Interferencija feniletanoidnih glikozida iz Cistanche Tubulosa sa MTT testom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu i Yu-Qi Gao

sažetak:

MTT test, kao metoda skrininga, široko se koristi za mjerenje vitalnosti i proliferacije ćelija. Međutim, treba napomenuti da MTT test možda neće tačno odražavati efekatCistanche tubulosaetanolni ekstrakt o vitalnosti ćelija EA.hy926. Da bi se istražile i identificirale komponente odgovorne za kontradiktorna opažanja MTT testa, ehinakozid i akteozid, izolovana su dva glavna feniletanoidna glikozida iz etanolnog ekstrakta C. tubulosa. Podaci izvedeni iz CCK-8, Hoechst 33342 i aneksin V-FITC/PI testova sugeriraju da je kofeoil grupa prisutna u oba izolirana jedinjenja odgovorna za konfliktne rezultate MTT testa. Ovi podaci naglašavaju potrebu korištenja niza različitih metoda kako bi se odredio učinak medicinskih agenasa na vitalnost stanica kako bi se izbjeglo generiranje pogrešnih rezultata.

Ključne riječi: MTT test;feniletanoid glikozid; kafeinska kiselina; vitalnost ćelija; smetnje

Uvod

Parazitska biljkaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (porodica Orobanchaceae) je široko rasprostranjena u sjevernoafričkim, arapskim i azijskim zemljama [1]. Proističe izCistanche tubulosaiCistanche deserticolavažni su u tradicionalnoj kineskoj medicini, jer se koriste za liječenje impotencije, steriliteta, lumbaga i zatvora zbog inercije debelog crijeva [2]. Osim toga, pokazalo se da etanolni ekstrakt Cistanche tubulosa ima značajan zaštitni učinak protiv cerebralne hipoksije kod miševa [3].

Endotelne ćelije igraju ključnu ulogu u patogenezi hipoksične plućne hipertenzije. Endotelna ćelijska linija EA.hy926 je značajno slična primarnim endotelnim ćelijama. Tokom našeg sopstvenog proučavanja antihipoksičnog efektaCistanche tubulosaetanolni ekstrakt na endotelnoj ćeliji EA.hy926, primijetili smo da 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid (MTT) test, koji se obično koristi za procjenu vitalnosti ćelija u studijama citotoksičnosti i citostatičke aktivnosti, dao je oprečne rezultate pokazujući povećanu vitalnost EA.hy926 ćelija nakon tretmana.

Precizna procjena vitalnosti ćelije je od suštinskog značaja za identifikaciju potencijalnih citotoksičnih ili citoprotektivnih efekata medicinskog agensa. Stoga smo istražili koje komponente prisutne u etanolnom ekstraktu C. tubulosa mogu biti odgovorne za kontradiktorne rezultate uočene MTT testom. Izolirali smo dva glavna feniletanoidna glikozida (PhG) iz etanolnog ekstrakta C. tubulosa, ehinakozida (u daljem tekstu jedinjenje 1) i akteozida (u daljem tekstu jedinjenje 2), i odredili njihov učinak na vitalnost EA.hy926 ćelija koristeći različite metode. Osim toga, kako bismo dodatno razjasnili koji supstituent jedinjenja 1 i 2 može biti odgovoran za kontradiktorne rezultate, testirali smo njihove aglikone, kafeinsku kiselinu (u daljem tekstu jedinjenje 3) i 3,4-dihidroksilfeniletanol (u daljem tekstu jedinjenje 4), na održivost ćelija EA.hy926 koristeći iste metode.

Rezultati i diskusija

Identifikacija jedinjenja

Strukture dva jedinjenja izolovane iz etanolnog ekstrakta C. tubulosa identifikovane su analizama nuklearne magnetne rezonance (NMR) i masene spektrometrije (MS) i prikazane su na slici 1. Jedinjenje 1 je identifikovano kao ehinakozid u poređenju sa prethodno prijavljenim NMR (tabela 1) i MS (m/z 785 [M−H]−) podaci [4]. NMR spektri jedinjenja 2 bili su veoma slični onima jedinjenja 1, osim odsustva -D-glukopiranozil grupe (Tabela 1). Jedinjenje 2 (m/z 623 [M−H]−) je identifikovano kao akteozid [5]. Važno je da oba jedinjenja imaju isti aglikon, koji uključuje kafeinsku kiselinu (jedinjenje 3) i 3,4-dihidroksilfeniletanol (jedinjenje 4).

