Tubuloside B iz Cistanche Salse spašava PC12 neuronske ćelije od 1-Metil-4-fenilpiridinijum-indukovane jonima apoptoze i oksidativnog stresa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

sažetak:

Neuroprotektivniefekti tubulozida B iz cistanche, jedan od feniletanoida izolovanih od Kinezabiljni lijek Cistanche salsa, na 1-metil-4-fenilpiridinijum jonima (MPP plus ) indukovana apoptoza i oksidativni stres u PC12 neuronskim ćelijama. PC12 ćelije tretirane MPP ＋ su podvrgnute apoptotičkoj smrti kao što je određeno MTF testom, protočnom citometrijom i elektroforezom DNK agaroznog gela; intracelularna akumulacija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) mjerena je DCFH-DA bojenjem uz pomoć laserske skenirajuće konfokalne mikroskopije (LSCM). Istovremeni tretman sa tuhulozidom B značajno je oslabio MPP＋ -indukovanu citotoksičnost, fragmentaciju DNK i intracelularnu akumulaciju ROS. Ovi rezultati snažno ukazuju da tubulozid B sprječava apoptozu i oksidativni stres izazvanu MPP-om. Tubulozid B se može primijeniti kao lijekprotiv Parkinsonove bolestiagenti.

Uvod

Patološki, sporadičnu Parkinsonovu bolest (PD) obično karakteriše gubitak kateholaminergičkih neurona, posebno dopaminergičkih neurona supstancije nigra pars compacta (SNc), i prisustvo karakterističnih intraneurona| inkluzije zvane Lewyjeva tijela u zahvaćenim regijama mozga. Unatoč raznim faktorima koji su uključeni u patogenezu PD, mehanizmi uključeni u inicijaciju i progresiju PD ostaju neizvjesni, iako je i dalje odgovoreno na uzrok PD, nekoliko linija dokaza snažno sugerira uključenost oksidativnog stresa, što je konačno vodeći do smrti neurona ili apoptoze prekomjernim stvaranjem slobodnih radikala [1], [2], [3]. Činjenica da nigralni dopaminergički sistem može proizvesti visoke nivoe slobodnih radikala i da ima relativno nizak nivo antioksidativnog odbrambenog sistema dodatno podržava ovu hipotezu. I in vivo i in vitro studije su pokazale neurotoksičnost MPP＋ posredovanu oksidativnim stresom, aktivnog metabolita l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) na dopaminergičke neurone [4 ], [5]. Učešće slobodnih radikala prekomjerno proizvedenih oksidativnim stresom kao neposrednog uzroka neurodegenerativnih poremećaja kao što je PD sugerira ključnu ulogu antioksidansa. Tubulozid B (slika l) bio je jedno od feniletanoidnih jedinjenja izolovanih iz stabljikeCistanche salsa. Prethodne studije su otkrile da su mnogi feniletanoidi, uključujući tubulozid B, pokazali jaku aktivnost uklanjanja slobodnih radikala[6], [7].

Uzimajući u obzir ove nalaze, istražili smo u ovoj studiji učinak tubu]nzida B na neurotoksičnost izazvanu MPP plus in vitro, koristeći ćelijsku liniju feohromocitoma simpatičkog živca PC12 koja se godinama uspješno koristi za proučavanje neuronske funkcije [8], [9].

protiv Parkinsonove bolesti:cistanche

Materijali i metode

Materijali

Tubulozid B izCistanche salsaLi Lei (Odsjek za prirodne proizvode, Fakultet farmaceutskih nauka, Univerzitet u Pekingu, Peking, Kina). Čistoća jedinjenja bila je više od 98 procenata prema HPLC analizi. Dulbeccov modifikovani orlov medijum (DMEM), konjski serum i fetalni teleći serum kupljeni su od GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridinijum jon (MPP plus ), poli-L-lizin, 3-(4, 5 -dimetiltiazol-2 -il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid (MTT), propidijum jodid (PI), RNKaza A, proteinaza K i 2;7'-dihlorofluorescein diacetat (DCFH-DA) kupljeni su od Sigme.

Ćelijska kultura

PCI2 ćelije su održavane u DMEM sa dodatkom 10 posto konjskog seruma, 5 posto fetalnog telećeg seruma, 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina. Ćelije su uzgajane u vlažnom inkubatoru sa 95 posto zraka i 5 posto CO2 na 37 stepeni. Svi eksperimenti su izvedeni 24-48 h nakon što su ćelije zasijane. Ćelije su rutinski sakupljene tripsinizacijom od 0,25 posto kada su se ćelije približile subkonfluentnom stadiju i stavljene u boce kulture od 25 cm podijeljene u omjeru 1:8.

