Tumorske ćelije ne uspijevaju predstaviti MHC-II-restriktirane epitope izvedene iz onkogena u CD4+ T ćelije

CD4+ T ćelije igraju ključnu ulogu u antitumorskom imunitetu kroz prepoznavanje peptidnih antigena predstavljenih na MHC klasi II (MHC-II). Iako se neki čvrsti karcinomi mogu inducirati da eksprimiraju MHC-II, nije jasan stepen do kojeg to omogućava direktno prepoznavanje od strane tumor-specifičnih CD4+ T ćelija. Izolirali smo i karakterizirali T ćelijske antigenske receptore (TCR) iz prirodno pripremljenih CD4+ T ćelija specifičnih za 2 onkoproteina, HPV-16 E6 i aktivirajuću mutaciju KRASG12V, od pacijenata sa karcinomom skvamoznih stanica glave i vrata i duktalni adenokarcinom pankreasa, respektivno, i utvrdili njihovu sposobnost da prepoznaju autologne ili humane leukocitne antigen-podudarne tumorske ćelije koje eksprimiraju antigen. Otkrili smo u oba slučaja da su TCR bili sposobni prepoznati ciljne ćelije napunjene peptidima koje eksprimiraju relevantne MHC-II ili B ćelijske antigen-prezentirajuće ćelije (APC) kada su antigeni bili endogeno eksprimirani i usmjereni na endosomalni put, ali nisu uspjeli prepoznati tumor. ćelije koje eksprimiraju izvorni protein čak i nakon indukcije površinske ekspresije MHC-II pomoću IFN-a ili transdukcija sa CIITA. Ovi rezultati sugeriraju da su primanje i funkcionalno prepoznavanje i nuklearnog (E6) i onkoproteina povezanog s membranom (KRAS) uglavnom ograničeni na unakrsno prezentiranje APC, a ne putem direktnog prepoznavanja tumorskih stanica induciranih da eksprimiraju MHC-II.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Uvod

Maligna transformacija somatskih ćelija inicira se djelovanjem aktiviranih onkogena koji disreguliraju puteve rasta stanica i dovode do nekontrolirane proliferacije (1). U slučaju karcinoma povezanih s HPV-om, ekspresija ranih HPV gena E6 i E7 doprinosi onkogenezi inhibicijom tumor supresorskih gena p53 i Rb, respektivno (2). Alternativno, konstitutivna aktivacija onkogena može se desiti kroz somatsku mutaciju u genima koji regulišu rast ćelija i puteve proliferacije, kao što je porodica RAS. Zaista, aktivirajuće KRAS mutacije kao što je KRASG12V obično se nalaze kod pacijenata sa karcinomom gušterače, debelog crijeva i pluća (3). Iako onkogeni promovišu bolest, oni takođe mogu biti mete za imuni sistem domaćina. Posljednjih godina, uloga imunološkog sistema u kontroli karcinoma povezanih s HPV-om postala je široko priznata. CD8+ i CD{10}} T ćelije koje prepoznaju HPV E6 i E7, kao i druge HPV proteine, identifikovane su i u perifernoj krvi iu limfocitima koji infiltriraju tumor (TIL) pacijenata sa HPV-om povezanim karcinomi (4–6). Imunoterapija usmjerena na ove antigene, uključujući terapijske vakcine protiv raka i adaptivnu ćelijsku terapiju (ACT) sa TIL ili TCR-projektovanim T ćelijama, aktivno su područje pretkliničkih i kliničkih istraživanja (2). Odgovori T-ćelija na onkogene mutacije su također široko opisani (7-9). Nadalje, postoje direktni klinički dokazi da ACT sa TIL-ima koji ciljaju mutantni KRAS može promovirati objektivne odgovore (10). Iako CD8+ T ćelije koje prepoznaju epitope izvedene iz onkogena posreduju u direktnoj citotoksičnosti protiv tumorskih ćelija (11–13), uloga CD4+ T ćelija u antitumorski imunitet je manje shvaćena. Nedavne studije su istakle podskup CD4+ T ćelija koje eksprimiraju citotoksične markere, kao što je granzim B (GrzmB), kod ljudskih karcinoma (14, 15). Međutim, specifičnosti antigena ovih ćelija, a time i njihov terapeutski potencijal, ostaju uglavnom nepoznati. Nadalje, da bi ove citotoksične CD{30}} T ćelije prepoznale i ubile tumorske ćelije, ne samo da tumorske ćelije moraju eksprimirati MHC-II, već i relevantni antigeni moraju biti usmjereni na odgovarajući put prezentacije. U ovoj studiji smo istraživali kapacitet CD4+ T ćelija specifičnih za onkoproteine ​​HPV-16 E6 i KRASG12V da prepoznaju tumorske ćelije koje eksprimiraju antigen. Iako su oba TCR-a bila u stanju da direktno prepoznaju endogeno obrađene i predstavljene antigene usmjerene na endosomalni kompartment HLA-podudarnih B stanica, nijedan nije bio sposoban prepoznati tumorske ćelije koje eksprimiraju antigen sa indukovanom ekspresijom MHC-II. Sve u svemu, naši rezultati sugeriraju da su samo određeni antigeni predstavljeni direktno na MHC-II+ tumorskim ćelijama, što može ograničiti skup CD4+ T ćelija sposobnih da direktno prepoznaju i eliminišu tumorske ćelije.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Rezultati

