] i kadmiju [113], te u povezanost s induciranim kalcijum-oksalatombubregkamenje [114] i kalcificirajuće nanočestice [115]. Dok je identifikacija progresivnog oštećenja bubrega tokom CKD pomoću TUNEL testa koristan dijagnostički alat, kombinacija TUNEL testa sa imunohistohemijom (IHC) bi možda bila još informativnija u određivanju mehanizma ozljede.

Tehnike kvantifikacije i kolokalizacije TUNEL

Metode TUNEL kvantifikacije variraju. U većini izveštaja, TUNEL-pozitivne ćelije/jezgra su kvantifikovane kao procenat ukupnih ćelija/jezgara [83,116,117]. Čini se da je ovo prava stvar, iako broj TUNEL-pozitivnih ćelija vjerovatno ne odgovara tačno broju mrtvih ćelija. Neke ćelije možda nisu dostigle prepoznatljive nivoe fragmentacije DNK, dok su druge već mogle biti eliminisane makrofagima. Kvantifikacija broja TUNEL-pozitivnih ćelija po kvadratnoj jedinici (mm2) se također koristi [118], ali se ova metoda čini manje preciznom jer ovisi o lokaciji i sadržaju tipa ćelije u područjima. Kortikalni dijelovi sadrže uglavnom glomerule, tubule, krvne žile i medularne zrake, dok medularni dijelovi prvenstveno sadrže Henleove petlje, sabirne kanale i krvne žile. Kvantifikacija "po polju" svakako zavisi od toga šta je polje [72,119], a kvantifikacija "po sekciji" je, još više, nedefinisana [61,120]. Čini se da loše identificirana mjerenja, kao što su "histološki rezultat" [121], "apoptotički indeks" [113], "stopa apoptoze" [92], "postotak apoptoze" [122] ili postotak neliječene kontrole [123,124] biti još manje prikladan i otežati tumačenje i ne može se porediti sa većinom studija.

Ćelijska smrt u susjednim stanicama počinje neravnomjerno jer ovisi o vaskularizaciji, ćelijskom ciklusu i drugim varijablama. Ovo često rezultira neujednačenim TUNEL bojenjem ćelija u tkivu [45,96,125]. Iznenađujuće, opšti intenzitet TUNEL-pozitivnog signala se ne koristi za TUNEL merenje, uprkos tome što direktno zavisi od stepena fragmentacije DNK. Ovo je možda zato što se ćelije smatraju mrtvima nezavisno od intenziteta TUNEL signala, jer ćelija ne može biti "mrtvija" ako je TUNEL bojenje intenzivnije. Iako je teško uporediti studije koje koriste širok spektar metoda za kvantifikaciju TUNEL rezultata, količina TUNEL-pozitivnih ćelija u kontrolnim životinjama je obično ispod 2 procenta [75,99,100,116,126]. Akutna povreda je povezana sa porastom TUNEL-pozitivnosti od ~5-40x [79,126,127]. Tokom hronične povrede, povećanje TUNEL-pozitivnih ćelija je nešto niže, ~2–20-puta, [29,43,65] u poređenju sa netretiranim kontrolama.

Inicijalni TUNEL test baziran na diaminobenzidinom (DAB) bojenju je dizajniran za svjetlosnu mikroskopiju [14,15]. Ova tradicionalna metoda se još uvijek koristila u dvije trećine studija obuhvaćenih ovim pregledom i u ogromnoj većini studija ljudske biopsije. Kvantifikacija se vrši ručnim brojanjem ćelija i, iako je precizna, oduzima mnogo vremena. Često se kvantifikacija uopće ne koristi, a rezultati se prikazuju korištenjem slika tretiranih i obojenih uzoraka kao jednostavnog dokaza da je došlo do ćelijske smrti. Automatizacija može ubrzati proces kvantifikacije [128,129]. Međutim, DAB se ne može kombinovati sa bilo kojim drugim bojenjem u istom uzorku, tako da TUNEL zasnovan na DAB-u može dati samo broj mrtvih ćelija, bez ikakve identifikacije tipa ćelije (osim vizuelnog prepoznavanja) ili mehanizma ćelijske smrti.

