Membrana ljuske jajeta ublažava hiperurikemiju povećanjem izlučivanja urata kod pacova ubrizganih kalijum oksonatom
Mar 16, 2022
sažetak:Hiperurikemija je primarni uzrok gihtnog artritisa i drugih metaboličkih poremećaja. Membrana od ljuske jajeta (EM) je efikasan i siguran dodatak za liječenje bolova i ukočenosti povezanih s osteoartritisom. Međutim, efekat EM na hiperurikemiju nije jasan. Ova studija utvrđuje efekte EM-a na hiperurikemiju ubrizganu kalijum oksonatom. Mjere se koncentracije mokraćne kiseline, kreatinina, azota ureje u krvi u serumu i aktivnost ksantin oksidaze u jetri. Nivoi proteinabubrežni transporter urata 1 (URAT1), transporter organskih aniona 1 (OAT1), transporter glukoze 9 (GLUT9) i transporter kasete G2 (ABCG2) koji se vezuje za ATP.bubregodređuju se sabubrežnihistopatologija. Rezultati pokazuju da EM smanjuje nivoe mokraćne kiseline u serumu i povećava nivoe mokraćne kiseline u urinu kod hiperurikemičnih pacova. Štaviše, EM smanjuje regulacijububrežniEkspresija proteina URAT1, pojačava OAT1 i ABCG2, ali ne mijenja ekspresiju GLUT9. Osim toga, EM ne mijenja aktivnost ksantin oksidaze u jetri ili serumu. EM također smanjuje unos mokraćne kiseline u oocite koje eksprimiraju hURAT1. Konačno, EM se značajno smanjujebubrežniupala i nivoi interleukina{0}} u serumu. Ovi nalazi ukazuju na to da EM ispoljava antihiperurikemijske efekte promocijom bubrežniizlučivanje i regulacija uratabubrežnitransporteri urata. Stoga, EM može biti koristan u prevenciji i liječenju gihta i hiperurikemije.
Ključne riječi:Bubreg; bubrežni; giht; transporter urata 1; mokraćna kiselina; kalijum oksonat
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREZNU DIJALIZU
Membrana ljuske jajeta (EM) je film pričvršćen za unutrašnjost ljuske jajeta i jedna je od komponenti jaja, glavne hrane za ljudsko zdravlje. Omogućava prodiranje kiseonika i blokira invaziju mikroorganizama. EM se sastoji od organskog materijala (70 posto), neorganskog materijala (10 posto) i vode (20 posto), pri čemu se 80 posto organskog materijala sastoji od proteina. Osim toga, sastoji se od 2,3 posto masti i 3,4 posto ugljikohidrata [1,2]. Među komponentama jaja, žumance i bjelanjci se koriste kao sirovine za hranu, a ljuske jajeta su sirovina za dodatke kalcija za formiranje i održavanje zuba i kostiju [3]. Međutim, EM je klasifikovan kao otpad i ne koristi se često. Anti-artritični efekti EM-a su nedavno prijavljeni u životinjskom modelu izazvanom lipopolisaharidom iu kliničkim studijama na ljudima [4,5]. EM je također poboljšao upalu kod pacova s kolagenom izazvanim reumatoidnim artritisom [6]. Osim toga, EM je pokazao antiartritično djelovanje kod pacova s osteoartritisom izazvanim mononatrijum jodoacetatom [7]. Mononatrijum jodoacetat je induktor artritisa gihta, a nakupljanje kristala mononatrijum urata u zglobovima može dovesti do upale, što dovodi do gihtnog artritisa. Hiperurikemija može uzrokovati stvaranje kristala mokraćne kiseline (ili urata), a taloženje tih kristala u zglobovima uzrokuje giht, oblik artritisa koji može biti vrlo bolan. EM je izvor kolagena, hondroitin sulfata, glukozamina, hijaluronske kiseline i kalcija, koji su svi opširno istraženi za liječenje osteoartritisa [8]. Rezultati ovih studija pokazuju potencijalnu korisnost EM za prevenciju i liječenje gihta i hiperurikemije.