Identifikacija HPV-16 E6-specifičnih CD4+ i CD8+ T ćelijskih odgovora iz TIL karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata. Pregledali smo seriju pojedinačnih TIL kultura izolovanih od fragmenata tumora od 2 do 4 mm od pacijenta (Hu-56) sa HPV-16+ karcinomom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC) (Dopunska tabela 1; dodatni materijal dostupno na internetu uz ovaj članak; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) pomoću IFN-ELISPOT testova za identifikaciju odgovora T ćelija usmjerenih protiv HPV-16 virusnih onkoproteina E6 i E7, koristeći peptidne pulove koji se sastoje od preklapajućih 15-mera koji obuhvataju dužinu E6 i E7 proteina. Primjetno, TIL fragmenti 12 i 29 generirali su značajan broj mrlja preko pozadine kada su restimulirani skupom peptida E6 i sadržavali su i CD4+ i CD8+ T ćelije (Slika 1A i Dodatna slika 1A). Da bismo identifikovali relevantne podskupine T ćelija, analizirali smo ove TIL kulture koristeći test sekrecije citokina. Ovo je otkrilo TIL fragment 29 (F29) sadržavao E6-reaktivne CD8+ T ćelije, dok je fragment 12 (F12) sadržavao i CD4+ i CD8+ T ćelije sposobne za prepoznavanje skupa peptida E6 (slika 1B). Nijedna od CD4+ T ćelija nije proizvela IL-5 kao odgovor na restimulaciju E6, potvrđujući fenotip poput Th1-. Da bismo odredili TCR klonalnost E6-specifičnih TIL-ova, sortirali smo pojedinačne CD4+ T ćelije koje luče IFN iz F12 i CD8+ T ćelije iz F12 i F29. TCR sekvenciranje je otkrilo jedan TCR eksprimiran CD4+ T ćelijama koje luče IFN- (n=31 od 31 sekvencirane ćelije), kao i jedan TCR klon koji dijeli IFN- koji luče CD{{53 }} T ćelije iz F12 i F29 (n=40 od 41 i 37 od 38 sekvenciranih ćelija, respektivno) (Dopunska tabela 2). Ovi rezultati ukazuju da su monoklonske CD4+ i CD8+ T ćelije reaktivne na E6 prisutne u TIL-ovima ovog pacijenta. HLA-A*02:01–ograničene CD8+ T ćelije iz TIL-a prepoznaju E6 predstavljen putem tumorske ćelijske linije izvedene od pacijenta. TIL-ovi iz F29 proizvode IFN- kada su restimulirani peptidom E629-38, što sugerira da je F29 TCR prepoznao ovaj prethodno opisani HLA-A*02:01-restriktirani epitop (dodatna slika 1B) (11). Ovo je potvrđeno studijama vezivanja tetramera koristeći E629-38/HLA-A*02:01 za označavanje TCR-deficitarnih J76 ćelija koje eksprimiraju humani CD8 i koristeći prethodno opisani E628-38-specifični TCR kao pozitivan kontrola (slika 2A) (11). Oba TCR-a su pokazala slične nivoe funkcionalne avidnosti, što je pokazano povećanjem regulacije markera akutne aktivacije CD69 na J76 nakon stimulacije autolognim B limfoblastoidnim ćelijskim linijama (B-LCLs) pulsiranih s titriranim koncentracijama E629-38 peptida (Slika 2, B i C). Ovi podaci potvrđuju prisustvo CD8+ T ćelijskog klona specifičnog za poznati epitop E6 sa sličnim funkcionalnim karakteristikama kao TCR koji je testiran u kliničkom okruženju (16). Zatim smo pokušali utvrditi može li E6-specifičan CD8+ TCR prepoznati endogeno eksprimirane antigene i na taj način posredovati u antitumorskoj citotoksičnosti. Da bismo to učinili, koristili smo dobro okarakteriziranu liniju tumora HLA-A*02:01+ HPV-16+, CaSki, kao i autolognu ćelijsku liniju tumora, HNSCC-56, generiranu putem ćelijsko reprogramiranje primarnog tumorskog tkiva kao što je prethodno opisano (17) za in vitro testove citotoksičnosti. RNA-Seq analiza potvrdila je ekspresiju ranih gena HPV-16, uključujući E6, i na uzorku primarnog tumora i na autolognoj ćelijskoj liniji (dopunska slika 1C). Primarne ljudske CD{111}} T ćelije koje eksprimiraju F29 TCR mogle bi posredovati u uništavanju ćelija i CaSki i HNSCC-56 u rasponu omjera efektor-cilja in vitro (Slika 2, D i E). Zajedno, ovi podaci potvrđuju da F29 TCR prepoznaje endogeno eksprimirani E6 antigen. Identifikacija HLA-DQ-ograničene, E6-specifične CD4+ T ćelije iz TIL-ova. Da proširimo E6-specifične TIL-ove za dalju funkcionalnu analizu, koristili smo prethodno opisani protokol kulture brze ekspanzije sa OKT-3 i ozračene alogene PBMC-ove da proširimo TIL-ove iz F12. Iako je primarna kultura F12 prvobitno sadržavala i CD8+ i CD4+ T ćelije sa E6 reaktivnošću, konačni ćelijski proizvod nakon brzog širenja sadržavao je 99% CD{130}} T ćelija, od čega otprilike 38,33 % je pokazao reaktivnost protiv E6, kao što je pokazano bojenjem intracelularnog citokina za IFN- (Slika 3A).

Kineska biljka cistanche biljka-antitumor

Pored IFN-a, stimulirani E6-specifični CD4+ TIL-ovi mogu lučiti TNF- ali ne i IL-2 (dodatna slika 2A). Iako se ukupna učestalost GrzmB+ ćelija nije povećala sa stimulacijom antigena, ispitivanje ćelija koje luče TNF otkrilo je da E6-specifični CD4+ TIL sadrže više pohranjenih intracelularnih GrzmB nego nespecifični TIL (dodatna slika 2B ). CD4+ TIL-ovi koji luče IFN također su eksprimirali kohibitorni marker programirana ćelijska smrt 1 (PD-1), u skladu s objavljenim potpisima tumor-reaktivnih CD4+ TIL-ova (dodatna slika 2C) ( 18, 19). E6-specifični CD4+ TIL su pokazali visoku funkcionalnu avidnost jer su ove ćelije mogle lučiti citokine pri koncentracijama peptida manjim od 1 ug/mL (slika 3B). Da bismo odredili specifičnost kulture F12 TIL, pulsirali smo autologne B-LCL-ove sa pojedinačnim peptidima koji odgovaraju svakom od 37 peptida sadržanih u originalnom skupu E6 (dopunska tabela 3). CD4+ TIL-ovi iz F12 luče IFN- kada su stimulirani peptidima E61-15 i E65-19, koji dijele sekvencu jezgra od 11 aminokiselina (dopunska slika 2D). Eksperimenti kokulture u prisustvu HLA-blokirajućih Abs otkrili su značajno smanjenu sekreciju IFN-a od strane TIL-a kada su B-LCL-ovi blokirani anti-HLA-DQ Abs, ali ne i anti-HLA-DR ili izotip kontrolnih Abs (Slika 3C). Da bismo utvrdili koji su HLA-DQ aleli odgovorni za prezentaciju ovog epitopa, pulsirali smo B-LCL-ove koji eksprimiraju poznate HLA-DQ alele (Dopunska tabela 4) sa E61-15 i otkrili da ćelije KAS011 koje eksprimiraju HLA-DQA1*01 :02 i DQB1*05:02, ali ne i Hu-195 B-LCL-ovi koji eksprimiraju DQA1*05:05 i DQB1*03:01, mogu predstaviti antigen TIL-ovima na uporediv način sa autolognim Hu{{63} } B-LCL-ovi (slika 3D). Konačno, pokušali smo da potvrdimo da je prethodno identifikovana TCR sekvenca zaista odgovorna za prepoznavanje E6. Ekspresija F12 TCR u CD4+ T ćelijama primarnih humanih donora bila je dovoljna da promoviše prepoznavanje E61-15 peptida, o čemu svjedoči pojačana regulacija CD69 i PD-1 (Slika 3E ). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju identifikaciju HLA-DQ-restriktnog epitopa E6 koji prepoznaju monoklonalni CD{75}} TIL-ovi. E{76}}specifične CD4+ T ćelije ne prepoznaju ili ubijaju autologne tumorske ćelije koje eksprimiraju MHC-II. Nedavne studije su identificirale genetske potpise citotoksičnih CD4+ TIL-ova kod nekih ljudskih karcinoma (14, 15). Međutim, nije poznato da li citotoksične CD4+ T ćelije igraju ulogu u karcinomima uzrokovanim HPV-om. Da bismo utvrdili da li E6-specifične CD4+ T ćelije iz TIL-a mogu direktno prepoznati HNSCC-56, prvo smo istražili njegov status ekspresije MHC-II. Iako tumorske ćelije nisu eksprimirale površinski MHC-II koji se može detektovati u kulturi, tretman sa IFN-om u trajanju od 72 sata bio je dovoljan da izazove pojačanu regulaciju MHC-II (Slika 4A). Zatim smo uzgajali HNSCC-56 sa CD4+ F12 TIL-ovima. Važno je da MHC-II+ tumorske ćelije prethodno kondicionirane sa IFN- nisu bile u stanju da stimulišu CD4+ TIL-ove mjereno sekrecijom IFN-a (Slika 4B).