Testovi vitalnosti ćelija

MTT i CCK{{0}} testovi su korišteni za analizu efekta jedinjenja 1-4 na vitalnost EA.hy926 ćelija. MTT test je pokazao da se vitalnost ćelija EA.hy926 značajno povećala nakon tretmana sa 25 i 50 μM jedinjenjem 1, 2 ili 3 (166,3 posto i 174,1 posto za jedinjenje 1, 205,8 posto i 224,3 posto za jedinjenje 2, 164,8 procenata i 189,6 procenata za jedinjenje 3, respektivno; p < 0,05),="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnim="" ćelijama="" (slika="" 2a).="" nadalje,="" morfološkim="" pregledom="" ćelija="" utvrđeno="" je="" da="" tretman="" sa="" 50="" μm="" spoja="" 1,="" 2="" ili="" 3="" povećava="" formiranje="" ljubičastih="" kristala="" formazana,="" koji="" se="" smatraju="" direktnim="" pokazateljem="" udjela="" živih="" stanica="" (slika="" 3).="" suprotno="" tome,="" cck-8="" test="" je="" sugerirao="" da="" se="" vitalnost="" ćelija="" značajno="" smanjila="" nakon="" tretmana="" sa="" 12,5,="" 25="" i="" 50="" μm="" jedinjenjem="" 1,="" 2="" ili="" 3="" (75,5="" posto,="" 45,1="" posto="" i="" 43,7="" posto="" za="" jedinjenje="" 1,="" 85,5="" posto,="" 51,8="" procenata="" i="" 34,3="" procenata="" za="" jedinjenje="" 2,="" i="" 64,5="" procenata,="" 48,2="" procenata="" i="" 36,4="" procenata="" za="" jedinjenje="" 3,="" respektivno;="" p="">< 0,05),="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnim="" ćelijama="" (slika="" 2b).="" jedinjenje="" 4="" nije="" uticalo="" na="" vitalnost="" ćelija="" ni="" u="" mtt="" ni="" u="" cck-8="" testu.="" neslaganje="" između="" rezultata="" dobijenih="" sa="" dva="" testa="" sugeriše="" da="" jedan="" od="" dva="" testa="" možda="" neće="" tačno="" odražavati="" efekte="" jedinjenja="" 1="" i="" 2="" na="" vitalnost="" ćelija="">

Apoptosis Assessment by Hoechst Staining

Hoechst 33342 je ćelijsko propusna DNK mrlja koja se pobuđuje ultraljubičastim svjetlom i emituje plavu fluorescenciju na 460 do 490 nm. Kondenzirani hromatin apoptotičkih ćelija boje se svetlije od hromatina normalnih ćelija [6]. Dok su kontrolne ćelije pokazivale ravnomerno dispergovan hromatin, normalne organele i intaktne ćelijske membrane, ćelije inkubirane sa 50 μM jedinjenja 1, 2 ili 3 tokom 48 sati pokazale su tipično bojenje apoptotičkih ćelija (Slika 4A). Suprotno tome, izlaganje ćelija 50 μM spoja 4 nije povećalo broj apoptotičkih jezgara u poređenju sa kontrolnim tretmanom.

Protočna citometrijska analiza apoptotičkih ćelija

Aneksin V-FITC/PI test dvostrukog bojenja identifikuje apoptotičke ćelije putem vezivanja aneksina V-FITC visokog afiniteta za fosfatidilserin, koji se eksternalizuje u ćelijama koje prolaze kroz apoptozu [7]. U ovom testu, vijabilne ćelije se ne vezuju ni za aneksin V ni za PI i stoga nisu obojene (donji levi kvadrant), rane apoptotičke ćelije su obojene zeleno vezivanjem aneksina V-FITC (donji desni kvadrant), a kasne apoptotičke ćelije obojeni su u zeleno i crveno vezivanjem aneksina V-FITC za fosfatidilserin i PI za nekrotične ćelije, respektivno (gornji desni kvadrant). Kao što je prikazano na slici 4B, ćelije inkubirane sa 50 μM jedinjenja 1, 2 ili 3 tokom 48 sati, procenat apoptotičkih ćelija porastao je sa 3,74 procenata (kontrolne ćelije) na 10,32 procenata, 12,95 procenata i 11,30 procenata, respektivno. U poređenju sa kontrolnim ćelijama, jedinjenje 4 nije povećalo procenat apoptotičkih ćelija EA.hy926.