Dok se studije na ljudima u velikoj mjeri oslanjaju na DAB baziran TUNEL koristeći svjetlosnu mikroskopiju, otprilike polovina studija na životinjama koristi FL fluorescentnu mikroskopiju (slika 3). Fluorescentni TUNEL je vizualno atraktivan, lako se tumači i ima nekoliko velikih prednosti. Pored precizne kvantifikacije identifikacijom TUNEL-pozitivnih jezgara ili srednjeg intenziteta boje, FL fluorescentni TUNEL signal se može kolokalizirati s drugim bojama za histohemiju (npr. DAPI) (Slika 3A) ili IHC (Slika 3B). U potonjem, upotreba proteinskih markera može pomoći u identifikaciji TUNEL-pozitivnih signala povezanih s različitimbubregodjeljaka ili dati informacije o vrsti ćelijske smrti. Nismo mogli pronaći nijedan primjer TUNEL-a u kombinaciji sa dvostrukim bojenjem IHC antitijela. Iako bi takva kombinacija bila vrlo informativna, na primjer, za identifikaciju mehanizma ćelijske smrti u određenim tipovima ćelija, tehničke poteškoće povezane s takvim bojenjem mogu nadmašiti prednosti.

Identifikacijabubregtip ćelije sigurno nije problem za iskusnogbubregpatolog [104]. Zbog toga je retka upotreba dodatnih markera za identifikaciju tipa ćelije, na primer korišćenje CD31 za identifikaciju endotelnih ćelija [130]. Međutim, često se koristi upotreba IHC proteinskih markera za karakterizaciju ozljeda tkiva. Većina studija koristi TUNEL-pozitivnost kao jedini dokaz apoptoze. U drugim studijama, prepoznavanje da TUNEL-pozitivnost nije specifična za apoptozu dovelo je do toga da se mnogi morfološki (npr. hematoksilin i eozin ili periodičnom kiselinom-Schiff bojenje), biohemijski i IHC markeri kombinuju sa TUNEL bojenjem kako bi se potvrdila apoptoza. Najčešće korišteni marker za apoptozu zavisnu od kaspaze je odcijepljena (aktivna) kaspaza-3 korištenjem antitijela koje ne prepoznaje kaspazu pune veličine-3 [131,132]. I TUNEL i testovi cijepane kaspaze-3 pokazali su isključivo tubularno, a ne glomerularno bojenje u ishemijskoj reperfuziji štakora [64]. Druge studije kaspaze koristile su kaspazu-1 [27], -9 [53], -11 [28] i -12 [75]. Ostali apoptotički markeri uključivali su B-ćelijski limfom 2 (Bcl2) porodicu proteina Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] i Bad [43]; apoptotički receptor Fas [52] i apoptotički receptor-ligand FasL [66]; Forkhead box (FOX) proteinski transkripcijski faktori Fox01 [133] i Fox03 [27]; i citokrom c [53]. Upala je identifikovana IHC faktora tumorske nekroze-alfa (TNF) [134]; faktori rasta tumora TGF [66] i TGF- 1 [135]; serin/treonin kinaza 1 (SGK1) [135]; flavoprotein za prijenos elektrona, beta-podjedinica (ETF) [136]; Janus kinaza{55}} (JAK2) [137]; pretvarač signala i aktivator transkripcije 3 (STAT3) [137]; nuklearni faktor kapa laki lanac pojačivača aktiviranih B ćelija (NF-κB) [137] i njegov inhibitorni protein IκB [137]. Zabubregprocjena ozljede, molekul ozljede bubrega-1 (KIM-1) [24], akvaporin-1 kanal (AQP-1) [45], faktor izazvan hipoksijom {{7} }alfa transkripcijski faktor (HIF-1) ​​[103], transporter aminokiselina tipa Asc-1 (Asc-1) [121], meta rapamicina (mTOR) [131] kinaze sisara , i korištena je transglutaminaza II [89]. Oksidativno oštećenje bubrega proučavano je korištenjem markera kao što su 8-hidroksiguanozin (8OHdG) [102], lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL) [102], NAD zavisna deacetilaza sirtuin-1 (SIRT1) [138] i hem oksigenaza 1 (HO-1) [90]. Intenzivno su proučavane kinaze, uključujući put c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) [101], fosfoinozitid 3-kinazu/protein kinazu B/nuklearni faktor eritroid 2-faktor 2 transkripcije povezan sa faktorom 2 (PI3K/ Akt/Nrf2) put [46], pannexin-1 (PANX1) plazma membranski gap junction protein [26] i mitogen-aktivirana protein kinaza/ekstracelularna signalno regulirana kinaza (MAPK/ERK) [26]. Studije apoptotičkih endonukleaza uključivale su Dnazu aktiviranu kaspazom (CAD) [139], Dnazu I [108] i EndoG [139], a markeri oštećenja DNK uključivali su tumorski protein p53 (p53) [99] i protein 1 povezan s dinaminom (PARP1 ) [66]. Neke studije su također otkrile korisnom procjenu apoptoze endoplazmatskog retikuluma posredovane stresom i ozljede tkiva [75].