Slika 1. Identifikacija E6-reaktivnih CD4+ i CD8+ TIL-ova iz HPV-16+ HNSCC. (A)

Slika 2. Funkcionalne karakteristike HLA-A*02:01–ograničenog, E6-specifičnog TCR-a iz Hu-56 TIL-ova. (A)

Međutim, IFN-tretirane tumorske ćelijske linije pulsirane sa E61-15 prije dodavanja TIL-a bile su u stanju stimulirati odgovor T stanica, što ukazuje na to da površinska ekspresija restriktivnih HLA-DQ alela u ćelijskoj liniji koja endogeno eksprimira E6 nije bio dovoljan za prepoznavanje tumora, ali je zahtijevao egzogeno opterećenje ciljnog peptida. Isti zahtjev za egzogenim opterećenjem ciljnog peptida uočen je kod tumorskih ćelija transduciranih CIITA (HNSCC-56 CIITA), koje konstitutivno eksprimiraju visoke nivoe površinskog MHC-II (slika 4B). Da bismo testirali da li CD4+ TIL-ovi mogu prepoznati endogeno obrađenu i predstavljenu verziju epitopa E6 na APC-u, retrovirusno smo transducirali autologne B-LCL s ekspresijskim konstruktom koji kodira prvih 50 aminokiselina E6 spojenih na MHC- I transmembranski domen (E6-MITD), koji indukuje lokalizaciju spojene aminokiselinske sekvence na plazma membranu i podržava prezentaciju na MHC-II putem endosomalnog prometa (20). B-LCL-ovi koji eksprimiraju E6-MITD konstrukt mogu stimulirati E6-specifične CD4+ TIL-ove, što ukazuje da se peptidni epitop prepoznat od strane ovih TIL-a može prirodno obraditi i predstaviti na MHC-II kada usmjereni na odgovarajući put (slika 4C).

Slika 3. Funkcionalne karakteristike klonski proširenih, HLA-DQ-ograničenih, E6-specifičnih CD4+ TIL-ova. (A)

Zatim smo pokušali utvrditi da li su F12 E6-specifični CD4+ TIL-ovi bili sposobni za direktnu tumorsku citotoksičnost. U skladu sa podacima iz naših testova prepoznavanja, E6-specifični CD4+ TIL-ovi nisu bili u mogućnosti da ograniče rast HNSCC-56 tumorskih ćelija, koje ne eksprimiraju MHC-II (Slika 4D) . Nadalje, tumorske ćelije HNSCC-56 CIITA su također rasle neinhibirane u prisustvu CD4+ TIL-a. Međutim, rast HNSCC{10}} CIITA tumorskih ćelija pulsiranih sa E61-15 peptidom inhibiran je na način koji ovisi o dozi efektorskih stanica. Sve u svemu, ovi podaci sugeriraju da iako HNSCC-56 može predstaviti epitope E6 CD8+ T ćelijama, E6-specifični CD4+ TIL-ovi nisu u stanju direktno prepoznati i lizirati MHC- II+ autologne tumorske ćelije. Geni uključeni u prezentaciju antigena često su mutirani kod karcinoma, što može spriječiti prepoznavanje od strane T stanica (21). Da bismo utvrdili da li su tumorske ćelije HNSCC{21}} sadržavale bilo kakve somatske mutacije koje onemogućuju prezentaciju antigena na MHC-II, izvršili smo sekvencioniranje cijelog egzoma tumorskih ćelija i PBMC iz Hu-56 kao referentnog uzorka. Od 104 identifikovane nesinonimne somatske mutacije, nije bilo očiglednih mutacija u komponentama puta prezentacije MHC-II, uključujući HLADMA, HLADMB i CD74 (dopunska tabela 5). Identifikacija HLA-DRB5*01:01–ograničenog, KRASG12V-specifičnog TCR-a iz krvi pacijenta sa duktalnim adenokarcinomom pankreasa. Prateći ove rezultate, odlučili smo da utvrdimo da li je nemogućnost tumorskih ćelija da predstave antigen na MHC-II istinita za druge onkogene. S obzirom na to da su cirkulirajuće tumor-specifične T ćelije identificirane kod pacijenata oboljelih od raka (8, 22), stimulirali smo PBMC od pacijenta (Hu-66) s duktalnim adenokarcinomom pankreasa (dopunska tabela 1) skupom peptida koji odgovaraju uobičajenim onkogenim mutacijama (Dopunska tabela 6) 14 dana prije restimulacije sa pojedinačnim peptidima da se identifikuju relevantni odgovori T ćelija pomoću ELISPOT-a. Ovi rezultati su ukazivali na prisustvo T-ćelijskog odgovora usmjerenog protiv KRASG12V, što je dokazano povećanim brojem IFN tačaka u pozadini kao odgovor na KRASG12V aminokiseline 1-15 (Slika 5A). Da bismo identifikovali relevantne TCR povezane sa ovim odgovorom, ponovo smo koristili test sekrecije citokina da sortiramo ćelije koje luče IFN. Test sekrecije citokina otkrio je specifičnu proizvodnju IFN-a od strane CD4+ T ćelija kao odgovor na restimulaciju sa KRASG12V (Slika 5B). Upoređivanje TCR lanaca iz sortiranih ćelija koje izlučuju IFN-- sa onima koje su prisutne u neproširenim PBMC-ovima ovog pacijenta otkrilo je jedan TCR klonotip prisutan na najvišoj frekvenciji među obje populacije (Slika 5C i Dodatna tabela 2). Ovi rezultati pokazuju da je učestalost ovog klona T ćelija bila proširena na početku u PBMC, što ukazuje na prirodni odgovor in vivo, a ne in vitro prajming u našoj ekspanzionoj kulturi. Da bismo potvrdili antigensku specifičnost ovog TCR-a, eksprimirali smo ga u primarnim ljudskim CD{60}} T ćelijama retrovirusnom transdukcijom i uzgajali ove ćelije sa autolognim B-LCL-ovima pulsiranim ili s mutantnim KRASG12V ili odgovarajućim WT peptidom. Konstruisane T ćelije luče IFN- kada su stimulisane mutantom, ali ne i WT, KRAS peptidom, potvrđujući da je ovaj TCR specifičan za KRASG12V (Slika 5D). U skladu s našim rezultatima iz E6 TCR, konstruirane T ćelije koje eksprimiraju KRASG12V-specifičan TCR su također bile u stanju prepoznati B-LCLs koji eksprimiraju fragment KRASG12V, ali ne i WT KRAS, usmjeren na endosom uključivanjem MITD-a, što sugerira da je ovo TCR prepoznaje endogeno obrađen i predstavljen antigen (slika 5D).

Slika 4. Autologne tumorske ćelije ne predstavljaju endogene E61-15 na MHC-II do CD4+ T ćelijama. (A)

Slika 5. Identifikacija HLA-DRB5*01:01–ograničenog, KRASG12V-specifičnog TCR-a iz krvi pacijenta sa duktalnim adenokarcinomom pankreasa. (A)