U skladu sa rezultatima dobijenim CCK-8 testom i Hoechst 33342 bojenjem, test protočne citometrije pokazao je da jedinjenja 1, 2 i 3 induciraju apoptozu u ćelijama EA.hy926. Sve u svemu, ova zapažanja sugerišu da povećanje vitalnosti ćelija EA.hy926 uočeno sa MTT testom nakon tretmana jedinjenjima 1-3 predstavlja lažno pozitivan rezultat.

Diskusija

Godine 1983. Mosmann je razvio kolorimetrijski MTT test mikroploče za mjerenje ćelijske proliferacije i citotoksičnosti [8]. Ovaj jednostavan test i njegove modifikacije danas se uveliko koriste u laboratorijama za ćelijsku biologiju širom svijeta. Studije frakcioniranja u stanicama sisara pokazale su da je smanjeni kofaktor piridin nukleotida, NADH, odgovoran za većinu smanjenja MTT. Ovo je potkrijepljeno studijama koje su koristile cijele ćelije [9]. Smanjenje MTT je stoga povezano s metabolički aktivnim stanicama i nije samo povezano s mitohondrijalnim disanjem, već i sa citoplazmom i nemitohondrijalnim membranama uključujući endosomski/lizozomski odjeljak i plazma membranu [10]. Neto pozitivni naboj na MTT molekulu je primarni faktor za njegovo ćelijsko preuzimanje putem potencijala plazma membrane.

Značajno je da MTT test povremeno možda neće tačno odražavati stvarni efekat koji testirano jedinjenje ima na određene ćelije. Međutim, hemijske strukture ili grupe koje mogu uzrokovati konfliktne rezultate u MTT testu nisu identificirane. Nedavne studije su pokazale da bi MTT test mogao potcijeniti antiproliferativni efekat (-)-epigalokatehin-3-galata, najzastupljenijeg polifenola u zelenom čaju [11]. U studijama koje koriste MTT test za otkrivanje kemosenzitivnosti tumora, hemoterapijski agensi protiv raka, kao što su epirubicin, paklitaksel, docetaksel i imatinib mezilat (Gleevec), pokazali su povećanu vitalnost ćelija [12,13]. Štaviše, brojne studije su izvijestile da bi određeni biljni ekstrakti i redoks aktivni polifenoli mogli ometati MTT test jer direktno smanjuju MTT tetrazolijevu sol u odsustvu ćelija [14].

Potreba za solubilizacijom kristala MTT formazana prije spektrofotometrijske analize u čitaču mikroploča i inherentna priroda reakcije krajnje tačke ograničavaju upotrebu MTT testa na određene primjene. To je dovelo do razvoja analoga tetrazolija u kojima su fenilni dijelovi bili ukrašeni negativno nabijenim sulfonatnim grupama, kao što je 2,3-bis-(2-metoksi-4-nitro- 5- sulfofenil)-2H-tetrazolijum-5-karboksamid (XTT), negativno nabijena unutrašnja so [15] i 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) -5-(3-karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum (MTS), slabo kisela unutrašnja so usko povezana sa MTT [16] . Ove modifikacije su rezultirale proizvodnjom formazanskih proizvoda rastvorljivih u medijumu kulture koji su eliminisali zahtev za korakom solubilizacije pre kvantifikacije. Shodno tome, kako je povećan negativni naboj ovih molekula smanjio njihovu sposobnost kretanja kroz ćelijske membrane [17], srednji akceptori elektrona (IEA), kao što je 1-metoksi-5-metil fenazinijum metil sulfat ({{25 }}metoksi PMS) bili su potrebni da bi se olakšala redukcija tetrazolne boje ili da bi se povećala brzina redukcije.

Nedavno je razvijena nova generacija tetrazolijumovih soli rastvorljivih u vodi, čiji je prototip WST-1 [18]. WST-1, negativno nabijena disulfonirana unutrašnja sol koja sadrži ostatak joda, stabilnija je od XTT i MTS u prisustvu 1-metoksi PMS-a, njegovog obaveznog IEA. Ovo je dovelo do marketinga WST-1/1-metoksi PMS-a kao praktičnog kompleta za proliferaciju ćelija sa jednim reagensom. Razvijeno je nekoliko drugih soli tetrazolija iz serije WST, od kojih je možda najkorisnija WST-8 [19]. Čini se da WST-8 ima vrlo slična svojstva ćelijske redukcije kao WST-1 i prodaje se nezavisno kao CCK-8 test. WST-8 je ćelijski nepropustan i stoga se reducira ekstracelularno, putem transporta elektrona od intracelularnog NADH do WST-8 preko plazma membrane posredovanog 1-metoksi PMS-om. Iako su redukcija MTT i WST-8/1-metoksi PMS-a vođena intracelularnim NADH, čini se da se izvor NADH razlikuje unutar ove dvije metode. Smanjenje WST-8/1-metoksi PMS-a više zavisi od malat/aspartatnog šatla koji povezuje ciklus mitohondrijalnih trikarboksilne kiseline-NADH sa ekstramitohondrijalnim prostorom [20].