Hiperurikemija je glavni faktor rizika za napredak inzulinske rezistencije, dijabetesa, gojaznosti, hipertenzije, ateroskleroze i kardiovaskularnih bolesti, kao i gihtnog artritisa [9-11]. Odgovarajuća kontrola hiperurikemije doprinosi prevenciji i liječenju ovih bolesti. Hiperurikemija se javlja sa povećanom proizvodnjom mokraćne kiseline ili poremećenim izlučivanjem mokraćne kiseline [12]. Smanjenjem proizvodnje i povećanjem izlučivanja mokraćne kiseline, liječenje snižavanjem urata može igrati ključnu ulogu u kontroli hiperurikemije i poremećaja povezanih s hiperurikemijom [13]. Često korišteni lijekovi za snižavanje urata kao što su alopurinol i febuksostat, inhibitor sinteze mokraćne kiseline, široko se koriste za liječenje gihta; međutim, ovi inhibitori ksantin oksidaze (XO) mogu imati ozbiljne nuspojave, kao što je sindrom preosjetljivosti na alopurinol [14–16]. Benzbromaron je urikozurični lijek koji se koristi za kontrolu gihta posljednjih 30 godina, ali je zbog teških nuspojava hepatotoksičnosti povučen sa europskog tržišta [17]. Stoga postoji potreba da se razviju lijekovi dobiveni od prirodnih proizvoda bez toksičnosti koji su učinkovitiji za prevenciju i dugotrajno liječenje poremećaja povezanih s hiperurikemijom. Stoga, ova studija istražuje štiti li EM od hiperurikemije. Ova studija procjenjuje antihiperurikemijsku aktivnost EM kod pacova sa hiperurikemijom izazvanom kalijum oksonatom (PO). PO je selektivno kompetitivni inhibitor urikaze, koji se široko koristi za inhibiciju efekta urikaze jetre, što dovodi do hiperurikemije [18,19]. Dakle, štakori tretirani PO predstavljaju praktičan životinjski model ne samo za istraživanje patologije hiperurikemije već i za procjenu potencijalnih lijekova [20]. Da bi se ispitala aktivnost i osnovni mehanizmi EM-a na hiperurikemiju, ispitani su dvostruki mehanizmi EM-a putem inhibicije proizvodnje mokraćne kiseline i pojačanja izlučivanja mokraćne kiseline kod hiperurikemičnih životinja.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREZU/BUBREZU
2. Materijali i metode
2.1. ŽivotinjeMužjaci Sprague Dawley pacova stari sedam sedmica kupljeni su od Orient Bio (Seongnam, Koreja). Adaptirani su u klimatizovanoj prostoriji za životinje na 22 ± 1 ◦C sa 50 ± 10 procenata vlažnosti. Pacovima je omogućen pristup standardnoj ishrani i vodi ad libitum. Studije na životinjama je odobrio Institucionalni komitet za njegu i upotrebu životinja Korejskog instituta za orijentalnu medicinu, a eksperimenti su izvedeni u skladu sa smjernicama komiteta (šifra odobrenja. 19-024).
2.2. Indukcija hiperurikemije i EM administracijaEM korišten u ovoj studiji je osiguran kao sušeni prah od strane JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Koreja). Da bi se izazvala hiperurikemija, životinjama je intraperitonealno ubrizgano 150 mg/kg PO (inhibitor urikaze). Korišteni su sljedeći lijekovi pozitivne kontrole: alopurinol (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i benzbromaron (TCI, Tokio, Japan). Prije injekcije, PO je otopljen u 0.5 posto karboksimetil celuloze (CMC, Sigma, SAD) i 0.1 M natrijum acetatu (Sigma, SAD). Da bi se ispitala antihiperurikemijska aktivnost EM (Eksperiment 1, preliminarna akutna studija), pacovi su podijeljeni u pet grupa (5 životinja po grupi): normalna grupa; grupa hiperurikemije (PO) ubrizgana PO; PO plus 10 mg/kg grupa koja je primala alopurinol; PO plus 100 mg/kg EM grupa; i PO plus 200 mg/kg EM grupa. U eksperimentu 1, uzorci su rastvoreni u CMC-u i davani oralno (jednom) pacovima 1 h nakon PO injekcije tokom 1 dana. Da bi se istražile aktivnosti zavisne od doze i molekularni mehanizmi EM (Eksperiment 2), pacovi su podijeljeni u 7 grupa (n=5 svaka): normalna grupa (N); grupa hiperurikemije ubrizgane PO; PO plus 10 mg/kg grupa koja je primala alopurinol; PO plus 50 mg/kg benzbromaron grupe koja je davana; PO plus 50 mg/kg EM grupa; PO plus 100 mg/kg EM grupa; i PO plus 200 mg/kg EM grupa. Uzorci su rastvoreni u 0,5% rastvoru CMC i davani oralno (svaki dan) pacovima 1 h nakon PO injekcije tokom 5 dana.