Da bismo identificirali restriktivni HLA alel, ponovili smo ove eksperimente stimulacije peptida koristeći B-LCLs koji eksprimiraju različite kombinacije HLA gena. B-LCL-ovi koji eksprimiraju uobičajeni HLA-B7-DR15-DQ6 haplotip mogu stimulirati konstruirane T ćelije, dok B-LCL-ovi bez ovih alela ne mogu (Slika 5E). Konačno, stimulacija ovih ćelija IHW03304 pulsiranog peptidom, mišje DAP3 ćelijske linije transficirane humanim HLA-DRB5*01:01, potvrdila je ovo kao restriktivni HLA molekul (slika 5F). MHC-II+ NCI-H2444 i DAN-G tumorske ćelije ne predstavljaju epitop izveden iz KRASG12V CD4+ T ćelijama. Zatim smo istražili kapacitet tumorskih ćelija da direktno predstave epitope izvedene iz KRASG12V na MHC-II. Da bismo generisali ćelijske linije MHC-II+ koje se podudaraju s HLA za ove studije, transducirali smo KRASG12V+ stanične linije NCI-H2444 i DAN-G, izvedene iz humanog raka pluća i pankreasa, sa CIITA-om i konstruktom koji kodira HLA-DRB5*01: 01 sa skraćenim CD34 reporter genom (slika 6A). U skladu s našim prethodnim rezultatima, MHC-II+ tumorske ćelije koje eksprimiraju restriktivni HLA alel nisu bile u stanju stimulirati T-ćelije konstruirane s TCR-om osim ako ciljne stanice nisu prvo pulsirane egzogenim peptidom (slika 6B). Važno je da nije bilo navedenih somatskih mutacija u genima za prezentaciju MHC-II (naime, HLADMA, HLADMB, CD74) za NCI-H2444 ili DAN-G u javno dostupnim podacima sekvenciranja (23). NCI-H2444 CIITA ćelije su rasle neinhibirane u prisustvu T ćelija konstruisanih TCR, dok su NCI-H2444 CIITA ćelije pulsirane sa KRASG12V peptidom imale odloženi rast tumora (slika 6C). U skladu sa rezultatima dobijenim za HNSCC-56, CD8+ T ćelije koje eksprimiraju HLA-A*03:01– ograničenu, KRASG12V-specifični TCR (24) su bile u stanju prepoznati NCI-H2444 ćelije, ali ne CaSki ćelije, koje eksprimiraju HLA-A*03:01, ali ne i KRASG12V (slika 6D). Ovi rezultati pokazuju da poseban onkogen prisutan u citosolu takođe ne može biti predstavljen MHC-II+ tumorskim ćelijama uprkos tome što je efikasno predstavljen na MHC-I. Ekspresija kohibitornih liganada kao što je ligand programirane ćelijske smrti 1 (PD-L1) od strane tumorskih ćelija ograničava TCR signalizaciju u T ćelijama (25). Da bismo utvrdili da li ovaj mehanizam možda sprečava prepoznavanje MHC-II+ tumorskih ćelija od strane CD4+ T ćelija, kultivisali smo CD4+ T ćelije koje eksprimiraju naš KRASG12V-specifičan TCR ili E6-specifičan F12 TCR sa NCI-H2444 CIITA i HNSCC-56 CIITA, respektivno, sa ili bez anti–PD-L1–blokiranja Abs. Blokiranje PD-L1/PD-1 interakcija nije bilo dovoljno da promovira prepoznavanje tumorskih ćelija (dodatna slika 3). Slično, dodatak anti-CD28 agonista Ab nije modulirao prepoznavanje tumorskih ćelija. Ovi rezultati sugeriraju da je nedostatak prezentacije antigena, a ne prisustvo ili odsustvo kohibitornih ili kostimulatornih signala, odgovorno za ovaj fenotip. Neke studije sugeriraju da se endogeni proteini internalizovani iz plazma membrane prvenstveno stavljaju na MHC-II za prezentaciju, u poređenju sa drugim subcelularnim odjeljcima (26). Iako su KRAS proteini često povezani sa membranama putem lipidnih modifikacija, oni ne eksprimiraju transmembranski domen i ove interakcije nisu stabilne (3, 27). Stoga smo zaključili da pričvršćivanje imunogenog fragmenta KRASG12V na plazma membranu tumorskih ćelija može omogućiti direktno prepoznavanje antigena od strane CD4+ T ćelija. Međutim, tumorske ćelije koje eksprimiraju KRASG12V-MITD konstrukt, kao što je dokazano ekspresijom P2A-povezanog EGFP reportera, na sličan način nisu bile u stanju stimulirati CD{109}} T ćelije dizajnirane s TCR (dodatna slika 4). Ovi rezultati sugeriraju da subcelularna lokalizacija onkogena nije jedina determinanta direktne prezentacije MHC-II tumorskim stanicama. Osim toga, ovi rezultati sugeriraju da prekomjerna ekspresija antigena nije dovoljna da promovira prezentaciju MHC-II. Naši dosadašnji rezultati sugeriraju da je veća vjerovatnoća da će tumor-specifične CD{114}} T ćelije prepoznati antigene koje predstavljaju APC nego same tumorske ćelije. Stoga smo procijenili kapacitet HLADRB5*01:01+ DC-a da predstave antigene izvedene iz egzogenih proteina. HLA-usklađeni DC-ovi generirani in vitro bili su sposobni da stimuliraju TCR-projektovane CD4+ T ćelije koje eksprimiraju KRASG12V-specifičan TCR kada su nezreli DC-ovi ili pulsirani KRASG12V 20-mer peptidom ili hranjeni cijelim proteinom KRASG12V, ali ne KRAS WT protein (slika 6E). Ovi rezultati sugeriraju da iako TCR ne može prepoznati endogene antigene predstavljene tumorskim stanicama, on može prepoznati unakrsno predstavljene egzogene antigene u kontekstu DC.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Diskusija

Cilj ove studije je bio da se utvrdi da li TCR izolovani iz prirodno pripremljenih T ćelija dobijenih od pacijenata obolelih od raka mogu prepoznati tumorske ćelije koje eksprimiraju onkogene. S obzirom na klasu I (HLA-A*02:01) – ograničen, HPV-16 E629-38 TCR dobijen od HNSCC TIL-a, prepoznavanje je, možda i ne iznenađuje, potvrđeno i za autolognu ćelijsku liniju tumora i dobro okarakterisana tumorska ćelija koja se podudara sa HLA i E6-, CaSki (važno, videti sliku 2). Isti TIL-ovi (Slika 1) također su sadržavali značajan broj E6-specifičnih CD4+ T ćelija koje proizvode IFN (slika 3), koje, nasuprot tome, nisu prepoznavale E6- ekspresirajući tumorske ćelije, čak i kada su bile inducirane da eksprimiraju obilje površinske MHC klase II ispravnog prezentirajućeg alela (DQA1*01:02/DQB1*05:02) tretmanom IFN-om ili CIITA transdukcijom (Slika 4). CIITA ekspresija indukuje ne samo površinsku ekspresiju MHC-II proteina već i HLA-DM i molekule invarijantnog lanca, koji su potrebni za procesiranje i prezentaciju antigena (28). Nasuprot tome, B ćelije koje se podudaraju sa HLA su prepoznate od strane ovog TCR-a kada je antigen bio usmeren na MHC-II put. Slična situacija je uočena u slučaju KRASG12V-specifičnog, HLA-DRB5*01:01-restriktnog TCR-a, koji je mogao prepoznati B ćelije koje se podudaraju s HLA, ali ne i tumorske ćelije koje eksprimiraju MHC-II, kada je antigen usmjeren na MHC-II put prezentacije. Oba TCR-a posjeduju dovoljnu funkcionalnu avidnost da posreduju u prepoznavanju endogeno eksprimiranih antigena pod gore opisanim uvjetima, i oba su mogla posredovati u citotoksičnosti ciljnih ćelija napunjenih peptidima. Ovo poslednje zapažanje odražava okolnost predstavljenu u nekoliko izveštaja o citotoksičnim CD4+ T ćelijama, iako naši podaci proširuju kontekst ovog zapažanja pokazujući da je malo verovatna endogena ekspresija izvornog antigena i indukcija MHC-II od strane IFN-a. da se dobije fiziološka meta na epitelnim tumorskim ćelijama za TCR protiv nuklearnih ili membranskih antigena. Nedavne studije raka mokraćne bešike i melanoma kod ljudi identifikovale su genetske potpise koji odgovaraju citotoksičnim CD4+ T ćelijama među TIL-ovima (14, 15). Funkcionalno, ovi citotoksični CD4+ TIL-ovi su sposobni za direktno prepoznavanje tumora zavisnog od MHC-II, što na kraju dovodi do ciljane lize od strane granzima na način sličan njihovim CD8+ kolegama. Međutim, terapijski prijevod ovih nalaza može biti ograničen činjenicom da mali broj solidnih tumora eksprimira MHC-II. Zaista, rezultati 2 nezavisne studije sugeriraju da samo otprilike jedna trećina pacijenata s melanomom ima bilo koju MHC-II+ tumorsku ćeliju, a učestalost ovih ćelija unutar tumora je često manja od 10% (15, 29). Umjesto toga, čini se da su dominantni ćelijski izvor MHC-II u mikrookruženju tumora infiltrirajući leukociti (26).