Analiza vitalnosti ćelija

Vijabilnost ćelija je određena korišćenjem modifikovanog MTT testa kao što je prethodno opisano [10], Ukratko, PC12 ćelije su posađene u 96-ploče sa gustinom od I × 104 ćelije po jažici. Kulture su uzgajane 48 h, a zatim je medij promijenjen u onaj koji sadrži različite koncentracije tubulnsida B ili MPP＋. Nakon inkubacije do 48 h i 72 h, MTr rastvor (5 mg/ml u DMEM) je dodat u 96- ploče sa bunarima i ćelije su ostavljene da se inkubiraju 4 h na 37 stepeni. Nakon što je medij uklonjen, kristali ćelije i boje su solubilizirani dodavanjem 200 μL DMSO, a apsorpcija je izmjerena na 570 nm (540 nm kao referenca) pomoću čitača mikroploča modela 550 (Bio-Rad). Vijabilnost ćelija je takođe analizirana metodom isključenja tripan plavog. Ćelije su sakupljene, lagano peletirane i obojene 0,6 postotnim rastvorom tripan plavog za 3 kiše. Procenat neobojenih ćelija je naknadno procenjen u deset nasumično odabranih polja mikroskopa. Kao pozitivan lijek korišteno je 100 ng／ml epidermalnog faktora rasta (EGF).

Detekcija apoptoze protočnom citometrijom

Apoptotične ćelije su detektovane protočnom citometrijom upotrebom propidijum jodida (PI) [11]. Ukratko, oko 1 × 106 ćelija inkubiranih sa ispitivanim supstancama sakupljeno je centrifugiranjem i jednom isprano PBS. Ćelije su fiksirane sa 70 posto etanola tokom 24 h na - 20 stepeni i jednom isprane sa PBS. Ćelije su zatim resuspendirane u 300 μL PBS-a koji je sadržavao 0,5 mg/ml RNKaze i 0,5 mg/ml PI. Nakon dalje inkubacije od 30 minuta u mraku, izvršena je protočna citometrija sa FACScan-om (Becton Dickinson, Heidelberg, Njemačka).

Primijenili smo Mooreov protokol [12] koji je izolirao samo fragmentiranu DNK i eksperimenti su normalizirani korištenjem jednakog broja kultura iz svake test grupe. Ukratko, 3 × 106 neurona iz svakog od tretiranih uzoraka isprano je u Hankovom balansiranom rastvoru soli (1000g tokom 10 min), a pelete formirane na dnu epruvete su homogenizovane sa 1 ml pufera za lizu (10 mM Tris pri pH 7,4. 5 mM EDTA, 1 posto Triton X-100) 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 11,000 g za 20 kiše na 4 stepena, supernatanti koji sadrže fragmentiranu DNK su uklonjeni i digestirani sa 20 mg/ml RNase A na 37 stepeni tokom 1 h i 0,1 mg/ml proteinaze K na 56 stepeni za dodatnih 1 h. Fragmentirana DNK je ekstrahirana fenolom i hloroformom i centrifugirana na 10,000g za 1 kišu na 4 C. Vodena faza je prebačena u novu Eppendorfovu epruvetu, pomiješana sa 2 zapremine ledeno hladnog etanola, a zatim postavljen na -20 stepen najmanje 1 h da se istaloži DNK. Nakon centrifugiranja na 15,000g 20 minuta na 4 stepena, supernatanti su uklonjeni, a DNK pelete su jednom isprane sa 80 posto etanola (15.000 g 15 min na 4 stepena), osušene na zraku i rastvorene u 20 μL TE pufer na pH 7,6. Cijeli uzorak je zatim podvrgnut elektroforezi na 1,5-postotnom agaroznom gelu u trajanju od 1 h na 85 V. Gel je ispitan i fotografiran pomoću Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, SAD).