S obzirom na veliki broj ispitanih mehaničkih studija i prednost kombinovanja TUNEL-a sa IHC markerima za identifikaciju mehanizama ćelijske smrti, očekivalo bi se mnogo studija koje koriste kolokalizaciju između ova dva. Analiza se može izvršiti kolokalizacijom piksel po piksel između TUNEL-pozitivnih ćelija i IHC markera, srednjim intenzitetom IHC markera u TUNEL-pozitivnim područjima ili TUNEL-pozitivnim signalom znači intenzitetom u područjima pozitivnim na IHC marker. Nažalost, ova prednost TUNEL-a je korištena u samo nekoliko studija. TUNEL-pozitivne ćelije su kolokalizirane sa cijepanom kaspazom-3 ububregtubule tokom toksičnosti acetaminofenom kod pacova [74]. IHC kolokalizacija sa TUNEL-pozitivnim signalom omogućila je identifikaciju ćelijske smrti mezangijalnih ćelija tokom Habu nefritisa [99]. U svjetlosnoj mikroskopiji, kolokalizacija s mehaničkim markerima toksičnosti urađena je u serijskim sekcijama, kako su izvijestili Ott et al. [89].

TUNEL Problemi i ograničenja

Nekoliko potencijalnih problema može se pojaviti i treba ih očekivati ​​kada radite sa TUNEL-om. Jedan je da se 30OH DNK krajevi javljaju ne samo tokom ćelijske smrti kao rezultat djelovanja endonukleaze, već i kao normalni međumetabolit u gotovo svim enzimskim reakcijama s DNK. Primarna ćelijska funkcija koja proizvodi 30OH krajeve je sinteza DNK, u kojoj brojni Okazaki fragmenti teoretski mogu proizvesti lažno pozitivan TUNEL signal, posebno u visoko osjetljivim modifikacijama testa. Tokompovreda bubrega,Popravak DNK također može doprinijeti lažnim TUNEL-pozitivnim signalima kao rezultat djelovanja AP endonukleaze. Masivna oksidativna povreda bubrega izazvana hemijskim (vodonik peroksid, bleomicin) ili fizičkim (gama zračenje) ozljedom može povećati broj 30OH krajeva, povećavajući lažno pozitivna TUNEL očitanja osim fragmentacije DNK posredovane endonukleazom.