2.3. Prikupljanje uzoraka krvi, urina i tkivaKrv je sakupljena 2 h nakon primjene lijeka, a urin je također sakupljen nakon 2 h, koristeći metabolički kavez nakon obrade uzorka. Nakon uzimanja krvi i urina, tkiva(bubregi jetra) uzorci su pažljivo podijeljeni i sačuvani na 80 ◦C za dalje analize. Serum je odvojen centrifugiranjem (2000× g, 15 min, 4 ◦C). Uzorci seruma i urina su zatim korišteni za biohemijsku analizu.
2.4. Analiza koncentracije mokraćne kiseline u serumu i urinuKoncentracije mokraćne kiseline u serumu i urinu određene su korištenjem komercijalnog kompleta za analizu mokraćne kiseline (Biovision, Milpitas, Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača.
2.5. Mjerenje nivoa proinflamatornih citokina u serumuKoncentracije interleukina u serumu (IL)-1 mjerene su korištenjem kompleta za imunosorbentni test (ELISA) za IL-1 štakora (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD).
2.6. In vitro aktivnost ksantin oksidaze iz jetre i serumaAktivnost XO u tkivu jetre i serumu određena je pomoću kompleta za analizu aktivnosti XO prema protokolima proizvođača (Sigma, SAD). Aktivnost XO mjerena je čitačem mikroploča Spectra Max M3 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) korištenjem prethodno objavljenih protokola [21]. Enzimska reakcija je pokrenuta dodatkom 0.5 mM ksantina kao supstrata, a koncentracija mokraćne kiseline je mjerena svake minute tokom 5 minuta. Kao referenca korišten je inhibitor XO alopurinol. Hepatična aktivnost XO je normalizovana ukupnim nivoom proteina.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI INFEKCIJU BUBREGA/BUBREGA
2.7. Histopatološki pregled bubregaBubrežno tkivo je uklonjeno, odmah fiksirano 1 dan u formalinu, a zatim stavljeno u parafin. Svaki uzorak je isječen debljine 6 µm, a rezovi su obojeni hematoksilinom i eozinskim reagensom. Obojeni dijelovi su zatim vizualizirani pod mikroskopom.
2.8. Western blot analizaBubregtkiva su homogenizovana u rastvoru za pro-prep ekstrakciju (Intron, Seul, Koreja) i zatim centrifugirana (13,000× g, 4 ◦C) 15 min. Supernatant je korišten za Western blot analizu ciljanih proteina. Ukupni nivoi proteina određeni su testom DC proteina sa goveđim serumskim albuminom (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD). Primarna antitijela uključivala su -aktin (Santa Cruz, Dallas, TX, SAD), transporter glukoze 9 (GLUT9, MyBioSource, San Diego, Kalifornija, SAD), transporter urata 1 (URAT1; MyBioSource, San Diego, Kalifornija, SAD) i organski anionski transporter 1 (OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, SAD). Trake sa membrane su vizualizovane pomoću ECL detekcionog reagensa korišćenjem ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Seul, Koreja). Gustoća dobijenih slika određena je pomoću softvera Image J1.49 NIH (Bethesda, MD, USA). Vizualizirani nivoi ciljnog proteina su normalizirani na -aktin. Ekspresije G2 transportera kasete koji se vezuju za ATP (ABCG2) su dobijene korišćenjem ELISA kompleta za pacova ABCG2 (MyBioSource) i normalizovane ukupnim nivoima proteina.