Slika 6. MHC-II+ KRASG12V+ tumorske ćelije ne predstavljaju epitope izvedene iz KRASG12V CD4+ T ćelijama. (A)

Iako neke ćelije solidnog tumora eksprimiraju ili konstitutivni ili inducibilni MHC-II, naši rezultati pokazuju da uprkos prisutnosti onkogen-specifičnih CD4+ T ćelija među TIL-ovima i PBMC-ovima, ove ćelije ne mogu direktno prepoznati i lizirati ekspresiju antigena MHC-II+ tumorske ćelije, dok se epitopi iz istog proteina mogu efikasno predstaviti CD8+ T ćelijama na MHC-I (13). Ovo sugerira da jednostavno izražavanje ciljnog antigena možda neće biti dovoljno za prepoznavanje od strane CD4+ T ćelija za podskup tumora koji eksprimiraju MHC-II. Nadalje, čini se da su ovi rezultati konzistentni za više tipova tumora, jer ćelijske linije koje su ispitivane u ovoj studiji uključuju one izvedene iz HNSCC, adenokarcinoma pluća i raka gušterače. Direktno CD4+ T ćelijsko prepoznavanje ćelijskih linija melanoma koje eksprimiraju MHC-II prirodno ili nakon CIITA transdukcije prijavljeno je u 2 studije (30, 31). Međutim, u obje ove studije, značajan dio testiranih TCR-a nije direktno prepoznao tumorske stanice. Nejasno je da li ovi TCR-ovi predstavljaju klonotipove "namjernika" koji ne prepoznaju tumorske antigene ili tumor-specifične TCR-ove koji nisu u stanju prepoznati svoj srodni antigen zbog nedostataka u prezentaciji antigena kao što su oni istaknuti u ovoj studiji. Oliveira et al. (31) su pokazali da je direktno prepoznavanje od strane CD4+ T ćelija ograničeno na 2 melanoma sa ekstremno visokim mutacijskim opterećenjem tumora, što sugerira da ovaj fenotip može dati dodatne neophodne promjene koje omogućavaju MHC-II prezentaciju tumorskih antigena. Iako pričvršćivanje MITD-a na imunogeni fragment KRASG12V nije rezultiralo direktnim prepoznavanjem tumorskih ćelija od strane CD4+ T ćelija, studije su opisali pristrasnost za endogene peptide izvedene iz proteina vezanih za membranu eluiranih iz MHC-II, vjerovatno zbog reciklaže membrane (26, 32). Antigen melanoma Trp1 postoji u plazma membrani, što može olakšati direktnu prezentaciju CD4+ T ćelijama tumorskih ćelija B16 (33). Drugi antigen povezan sa melanomom, gp100, predstavlja tumorske ćelije CD4+ T ćelijama na način koji zavisi od transmembranskog domena gp100 (34). U nedavnom radu koji istražuje ulogu neoantigen-specifičnih CD4+ T ćelija u modelu mišjeg sarkoma, epitopi izvedeni iz mutirane integrinske podjedinice, također proteina vezanog za membranu, eluirani su iz MHC-II na CIITA-transduciranom tumoru ćelije (35). Naši rezultati sugeriraju da iako se proteini vezani za membranu mogu preferencijalno prenijeti na endosome za direktnu prezentaciju na MHC-II, samo prisustvo imunogenog membranskog proteina nije dovoljno da promovira ovu prezentaciju. Opisani su i drugi neklasični putevi prezentacije koji mogu omogućiti pristup citosolnim ili nuklearnim proteinima MHC-II, uključujući prezentaciju intracelularnih proteina povezanu s autofagijom i transporter povezan s preradom antigena zavisnu od prezentacije CD4+ T stanicama, pri čemu je antigen peptidi se vjerovatno prenose sa MHC-I na MHC-II tokom membranskog recikliranja (36, 37). Prijavljeno je direktno MHC-II-ovisno prepoznavanje autolognih tumorskih ćelija od strane CD4+ T ćelija specifičnih za epitope E7 (38, 39); međutim, ove studije su se odnosile na proteine ​​E7 eksprimirane manje rasprostranjenim onkogenim HPV podtipovima (naime, HPV-33 i HPV-59) predstavljenim ćelijama raka grlića materice na HLA-DR molekulima. Stoga je moguće da podtip HPV-a, histologija tumora i restriktivni HLA aleli također mogu biti relevantni faktori u diferencijalnoj prezentaciji nuklearnih HPV antigena na MHC-II+ tumorskim stanicama. Iako naši podaci sugeriraju da direktna tumorska citotoksičnost nije vjerovatni mehanizam E6- i KRASG12V-specifičnih CD4+ T ćelija, opisani su i drugi antitumorski mehanizmi CD4+ T ćelija, i adaptivni transfer tumor-specifičnih CD4+ T ćelija kod pacijenata sa karcinomom pokazao je antitumorsku aktivnost (7, 40, 41). Stoga, MHC-II-restriktirani TCR-ovi kao što su oni identificirani u ovoj studiji mogu biti korisni za ACT kod ljudskih pacijenata, s obzirom na to da takvi TCR-ovi ciljaju epitope izvedene iz onkoproteina vozača ograničenih na HLA haplotipove procijenjenih na 1,27% i 16,10% američkih bijelih populaciju, respektivno, za HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 i HLA-DRB5*01:01 (42). Značajno je da CD4+ T ćelije pomažu u formiranju tumor-specifičnih CD8+ T ćelija tako što licenciraju DC-ove koji nose antigen na način zavisan od CD40L (43–45). Pokazali smo da KRASG12V-specifičan TCR identificiran u ovoj studiji prepoznaje ukrštene antigene u kontekstu DC-a, što sugerira da bi ove stanice mogle doprinijeti antitumorskom imunitetu putem ove funkcije. CD{100}} T ćelije također mogu pružiti lokalnu pomoć za CD8+ T ćelije unutar tumora tako što luče citokine kao što su IL-2 i IFN-, podržavajući preživljavanje CD8+ T stanica i regrutovanje tumora (46). Osim toga, CD{106}} TIL-ovi mogu prepoznati antigene u mikrookruženju tumora na mijeloidnim ćelijama kao što su makrofagi. Zaista, pretkliničke studije su pokazale da u odsustvu MHC-II na tumorskim ćelijama, usvojeno prenesene Trp1 CD4+ T ćelije i dalje mogu ispoljiti antitumorski imunitet ovisan o IFN-u i korelirati sa povećanom citotoksičnom aktivnošću makrofaga (47). Međutim, čini se da ova pojava ovisi o sekreciji tumorskog antigena, za koju bismo također spekulirali da je minimalna u slučaju većine onkogena. Sve u svemu, naša studija naglašava selektivnost direktne prezentacije endogenih antigena od strane MHC-II+ tumorskih ćelija i pokazuje da ni ekspresija CIITA ni prisustvo antigena vezanog za membranu nisu dovoljni sami da promovišu direktno prepoznavanje tumorskih ćelija od strane CD-a{{115} } T ćelije. Potrebno je više studija da bi se okarakterisalo koji antigeni mogu biti direktno predstavljeni MHC-II+ tumorskim ćelijama pod kojim uslovima da bi se u potpunosti razumele kontekst zavisne uloge CD4+ T ćelija u raku.