Mjerenje intracelularnog formiranja ROS

Formiranje intracelularnih peroksida detektovano je konfokalnim skenirajućim laserskim mikroskopom koristeći nefluorescentno jedinjenje, 2"7"-diklorofluorescein diacetat (DCFH-DA) [13], koji je esterifikovan unutar ćelija endogenim esterazama do jonizovane slobodne kiseline, 2 ;7"-dihlorofluorescein. 2",7-Dihlorofiuorescin je sposoban da se oksidira u fluorescentni 2"7"-dihlorofluorescein (DCF) hidroantioksidansima. Ćelije su inkubirane sa 10 μM DCFH-DA 30 minuta na 37 stepeni. Kulture su dva puta isprane Hankovom izbalansiranom otopinom soli i snimljene u istom mediju. Snimanje je urađeno korišćenjem konfokalnog skenirajućeg laserskog mikroskopa, DCF je bio pobuđen na 488 nm, a emisioni filter je bio filter barijere od 510 nm. Da bi se obezbedilo validno poređenje, isti parametri akvizicije su korišćeni za sva posmatranja. Postavljena je optimalna vertikalna pozicija na sredini ćelija, a zatim je polje brzo skenirano. Budući da je osvjetljenje na talasnoj dužini ekscitacije od 488 nm izazvalo povećanu fluorescenciju zbog oksidacije ove boje, svako polje je bilo izloženo Svjetlu potpuno isto vrijeme. Polazne vrijednosti iz nestimuliranih ćelija korištene su kao kontrolne vrijednosti za poređenje sa ćelijama tretiranim MPP u prisustvu ili odsustvu tubulozida B. Nakon skeniranja, prosječni relativni intenzitet fluorescencije u 15-20 tijelima neuronskih ćelija po polju mikroskopa kvantificiran je u četiri odvojene kulture po uslovima tretmana.

cistanche

Statistička analiza

Sve dobijene vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ±SD. Statistička značajnost razlika između grupa određena je Studentovim t-testom; Izračunate p vrijednosti manje od 0.05 smatraju se statistički značajnim.

Rezultati

Kao što je prikazano na slici 2, MPP plus je proizveo smanjenje vitalnosti PCI2 ćelija zavisno od doze. Nasuprot tome, EGF, dobro poznati neurotrofni faktor, proizveo je značajnu zaštitu vitalnosti ćelije pri 100ng/mL MPP＋-inducirani citotoksični efekti također su oslabljeni u prisustvu tubulozida B (5, 10, 50 ili 100 ug-ml-1 ), iako sa manjom potentnošću od referentnog lijeka (Slika．3). Tubulozid B u ovim koncentracijama pokazao je citoprotektivne efekte na način ovisan o dozi i samo jedinjenje nije izazvalo nikakvu očiglednu citotoksičnost (podaci nisu prikazani). Gel elektroforeza DNK ekstrakta iz PCI 2 ćelija tretiranih sa 200 µM MPP plus tokom 48 sati pokazala je DNK ljestvicu. klasično obilježje apoptoze, tubulozid B, u dozama od 10 i 100 μ g·ml-1sprovedeno formiranje DNK ljestvice (Slika．4)．Slika．5 pokazuje tipične histograme protočne citometrijske analize apoptotske ćelijske smrti izazvane PCP12＋ u prisustvu ili odsustvu tubulozida B. Kvantifikacija profila ćelijskog ciklusa sa PI otkrila je broj ćelija sa subdiploidnim karakteristikama (M1 regija) što ukazuje na apoptotičku fragmentaciju DNK. U netretiranim ćelijama, apoptotička subdiploidna frakcija bila je minimalna do 5．94% od ukupno 10000 ćelija (Slika．5 A). Nakon 48 h izloženosti MPP＋, postotak apoptoze se povećao na 43．02;j;(Slika 5B)． Kada se doda u ćelijsku kulturu, tubulozid B inhibira MPP＋indukovanu apoptozu na način ovisan o dozi. U koncentraciji od 10 ug·ml-1zaštita tubulozida B nije bila statistički značajna, ali na 50 i 1 00ug·ml-1, 45% i 63% smanjenje. je uočeno što je rezultiralo povećanjem procenta ćelija preživljavanja (Slika．5D, E).

Akumulacija intracelularnog ROS-a može se otkriti upotrebom DCFH—DA．PC12 ćelija tretiranih sa 200 uM MPP＋ tokom 48 h pokazalo je intenzivnu fluorescenciju unutar ćelije nakon bojenja DCFH-DA bojom (Slika 6). Istovremeni tretman sa tubulozidom B (u dozama od 10 i 100 ug·ml) inhibirao je MPP＋一 indukovanu proizvodnju ROS (smanjeni procenat je bio 24．52％ odnosno 55．63％).

Diskusija

Patogeneza PD uključuje jak oksidativni stres, smanjen nivo antioksidansa i mitohondrijalne defekte. za sve je poznato da izazivaju apoptozu u nekoliko ćelijskih sistema. Konkretno, pokazalo se da slobodni radikali izazivaju aktivnu ćelijsku smrt u neuronima[14]. MPTP proizvodi ireverzibilan i ozbiljan sindrom sličan parkinsonovcu koji uzrokuje selektivnu degeneraciju nigrostriatalnih dopaminergičkih neurona kod ljudi. Ovaj neurotoksin je korišten za kreiranje životinjskih modela PD[15]．MPTP se pretvara pomoću monoamin oksidaze B u MPP＋, koji se akumulira u mitohondrijima. gdje inhibira mitohondrijski kompleks I i te mitohondrijske dane. funkcija uzrokuje apoptozu[16]. Stoga se neurotoksičnost izazvana MPP plus 一u dopaminergičkim neuronima intenzivno koristi kao etiološki model PD za skrining neuroprotektivnih agenasa.