2.9. Mjerenje apsorpcije urata korištenjem UART1-oocita koji eksprimirajuOocite koje eksprimiraju hURAT{{0}} iz Xenopusa su konstruirane kako je prethodno opisano [20]. Inhibitor URAT1 benzbromaron (TCI, Tokio, Japan) tretiran je kao referenca. Oociti su inkubirani u reakcijskom puferu sa Dulbeccovim fosfatnim puferom (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i ND otopinom (pH 7,4; 5 mM 4-(2- Hidroksietil)) piperazin-1- pufer etan-sulfonske kiseline, 2 mM KCl, 1 mM magnezijum hlorida, 1,8 mM kalcijum hlorida i 96 mM natrijum hlorida), sa 1 mM pirazin karboksilne kiseline (Sigma-Aldrich, St Louis-Aldrich. , MO, SAD) na 37 ◦C. Oocite su dalje inkubirane u rastvoru koji sadrži različite koncentracije EM (1, 10 i 100 µg/mL) sa 50 µM [14C] mokraćne kiseline (Moravek Biochemicals, Brea, Kalifornija, SAD) na 37 ◦C. Nakon 60 minuta, unos mokraćne kiseline je zaustavljen dodatkom hladnog DPBS-a. Nakon zaustavljanja, oociti su rastvoreni u rastvoru 0,1N natrijum hidroksida i 10% natrijum dodecil sulfata, a radioaktivnost je izbrojana tečnom scintilacijom.
2.10. StatistikaSvi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti. Značajne razlike su statistički procijenjene jednosmjernom analizom varijanse nakon čega je uslijedio Dunnettov test za post hoc analizu korištenjem softvera GraphPad Prism 7.05. Razlika se smatrala statistički značajnom kada je p-vrijednost bila manja od 0,05.
3. Rezultati
3.1. Učinci membrane ljuske jajeta na lučenje mokraćne kiseline u serumu,Jedna PO injekcija tokom 1 dana značajno je povećala nivoe mokraćne kiseline u serumu kod hiperurikemičnih pacova ubrizganih PO u poređenju sa onima kod normalnih pacova (Slika 1). U međuvremenu, EM u dozi od 100 i 200 mg/kg i alopurinol (pozitivna kontrola) efikasno su smanjili serumsku mokraćnu kiselinu kod hiperurikemičnih pacova ubrizganih PO. Stoga su provedene sljedeće studije kako bi se identificirale aktivnosti i mehanizmi EM-a zavisne od doze.
3.2. Učinci membrane ljuske jajeta na nivoe mokraćne kiseline u serumu i urinu,APO injekcija tokom 5 dana značajno je povisila nivoe mokraćne kiseline u serumu u PO grupi u poređenju sa onima u normalnoj grupi (Slika 2a). Tretman EM od 100 i 200 mg/kg, kao i alopurinola i benzbromarona, značajno je smanjio nivoe mokraćne kiseline u serumu u PO grupi. Osim toga, za procjenububrežna funkcija, mjerene su koncentracije kreatinina i ureje u krvi (BUN). Koncentracije kreatinina u serumu nisu se razlikovale među grupama (Slika 2b). Koncentracije BUN u serumu bile su povišene u PO grupi, ali su se ovi nivoi smanjili u grupi koja je primala EM 200 mg/kg i pozitivnoj kontroli (alopurinol i benzbromaron) (slika 2c).
Da bi se procijenio učinak EM na izlučivanje mokraćne kiseline, ispitivani su nivoi mokraćne kiseline u urinu. PO grupa je imala značajno smanjene nivoe mokraćne kiseline u urinu, koji su se povećali davanjem EM (100 i 200 mg/kg) i benzbromarona (slika 2d). Ovi podaci su pokazali da EM može povećati ekstrakciju urata iz bubrega kako bi smanjio nivoe mokraćne kiseline u serumu kod hiperurikemičnih pacova.