cistanche biljka koja povećava imuni sistem

Metode

Ćelijska kultura. TIL su sakupljeni i kultivisani kao što je prethodno opisano (48). Ukratko, primarno tumorsko tkivo je secirano na fragmente od 2-3 mm, koji su stavljeni u 24-ploču i kultivisani u RPMI-1640 dopunjenom sa 1{{102}}% ljudski AB serum, penicilin-streptomicin, HEPES, gentamicin i 6,000 IU/mL IL-2. Ekstravazirani TIL su kultivisani zamjenom pola medija svaka 2-3 dana. Primarne ljudske T ćelije iz periferne krvi uzgajane su u mediju 50:50 koji se sastoji od 50% AIM V plus 50% RPMI-1640 sa dodatkom 10% humanog AB seruma, penicilin-streptomicina (100 U/ mL svaki; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/mL IL-2, 5 ng/mL IL-7 i 5 ng/mL IL-15. Tumorske ćelijske linije dobivene od pacijenata su generirane i kultivirane kao što je prethodno opisano (17). Ukratko, primarno tumorsko tkivo je izrezano na fragmente manje od 2 mm i razdvojeno pomoću GentleMACS Octo Dissociatora (Miltenyi Biotec). Tumorske ćelije su resuspendirane u F-mediji koji sadrži 5 μM inhibitora Rho kinaze i postavljene na sloj ozračenih 3T3 fibroblasta (30 Gy). Nakon inicijalne kulture, tumorske ćelije su propagirane u 3:1 mješavini ozračenog 3T3-kondicioniranog medija i F-medija koji sadrži 5 μM inhibitora Rho kinaze. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L i B-LCL su održavani u RPMI mediju dopunjenom l-glutaminom i HEPES-om ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10% FBS, 1 mM natrijev piruvat (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM neesencijalne aminokiseline (Gibco, Thermo Fisher Scientific) i penicilin/streptucin-10 mL svaki; Gibco). Održavali smo 293GP (ATCC) u DMEM medijum suplementu sa 10% FBS i penicilin-streptomicinom (100 U/mL svaki; Gibco, Thermo Fisher Scientific). IHW03304, GM3107, KAS011, D8 i D66 ćelije su pokloni Alessandra Settea (La Jolla Institut za imunologiju). ELISPOT testovi. TIL ili PBMC su postavljeni na 100,000 ćelija po jažici u ELISPOT pločama obloženim antiIFN-Abs (1-D1K, Mabtech). Ćelije su restimulirane sa HPV-16 E6 i E7 PepMix (JPT) peptidnim skupovima, peptidnim skupovima koji predstavljaju odabrane onkogene mutacije, ili indiciranim pojedinačnim peptidima na 5 ug/mL za grupe ili 10 ug/mL za peptide 22 sata prije razvoja ELISPOT ploče prema uputama proizvođača (Mabtech). Za pozitivnu kontrolu korišteno je 5 ug/mL fitohemaglutinina-L. Ex vivo kultura ekspanzije. PBMC su obložene peptidnim pulom koji predstavlja odabrane onkogene mutacije pri 5 ug/mL. Svježi medij koji je sadržavao 10 IU/mL IL-2 je dodan 4., 7. i 10. dana. 14. dana, PBMC su restimulirani za upotrebu u ELISPOT ili testovima sekrecije citokina. TCR sekvenciranje. TIL ili PBMC su restimulirani sa 5 ug/mL HPV-16 E6 PepMix (JPT) ili KRASG12V peptidom, a ćelije koje luče IFN su fluorescentno označene korištenjem kompleta za analizu sekrecije humanog IFN prema uputama proizvođača (Miltenyi Biotec) . Pojedinačne IFN- + ćelije su sortirane u ploču 96-jažica korištenjem FACSAria (BD Biosciences) i RNA-Seq je izveden korištenjem Illumina Miseq za identifikaciju uparenih TCR i lanaca. Za identifikaciju E6-specifičnog CD4+ TCR klona, ​​ćelije koje luče IFN su sortirane kao gore, a TCR i TCR sekvence su amplificirane ugniježđenim, multipleksiranim PCR-om, kao što je prethodno opisano (49). PCR proizvodi su predati na Sanger sekvenciranje (ETON Biosciences). Za analizu frekvencije TCR, PBMC-ovi prije i nakon 14- dana ex vivo ekspanzije sa naznačenim peptidima su poslani u Adaptive Biotechnologies. Analiza ekspresije HPV-a. RNK je izolovana iz Hu-56 primarnih tumorskih ćelija i tumorske ćelijske linije i podnesena za masovnu RNA-Seq. Čitanja sekvencioniranja uparenih krajeva su mapirana korištenjem BWA (v0.7.12) (50) na HPV kompletan genom (GenBank pristupni broj NC_001526.2) i njegov odgovarajući transkriptom. Rezultirajuća datoteka mape poravnanja sekvenci je konvertirana u sortiranu binarnu mapu poravnanja i indeksirana, nakon čega je uslijedilo brojanje mapiranih čitanja pomoću SAMtools-a (v1.2) (50). Sekvenciranje cijelog egzoma. Sekvenciranje cijelog egzoma i RNA-Seq obavljeni su na La Jolla institutu za imunološku sekvencu koristeći Agilent komplete za hvatanje cijelog egzoma i Illumina komplete, respektivno. FFPE biouzorke je distribuirao Moores Cancer Center Tempus-u za sekvenciranje sljedeće generacije zajedno sa usklađenom referentnom DNK koristeći uzorke periferne krvi. Čitanja sekvence iz sekvenciranja egzoma tumora i normalnih uzoraka su poravnati sa referentnim genomom GRCh38 pomoću SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Varijante egzoma su identifikovane pomoću SpeedSeq Somatica, a varijante su označene korišćenjem SNPeff (v4.3i) (52). Podaci o sekvenciranju RNA-Seq i cijelog egzoma za ovaj rukopis su postavljeni na NCBI BioProject, pristupni broj PRJNA924789. Retrovirusna transdukcija T ćelija. TCR nukleotidne sekvence su sintetizirane i klonirane u okosnici MSGV1 retrovirusa korištenjem BioXP 3200 (Codex). Slijed je kodon optimiziran za ekspresiju u ljudskim stanicama. Humani TCR konstantni regioni su zamenjeni za mišje TCR konstantne regione sa supstitucijama da bi se poboljšala ekspresija na površini i promovisalo preferencijalno uparivanje (53, 54). Ljudski PBMC su izolovani iz puzavih kaputa. CD{131}} ili CD8+ T ćelije su uklonjene magnetskom selekcijom, a negativna frakcija koja sadrži sve preostale limfocite kultivisana je u medijumu T ćelija sa 50 ng/mL anti-CD3 Ab (OKT3) tokom 2 dana.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