Češće i vjerojatnije, nepravilno postavljeni eksperimentalni uvjeti TdT reakcije (vrijeme, temperatura, enzimska aktivnost ili kofaktori) mogu rezultirati umjetno povišenom TUNEL-pozitivnom signalnom pozadinom. Iako ostaje nedefinisano šta se smatra normalnom bazom za netretirane uzorke tkiva bubrega, čini se verovatnim da bi oko 1 procenat ukupnih ćelija bio razuman broj. Svakako, pozadina od 10 posto ili više je jasan dokaz ili nekarakterističnih i nerafiniranih uslova analize ili odstupanja od odgovarajućih uslova skladištenja uzoraka.

Drugi problem za očekivati ​​je niska aktivnost DNaze I u nekim tipovima ćelija (npr. endotel),bubregkompartmente (npr. glomeruli) ili patološka tkiva (npr. tumori). Od ovih ćelija treba očekivati ​​da pokažu nisku TUNEL pozitivnost, ne zato što su otporne na povrede, već zato što nema dovoljno aktivnosti endonukleaze za proizvodnju merljivog signala u TUNEL-u. Prema našem iskustvu, čak i promjene između {{0}},01 posto i 0,1 posto TUNEL pozitivnih ćelija mogu biti statistički značajne i korištene kao čvrst dokaz povrede bubrega (drugog tkiva).

Konačno, problem s kvantificiranjem TUNEL bojenja nastaje kada je količina fragmentacije DNK previsoka, na primjer, u kasnim fazama ćelijske smrti ili u ozljedama visokog intenziteta, gdje se preostala DNK ne može pravilno obojiti DAPI-om zbog rastavljanja dvostruka spirala (slika 3D). U ovim slučajevima, TUNEL-pozitivni signali "vise u vazduhu", i naizgled nisu povezani sa jezgrom. Odgovornost patologa postaje da ih tumači kao TUNEL-pozitivne ćelije, a ne kao artefakt. Sa TUNEL-om označenim fluoresceinom, postoji opasnost od identificiranja pozadinske autofluorescencije u tkivu kao TUNEL-pozitivnosti [140]. U ovim slučajevima preporučuje se prebacivanje na TUNEL crvenog spektra [51,54].

TUNEL obrasci kao izvor dodatnih informacija

Nekoliko TUNEL obrazaca može se jasno razlikovati i koristiti za određivanje potencijalnog mehanizma i stepena povrede (Tabela 1, Slika 3). Obično se tip TUNEL uzorka koji sadrži samo jezgre proizvodi blaga ozljeda, dok jače ozljede (tj. povećana izloženost) rezultira jačim bojenjem i dezintegracijom jezgara ili stanica. Strogo apoptotički TUNEL obrazac je nuklearna fragmentacija kao rezultat formiranja apoptotičkih tijela (slika 3E). Mali fragmenti TUNEL-pozitivnih jezgara, koji su vjerovatno apoptotska tijela, viđeni su u ishemijskoj reperfuziji pacova 24-72 h [97]. Apoptotična tijela su također viđena sa TUNEL označavanjem jezgara u bubrežnom tubularnom epitelu i intersticijumu 14 dana nakon ishemijsko-reperfuzijske ozljede kod pacova [141]. Povećanje doze ulja lavande smanjilo je TUNEL obrasce samo jezgara i pretvorilo ih u TUNEL sličan nekrozi sa curenjem u citoplazmu [94]. Potonje je rezultat razaranja nuklearnog omotača zbog djelovanja proteinaza i lipaza u nekrozi. Citoplazmatski TUNEL (Slika 3F) viđen kao TUNEL-pozitivna citoplazma uočen je u svjetlosnoj mikroskopiji u modelu rabdomiolize u tubulima pacova [142] i u podocitima uzgajanim u prisustvu visoke glukoze i kod dijabetičke nefropatije kod miševa [135]. Citoplazmatski TUNEL je također opisan u ishemijskoj reperfuziji bubrega kod miševa koristeći FL fluorescentni TUNEL [98] i u ishemijskoj reperfuziji kod pacova pomoću svjetlosne mikroskopije [143]. Duboka i isključivo tubularna oštećenja izazvana živinim hloridom sa jakim citoplazmatskim TUNEL bojenjem koje ukazuje na oštećenje nuklearne membrane [60]. Ako se ozljeda nastavi ili se doza štetnog agensa poveća, citoplazmatski TUNEL se može pretvoriti u "neurednu" sliku raspršenog TUNEL-a (Slika 3G) koji se pripisuje kasnim fazama destrukcije stanice zbog nekroze i izlijevanja ćelijske citoplazme i ostataka. Na primjer, i citoplazmatski i dispergirani TUNEL uočen je kod miševa tretiranih cisplatinom [71,72] i pacova [144], te kod povrede podocita kod dijabetičkih štakora izazvanih streptozotocinom [145]. Dispergovani nekrotični TUNEL je takođe uočen tokom nefrotoksičnosti izazvane uranil acetatom kod miševa [101]. Na kraju, još jedna varijabla TUNEL signala na koju treba obratiti pažnju je intenzitet TUNEL-pozitivnih signala, koji mogu odstupati od ćelije do ćelije u zavisnosti od broja loma (stepena povrede) koje svaka ćelija doživljava, kao što su dokumentovale neke studije [45,96,125 ]. Za modele u kojima se opaža promjenjivi intenzitet TUNEL signala, preporučuje se kvantifikacija prema broju TUNEL pozitivnih objekata i srednjem intenzitetu bojenja.