3.3. Efekti membrane ljuske jajeta na upalu bubregaUočena je blaga tubularna dilatacija, vakuolna degeneracija epitelnih stanica tubule, otok i infiltracija inflamatornih stanica.bubreghiperurikemičnih pacova ubrizganih PO (Slika 3a). Međutim, EM ih je efikasno poboljšaobubrežnihistopatološke promjene kod hiperurikemičnih pacova. Štaviše, hiperurikemični pacovi su pokazali povećane serumske nivoe proinflamatornog citokina IL-1 (Slika 3b). EM u svim koncentracijama značajno je smanjio nivoe u serumu kod hiperurikemičnih pacova. Primjena benzbromarona povećala je nivoe IL-1 u serumu više nego kod hiperurikemičnih pacova ubrizganih PO, iako ne značajno, i vjerovatno je to nuspojava ovog lijeka. Ovi rezultati sugeriraju da se EM efektivno poboljšaobubregupala i funkcija kod hiperurikemičnih štakora.
3.34. Efekti membrane ljuske jajeta na XO aktivnost
XO u jetri inducira proizvodnju mokraćne kiseline. Dakle, da bi se definisao mehanizam inhibitornog dejstva EM na hiperurikemiju, procenjena je aktivnost XO u serumu i jetri, aktivnost hepatičnog XO je značajno povećana u PO grupi (Slika 4a,b). Inhibitor XO, alopurinol, značajno je smanjio aktivnost XO u serumu i jetri. Međutim, EM u svim dozama nije promijenio aktivnost XO. Ovi podaci pokazuju da EM ne inhibira aktivnost XO i smanjuje proizvodnju mokraćne kiseline.
3.5. Efekti membrane ljuske jajeta na izlučivanje urataZa procjenu efekta EM na izlučivanje urata, ekspresija nekolikobubrežni transporterije pregledan. EM od 100 i 200 ug/mL i benzbromaron značajno su snizili nivoe URAT1 proteina ububreg(Slika 5a,b). Međutim, EM nije promijenio nivoe proteina GLUT9 (slika 5c). EM od 200 ug/mL povećao je nivoe proteina OAT1, a primjena EM u svim koncentracijama povećala je nivoe ABCG2 (Slika 5d,e).
3.6. Utjecaj EM na in vitro unos URAT1 u oocitePored toga, potvrđen je efekat EM na in vitro sistem za unos urata. Tretman EM sa 1, 10 i 100 ug/mL pokazao je snažnu inhibiciju uzimanja mokraćne kiseline in vitro oocita sa prekomjernom ekspresijom hURAT1- (Slika 6). Ovi podaci ukazuju da EM reguliše ekspresiju transportera urata kako bi povećao izlučivanje urata.
Diskusija
Kod ljudi bubrezi igraju važnu ulogu u homeostazi mokraćne kiseline, jer je više od 70 posto izlučenih uratabubrežni,dok se preostalih 30 posto izlučuje fecesom iz crijeva [22,23]. Međutim, izlučivanje urata može biti poremećenobubrežniporemećaja koji dovode do hiperurikemije. Izlučivanje mokraćne kiseline zavisi od proteina transportera u proksimalnim tubulimabubregza kontrolu lučenja mokraćne kiseline u krvi i filtratu [24].Renaltransporteri urata URAT1, locirani na luminalnoj membrani, i GLUT9/ na apikalnoj membranibubregproksimalni tubuli, čine primarni put reapsorpcije urata ububreg[25,26]. OAT1, koji se nalazi u bazolateralnoj membrani proksimalnog tubula, i ABCG2, koji se nalazi na apikalnoj membrani, uglavnom su odgovorni za izlučivanje urata iz krvi u epitelne ćelije [27]. Regulacija ovih transportera urata smatra se glavnim terapijskim ciljem za hiperurikemiju. U ovoj studiji, EM se efektivno smanjiobubrežniNivoi URAT1 kod hiperuremičnih pacova ubrizganih PO, iako se ekspresija proteina GLUT9 nije promijenila. Štaviše, ekspresije proteina OAT1 i ABCG2 su povećane ububregnakon EM tretmana, čime se ispoljava urikozurični efekat. Ova studija je potvrdila