TCR retrovirusni supernatanti su generisani kotransfekcijom 293GP ćelija sa MSGV1 vektorom koji sadrži relevantnu TCR sekvencu i RD113 plazmid. Dva dana nakon transfekcije, retrovirusni supernatanti su sakupljeni i korišteni svježi ili zamrznuti na -80 stepeni. Transdukcije su izvedene na pločama obloženim RetroNectin (Takara), kao što je prethodno opisano (5). Ekspresija konstantnog regiona TCR miša je procenjena protočnom citometrijom da bi se odredila efikasnost transdukcije. T-ćelije dizajnirane s TCR-om korištene su ne prije 7 dana nakon početne stimulacije. Funkcionalni testovi T ćelija. Kokultivirali smo 5 × 104 TIL, transducirane T ćelije ili J76 Jurkat ćelije sa 1 × 105 B-LCLs pulsiranih preko noći sa naznačenim koncentracijama peptida ili 5 × 103 tumorskih ćelija zasijanih prethodnog dana u {{16} }ploče sa U-dnom ili ravnim dnom. Tamo gdje je indicirano, anti-CD28 agonisti (klon CD28.2, BioLegend) ili anti-PD-L1 blokirajući (klon 29E.2A3, BioLegend) Abs su dodani u kokulture T ćelija i tumorskih ćelija u količini od 5 i 10 ug/mL, respektivno. Za testove citokina i aktivacijskih markera, 1× Cell Activation Cocktail (BioLegend) koji sadrži PMA i jonomicin je korišten kao pozitivna kontrola. Za studije blokiranja HLA, 20 ug/mL sljedećih Abs dodano je B-LCL-ovima koji pulsiraju peptidima najmanje 2 sata prije dodavanja T ćelija: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend) ili kontrola izotipa mišjeg IgG2a (MOPC-173, BioLegend). Gdje je indicirano, tumorske ćelije su kultivirane 72 sata sa 10 ng/mL rekombinantnog IFN-a prije dodavanja T ćelija. Supernatanti su sakupljeni nakon 18-24 sata, IFN- je mjeren ELISA (Thermo Fisher Scientific), a ćelijske pelete su obojene za protočnu citometriju. Ispitivanja citotoksičnosti izvedena su kokulturom T ćelija sa tumorskim ćelijama pri naznačenim omjerima efektor-cilja. Ukratko, 5 × 103 tumorskih ćelija je zasijano i kultivisano preko noći prije dodavanja T ćelija u naznačenim omjerima. Liza ciljne ćelije određena je pomoću xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), koji je procjenjivao električnu impedanciju zbog prianjanja ćelija svakih 30 minuta do kraja eksperimenta. Podaci su analizirani korištenjem xCELLigence RTCA softverskog paketa, a rezultati su prikazani kao ćelijski indeks normaliziran na 1 u vrijeme kada su dodane T ćelije. MHC-II test prezentacije. Sintetički DNK konstrukti koji kodiraju sljedeće su generirani i klonirani u MSGV1 korištenjem BioXP 3200 (Codex): N-terminalnih 25 aminokiselina ljudskog HLA-B gena, nakon čega slijedi prvih 50 aminokiselina HPV-16 E6 ili 25 aminokiselina KRASG12V spojenih na C-terminalnih 55 aminokiselina ljudskog HLA-B, T2A elementa koji se samocijepa, i kodirajuće sekvence EGFP-a. Virusni supernatanti su stvoreni kako je gore opisano, a autologni B-LCL su transducirani na pločama obloženim RetroNectin nakon stimulacije preko noći na sloju ozračenih (0,5 Gy) 3T3 ćelija koje eksprimiraju humani CD40L (3T3-CD40L). Efikasnost transdukcije je procenjena protočnom citometrijskom kvantifikacijom ekspresije EGFP. Transducirani B-LCL su stimulirani sa 3T3-CD40L u prisustvu 200 IU/mL rekombinantnog humanog IL-4 (PeproTech) tokom 2 uzastopna kruga od 2-3 dana prije kokulture sa autolognim TIL-ima. Generisanje DC-a za testove prezentacije antigena. DC-ovi su generirani metodom plastične adherencije. Zamrznuti PBMC su odmrznuti i postavljeni u DC medijum (RPMI-1640 dopunjen l-glutaminom, 5% toplotno inaktiviranim ljudskim AB serumom i 100 U/mL svaki penicilin-streptomicin) tokom 2 sata na 37 stepeni. Neadherentne ćelije su uklonjene ispiranjem toplim PBS-om, a adherentne ćelije su uzgajane u DC medijumu sa dodatkom 800 U/mL GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) i 500 U/mL IL-4 (PeproTech) tokom 6 dana . Dodali smo 1 ug/mL KRASG12V peptida ili 20 ug/mL KRASG12V ili WT KRAS proteina (Abcam) direktno u nezrele DC preko noći. Sljedećeg dana, DC su sakupljeni i kokultivirani sa TCR-proizvedenim T ćelijama u omjeru 1:1 preko noći prije nego što se procijeni povećanje regulacije CD137 protočnom citometrijom. Retrovirusna transdukcija tumorskih ćelija. Kodirajuća sekvenca humane CIITA je sintetizovana (Integrated DNK Technologies) i klonirana u MSGV1 od strane Gibson Assembly. Kodirajuće sekvence HLADRB5*01:01 i lanci razdvojeni P2A sekvencom su sintetizovani (Integrated DNK Technologies) i klonirani u modifikovani pHAGE lentivirusni vektor uzvodno od T2A sekvence praćen skraćenom CD34 reporterskom sekvencom od strane Gibson Assembly. Retrovirusni supernatanti su generisani sa MSGV1, kao što je gore opisano. Lentivirusni supernatanti su generisani kotransfekcijom 293T ćelija sa plazmidima pHAGE, tat, rev, gag/pol i vsv-g. Virusni supernatanti su sakupljeni 24 sata kasnije i koncentrirani centrifugiranjem u Amicon Ultra 5 epruvetama (MilliporeSigma). Tumorske ćelije su postavljene na pločice i, 1 dan kasnije, medij je zamijenjen retrovirusnim ili lentivirusnim supernatantom sa dodatkom 10 ug/mL polibrena. Četiri sata kasnije, supernatant koji je sadržavao virus je aspiriran i zamijenjen podlogom za kulturu. MHC-II+ i CD{126}} tumorske ćelije su sortirane pomoću FACS Fusion cell sortera (BD Biosciences). Protočna citometrija. Ćelije su obilježene fluorohrom-konjugiranim monoklonskim Abs na sljedeće antigene: anti-humani CD3–PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD-1 –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) i anti-miš TCR -APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Mrtve ćelije su obojene DAPI ili LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer je sastavio i označio NIH Tetramer Core Facility. Ćelije su obojene sa 1 ug/mL tetramera 1 sat na ledu. Ab bojenje za površinske antigene izvedeno je 15 minuta na ledu. Za intracelularno bojenje citokina (ICS), T ćelije su kultivisane sa APC pulsiranim peptidima 4-6 sati u prisustvu Brefeldina A. Ćelije su permeabilizovane i obojene na intracelularne citokine sa Cytofix/Cytoperm kompletom (BD Biosciences) nakon površinskog bojenja , prema uputama proizvođača. Za bojenje citokina korišteni su sljedeći fluorohrom-konjugirani Abs: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2–FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) i Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Podaci su prikupljeni FACSCelesta protočnim citometrom (BD Biosciences) i analizirani softverom FlowJo v10.7. Statistika. Statističke analize su rađene sa Prism 8 (GraphPad Software). Za ICS poređenja, korišten je neupareni 2-repi t-test. Za poređenje HLA blokiranja Ab-Ab posredovane supresije signalizacije T ćelija, korišten je 2-način ANOVA. P < 0,05 se smatra statistički značajnim. Odobrenje studije. Deidentifikovani ljudski uzorci korišćeni u ovoj studiji dobijeni su uz informirani pristanak putem UCSD IRB protokola 101391CX, "Fenotipizacija okruženja tumora i izolacija ćelija". Pismeni informirani pristanak dali su pojedinci u studiji.