U ovoj studiji, pokazali smo da je ćelijska smrt izazvana MPP plus putem oksidativnog stresa u PC12 ćelijama smanjena tubulozidom B. Nadalje, pokazali smo da je tubulozid B također zaštićen na način ovisan o dozi od MPP plus-induciranog DNK ljestvica. i apoptozu, mjereno korištenjem DNK gel elektroforeze i protočne citometrijske analize. Štaviše, istovremeni tretman sa višim koncentracijama tubulozida B inhibirao je proizvodnju ROS-a izazvanu MPP-om. Stoga je tubulozid B pokazao multifunkcionalno neuroprotektivno djelovanje. Nekoliko mehanizama, odvojeno ili zajedno, može biti uključeno u djelovanje tubulozida B. Antioksidativni učinak je mogući mehanizam za neuroprotekciju posredovanu tubulozidom B. Xiong Q je otkrio da tubulozid B pokazuje snažnu aktivnost uklanjanja slobodnih radikala na 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil radikal i ksantin]ksantin oksidazu generiran superoksid anjonski radikal [6].

Nedavno je objavljeno da nekoliko feniletanoida posjeduju svojstva uklanjanja slobodnih radikala i štite toksične ozljede izazvane oksidativnim stresom. ROS koje proizvodi MPP plus, kao što su vodikov peroksid, superoksidni anion i hidroksilni radikal, lako oštećuju biološke molekule, što u konačnici može dovesti do apoptotske ili nekrotične smrti stanice. Stoga, tubulozid B može imati direktne efekte uklanjanja ROS-a. Iako naši podaci ne utvrđuju tačno mjesto na kojem tubulozid B djeluje na suzbijanje akumulacije ROS-a, oni sugeriraju da neuroprotektivni mehanizam uključuje stimulaciju puteva antioksidansa. Studija molekularne strukture tubulozida B također ukazuje da on posjeduje moćan kapacitet za uklanjanje slobodnih radikala (osobna komunikacija).

Drugi mehanizmi bi takođe mogli biti relevantni. Na primjer, tubulozid B može imati sposobnost da se suprotstavi toksičnosti MPP＋ inhibicijom otvaranja prelaznih pora mitohondrijalne permeabilnosti i disfunkcije. Osim toga, treba uzeti u obzir i to da li tubulozid B ima direktan učinak koji potiče rast na neuronske stanice. Tačan mehanizam neuroprotektivnog djelovanja tubulozida B ostaje nejasan. Potrebne su dodatne studije da bi se razjasnila potpuna slika njegovog neuroprotektivnog efekta.

Konačno, tubulozid B iz ekstrakta salse Cistanche ima evidentne zaštitne efekte na apoptozu izazvanu MPP plus i oksidativni stres. Njegovi neuroprotektivni efekti protiv MPP ＋ toksičnosti mogu biti važni i sugeriraju da može imati terapeutski potencijal u prevenciji i liječenju PD.

liječenje PD: cistanche

Reference

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Inhibicija dušikovog oksida feniletanoidima u aktiviranim makrofagima. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Uspostavljanje noradrenergičke klonalne linije stanica feohromocitoma nadbubrežne žlijezde koje reagiraju na faktor rasta živaca. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Slobodni radikali i lipidna peroksidacija ne posreduju u smrti neurona izazvane amiloidom. Brain Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetička karakterizacija toksičnosti dušikovog oksida za PC12 ćelije: efekat vremena poluživota oslobađanja NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Brza i jednostavna metoda za mjerenje apoptoze timocita bojenjem propidijum jodidom i protočnom citometrijom. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Intracelularna infekcija bakterijom Leishmania do nova inhibira apoptozu makrofaga. J Immunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Osnovni FGF ublažava oksidativni stres izazvan amiloidnim peptidom, mitohondrijalnu disfunkciju i oštećenje aktivnosti Na ＋-K＋-ATPaze u neuronima hipokampusa. Brain Research 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Poremećaj mitohondrija kao rani događaj u procesu apoptoze izazvane deplecijom glutationa u neuronskim ćelijama: značaj za Parkinsonovu bolest. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Hronični parkinsonizam kod ljudi zbog produkta analogne sinteze meperidina. Science 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Studije o toksičnosti 1-meetil-4-fenilpiridinijum jona (MPP ＋) protiv mitohondrija mozga miša.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110