inhibitornu aktivnost EM-a na unos urata od strane URAT1 u URAT1-oocitima sa prekomjernom ekspresijom i da je ovaj efekat bio efikasan za poništavanje unosa urata promoviranog URATl. Ukupno, 90 posto reapsorpcije urata se postiže putembubrežniURAT1 [28]. Kontrola ovihbubregtransporteri urata EM tretmanom mogu doprinijeti promocijibubrežniizlučivanje mokraćne kiseline kod pacova sa hiperurikemijom. Kreatinin i dušik ureje su biomarkeri abnormalnostibubregfunkciju, što ukazuje na sposobnostbubregza izlučivanje proteinskih metabolita [24]. Rezultati su pokazali da PO povećava koncentraciju mokraćne kiseline i BUN u serumububrežnidisfunkcija. Međutim, EM od 200 mg/kg preokrenuo je ovo povećanje uz poboljšanjebubrežna funkcija. Enzim XO katalizira oksidaciju hipoksantina ili ksantina u mokraćnu kiselinu [28]. Inhibitori XO, kao što je alopurinol, smanjuju koncentraciju mokraćne kiseline u serumu i prekomjernu proizvodnju reaktivnih vrsta kisika prvenstveno povezanu s prekomjernom aktivnošću XO, što često uzrokuje upalno ćelijsko oštećenje vaskularnog endotela, doprinoseći razvoju metaboličkog sindroma i kardiovaskularnih poremećaja [29]. ]. Stoga, inhibicija prekomjerne aktivacije XO može biti terapijski cilj za kontrolu štetnih efekata viška mokraćne kiseline. Međutim, naša studija je pokazala da EM nije preokrenuo XO aktivnost seruma i jetre kod pacova sa hiperurikemijom izazvanom PO.
Hiperurikemija može biti element rizika zabubregdisfunkcija [23]. U ovoj studiji,bubregdisfunkciju karakteriziraju povećani nivoi BUN-a u serumu i inflamatornog citokina IL-1p ibubrežniupala kod hiperurikemičnih pacova. Ovebubrežnidisfunkcije su ublažene EM tretmanom, što ukazuje na poboljšanje bubrežne upale. Međutim, lijek benzbromaron je povisio nivoe IL-1p u serumu kod hiperurikemičnih pacova, a oštećenje bubrega prijavljeno je kao primarni neželjeni efekat urikozuričnih lijekova, uključujući benzbromaron i probenecid [30]. EM sadrži glukozamin, hondroitin sulfat, hijaluronsku kiselinu, kolagen, peptide i druge aminokiseline koje sadrže sumpor [8]. Prethodne studije su izvijestile da glukozamin i hondroitin pokazuju protuupalno i anti-osteoartritično djelovanje [31,32]. Hijaluronska kiselina je pokazala antiinflamatorne i antihiperurikemijske efekte u životinjskim modelima indukovanim kristalima natrijum urata za akutni gihtni artritis i hiperurikemiju [33]. Rezultati ovih studija pokazuju potencijalnu korisnost ovih komponenti za prevenciju i liječenje hiperurikemije. Međutim, naša studija nije pokazala koje komponente EM pojačavaju izlučivanje mokraćne kiseline. Efekti bioaktivnih komponenti dobijenih iz EM moraju se dalje istražiti. U ovoj studiji smo pokazali da hiperurikemija izazvana PO iupala bubregabio inhibiran EM tretmanom. Stoga bi EM mogao biti obećavajući antihiperurikemijski agens. Pretpostavimo da je efektivna doza EM kod pacova 100 mg/kg (maksimalna doza; 200 mg/kg). Na osnovu površine tijela, ekvivalentna doza EM kod ljudi je 16,2 mg/kg (972 mg/dan kod odraslih). Iz ovih in vivo studija, preporučena dnevna doza EM u blagim stanjima je 486 mg ili 972 mg dnevno, a maksimalna doza je 1944 mg dnevno za teška stanja. Međutim, doza se može razlikovati ovisno o trajanju liječenja i dobi. Na osnovu ovih rezultata, klinička studija EM kod ljudi će se nastaviti u bliskoj budućnosti.