Reference

1. Hanahan D, Weinberg RA. Obilježja raka: sljedeća generacija. Cell. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, et al. Imunitet tumora i imunoterapija za karcinome povezane s HPV-om. Cancer Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, et al. Vodeći pregled RAS proteina i njihovih regulatora u ljudskim bolestima. Cell. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Neočekivano veliki poliklonalni repertoar HPV-specifičnih T ćelija spreman je za djelovanje kod pacijenata s rakom grlića materice. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, i dr. Pejzaž imunogenih tumorskih antigena u uspješnoj imunoterapiji virusno induciranog epitelnog karcinoma. Nauka. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, et al. Profilisanje HPV-16-specifičnih T-ćelijskih odgovora otkriva široku reaktivnost antigena kod pacijenata sa karcinomom orofaringeusa. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. BRAF V600E-specifične CD4 + T ćelije koje infiltriraju tumor u korelaciji sa potpunim kliničkim odgovorom kod melanoma. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, et al. Endogene CD4+ T ćelije prepoznaju neoantigene kod pacijenata sa karcinomom pluća, uključujući rekurentne onkogene mutacije KRAS i ERBB2 (Her2). Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, et al. Memorijske T stanice koje ciljaju na onkogene mutacije otkrivene u perifernoj krvi pacijenata s epitelnim karcinomom. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, et al. Terapija transferom T-ćelija usmjerena na mutantni KRAS kod raka. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM, et al. Ciljanje HPV-16+ epitelnih ćelija karcinoma T-ćelija TCR genskim inženjeringom usmjerenih protiv E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, et al. Konstruirane T ćelije koje ciljaju E7 posreduju u regresiji karcinoma humanog papiloma virusa u mišjem modelu. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.

13. Bear AS, et al. Biohemijska i funkcionalna karakterizacija mutantnih KRAS epitopa potvrđuje ovaj onkoprotein za imunološko ciljanje. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY, et al. Intratumoralne CD4+ T ćelije posreduju u antitumorskoj citotoksičnosti kod raka mokraćne bešike kod ljudi. Cell. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, et al. Citolitičke CD4 T ćelije specifične za tumor posreduju u zaštitnom imunitetu protiv raka kod ljudi. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, et al. Genska terapija receptora T-ćelija za epitelne karcinome povezane s humanim papiloma virusom: prva studija na ljudima, faza I/II. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X, et al. Uslovno reprogramiranje i dugotrajna ekspanzija normalnih i tumorskih ćelija iz ljudskih biouzoraka. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, et al. Neoantigen-specifične CD4+ T ćelije u ljudskom melanomu imaju različita stanja diferencijacije i koreliraju sa CD8+ T ćelijama, makrofagom i funkcijom B ćelija. Cancer Cell. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ, et al. Molekularni potpisi antitumorskih neoantigen-reaktivnih T ćelija iz metastatskih ljudskih karcinoma. Nauka. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, et al. Povećana efikasnost prezentacije antigena spajanjem antigena sa signalima trgovine MHC klase I. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, et al. Mutacije povezane sa stečenom rezistencijom na blokadu PD-1 kod melanoma. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, et al. Prepoznavanje neoantigena humanog gastrointestinalnog karcinoma cirkulirajućim PD-1+ limfocitima. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: online katalog ćelijskih linija raka koji integrira HLA tip, predviđene neoepitope, virus i ekspresiju gena. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, pronalazači; BioNTech US Inc., ovlaštenik. Konstrukti receptora T ćelija i njihova upotreba. US patent br. US202103040215A1. 4. novembra 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Različite funkcije PD1 inhibitornog puta. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG, et al. Definiranje obrade HLA-II liganda i pravila vezanja pomoću masene spektrometrije poboljšava predviđanje epitopa raka. Imunitet. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, et al. K-ras4B i prenilirani proteini kojima nedostaju "drugi signali" dinamički se povezuju sa ćelijskim membranama. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. Transaktivator klase II reguliše ekspresiju više gena uključenih u prezentaciju antigena. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ, et al. MHC proteini daju diferencijalnu osjetljivost na blokadu CTLA-4 i PD-1 kod neliječenog metastatskog melanoma. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. Ljudske CD4+ regulatorne T ćelije koje infiltriraju tumor pokazuju poseban TCR repertoar i pokazuju tumorsku i neoantigensku reaktivnost. Sci Immunol. 2019;4(31):eaao4310.

31. Oliveira G, et al. Pejzaž pomoćnih i regulatornih antitumorskih CD{1}} T ćelija u melanomu. Priroda. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL, et al. Predstavite se! Po molekulima MHC klase I i MHC klase II. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, et al. Protein melanosomske membrane je meta na površini ćelije za terapiju melanoma. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomalne ciljane sekvence od gp100 su esencijalne za prezentaciju endogenog epitopa ograničenog na MHC klase II i mobilizaciju u endosomalne kompartmente. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, et al. MHC-II neoantigeni oblikuju tumorski imunitet i odgovor na imunoterapiju. Priroda. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J, et al. Autofagija promoviše MHC klase II prezentaciju peptida iz intracelularnog izvora proteina. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. Neklasični putevi obrade antigena su potrebni za direktno prepoznavanje tumora ograničeno na MHC klase II od strane NY-ESO-1- specifičnih CD4+ T ćelija. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, et al. CD4+ limfociti koji infiltriraju tumor kod raka grlića materice prepoznaju HLA-DR-restriktirane peptide koje obezbjeđuje humani papiloma virus-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, et al. Peptidi humanog papiloma virusa tipa 33 E7 predstavljeni od strane HLA-DR*0402 T ćelijama koje infiltriraju tumor kod raka grlića materice. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC, et al. Liječenje pacijenata sa metastatskim karcinomom korištenjem glavnog kompleksa histokompatibilnosti ograničenog T-ćelijskog receptora klase II koji cilja na antigen zametne linije raka MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E, et al. Imunoterapija raka zasnovana na CD4+ T ćelijama specifičnim za mutaciju kod pacijenata sa epitelnim karcinomom. Nauka. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Neto baza podataka alela (AFND) 2020. ažuriranje: klasifikacija podataka po zlatnom standardu, podaci o genotipovima otvorenog pristupa i novi alati za upite. Nukleinske kiseline Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. Pomoć T-ćelija za citotoksične T limfocite je posredovana CD40-CD40L interakcijama. Priroda. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, et al. CD4+ T ćelije pomažu u stvaranju citotoksičnog efektorskog programa T ćelija uključujući smanjenje kohibitornih receptora i povećanu invazivnost tkiva. Imunitet. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, et al. cDC1 prime i licencirani su od strane CD4+ T ćelija da indukuju antitumorski imunitet. Priroda. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. Pomoć CD4+ T-ćelija u tumorskom miljeu je potrebna za regrutaciju i citolitičku funkciju CD8+ T limfocita. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW, et al. CD4+ T ćelija – posredovano odbacivanje tumorskih ćelija pozitivnih na MHC klase II zavisi od sekrecije antigena i indirektne prezentacije na APC domaćinima. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, et al. Generisanje kultura limfocita koje se infiltriraju tumorom za upotrebu u adaptivnoj transfer terapiji za pacijente s melanomom. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, et al. Jednoćelijska analiza repertoara T-ćelijskih receptora. Metode Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, et al. Poravnanje sekvence/format karte i SAM alati. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, et al. SpeedSeq: ultra-brza analiza i interpretacija ličnog genoma. Nat Methods. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, et al. Program za označavanje i predviđanje efekata polimorfizama pojedinačnih nukleotida, SnpEff: SNP u genomu Drosophila melanogaster soja w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. Ugradnja transmembranskih hidrofobnih mutacija u TCR povećava njegovu površinsku ekspresiju i funkcionalnu avidnost T ćelija. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ, et al. Povećana antitumorska aktivnost T ćelija dizajniranih da eksprimiraju T-ćelijske receptore s drugom disulfidnom vezom. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.