Zaključci

Zbog visoke aktivnosti apoptotičkih endonukleaza u bubrezima, posebno Dnaze I i EndoG, primjena TUNEL-a zaistraživanje i dijagnostika bubregaje vrlo informativan. Može postati još korisniji ako se TUNEL primijeni izvan njegove početne upotrebe kao metoda za identifikaciju apoptoze. Primjena TUNEL-a isključivo za studije apoptoze je dobar primjer kako nauka može biti nenamjerno pogrešno usmjerena neprikladno korištenom metodom. Uprkos njegovoj upotrebi kao testu za uglavnom akutne povrede, TUNEL se može uspešno primeniti za procenu i AKI i CKD. Međutim, u CKD, treba očekivati ​​da će stepen TUNEL-pozitivnosti biti niži nego kod akutne povrede. Budući da je aktivnost endonukleaza (uglavnom, Dnaza I) mnogo veća u tubularnom epitelu nego u drugim odjelima bubrega, ozljeda bubrežnih tubula se obično smatra izraženijom. Međutim, glomerularne ili vaskularne ozljede također se mogu proučavati korištenjem TUNEL-a ako se ozljeda zaista dogodi u ovim odjeljenjima. Kolokalizacija FL fluorescentnog TUNEL-a sa IHC markerima omogućava identifikaciju i povezivanje tipova ćelija i mehanizama ćelijske smrti sa TUNEL signalima. TUNEL kvantifikacija može dati vrijedne informacije o stepenu ćelijske smrti, a primjena softvera za analizu slike može biti vrlo korisna u tom pogledu. Uzimajući u obzir raznolikost TUNEL obrazaca, reprezentativne slike se snažno predlažu da se utvrde i demonstriraju

TUNEL signali koji se smatraju pozitivnim. Konačno, TUNEL obrasci treba da se koriste kao izvor dodatnih informacija, kao što su mehanizam smrti ćelije i stepen toksičnosti. Na primjer, razlikovanje između TUNEL-pozitivnih apoptotičkih tijela, prisutnosti citoplazmatskih TUNEL signala ili dispergiranih TUNEL obrazaca može pomoći u identifikaciji apoptotičkih naspram nekrotičnih TUNEL-pozitivnih ćelija za preciznije tumačenje rezultata istraživanja i dijagnostike.

liječenje poremećaja bubrega zbog seksualnog uzbuđenja