U preliminarnim eksperimentima, potvrdili smo da spojevi 1, 2, 3 i 4 ne mogu direktno reducirati MTT tetrazolijevu sol (nije prikazano). U ovoj studiji, direktan uticaj samih jedinjenja sa reagensom je eliminisan pažljivim pranjem mikroploča sa fosfatnim puferom (PBS) pre dodavanja MTT ili CCK-8 rastvora, kako je navedeno u protokolima proizvođača. Ipak, rezultati dobijeni korištenjem ove dvije metode su i dalje kontradiktorni (slika 2). Kao što se i očekivalo, inkubacija ćelija sa jedinjenjima 1, 2 i 3 povećala je redukciju tetrazolijeve soli u ljubičasti formazan, u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 3), što sugeriše da puka redukcija tetrazolijeve soli u prisustvu specifičnog jedinjenja nije dovoljno da se proceni sposobnost jedinjenja da ometa MTT test.

Da bi se utvrdilo da li jedinjenja 1, 2, 3 i 4 mogu izazvati apoptozu u ćelijama EA.hy926, procenjene su stanične morfološke promene i eksternalizacija fosfatidilserina. U skladu sa smanjenjem ćelijske vitalnosti uočenim CCK-8 testom, rezultati Hoechstovog bojenja i analize protočne citometrije korištenjem aneksina V-FITC/PI sugeriraju da je inhibicija rasta uočena nakon tretmana jedinjenjem 1, 2 i 3 bila zbog, barem djelimično, apoptoze ćelija EA.hy926. Naši rezultati su takođe podržali ideju da je kofeoilna grupa prisutna u oba jedinjenja 1 i 2 odgovorna za kontradiktorne rezultate dobijene MTT testom.

Slično našim nalazima, Rottlerin, moćan otvarač kalijumskih kanala velike provodljivosti, nije pokazao reaktivnost prema MTT in vitro. Međutim, snažno je pojačao formiranje kristala formazana unutar ćelija, što je rezultat koji je bio u evidentnom sukobu sa Rottlerinom inhibicijom NF-κB i proliferacijom ćelija uočenom analizom ugradnje [3 H]-timidina u DNK [21]. Mehanizam kojim je Rottlerin pojačao redukciju MTT-a pripisuje se njegovom efektu razdvajanja mitohondrija [22]. Rottlerin ima supstituentsku grupu cinamoilne kiseline. U poređenju sa cinamoil kiselinom, jedinjenje 3 posjeduje dva dodatna hidroksilna ostatka, koji se nalaze na C-3 i C-4. Stoga spekulišemo da mehanizam kojim jedinjenja 1 i 2 izazivaju suprotstavljene rezultate u MTT testu takođe može biti povezan sa njihovim efektima razdvajanja mitohondrija. Da bi se testirala ova hipoteza, potrebne su komparativne studije između jedinjenja 1, 2 i hemijskog odvajača, kao što je trifluorokarbonilcijanid fenilhidrazon (FCCP).

Eksperimentalna sekcija

Reagensi i hemikalije

Jedinjenje 3 (kafeinska kiselina u prahu, čistoća=98.6 posto) kupljeno je od Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). Jedinjenje 4 (3,4-dihidroksilfeniletanol–ulje, čistoća=98.5 posto) je dobijeno od Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kina). MTT i dimetil sulfoksid (DMSO) su dobijeni od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). CCK{11}} test je kupljen od Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan). Kompleti za detekciju apoptoze Hoechst 33342 i aneksin V-FITC/PI kupljeni su od Beyotime Instituta za biotehnologiju (Haimen, Kina)

Biljni materijal

Stabljike C. tubulosa su sakupljene iz prefekture Yutian, Xinjiang Uygur Autonomna Region, Kina. Uzorci vaučera deponovani su u Ključnoj laboratoriji visinske medicine, Trećeg vojnog medicinskog univerziteta (Čongqing, Kina) i overeni od strane Yi Zhang sa Univerziteta tradicionalne kineske medicine Chengdu (Čengdu, Kina)

Ekstrakcija i izolacija biljnog materijala

Na zraku osušene stabljike C. tubulosa (0.6 kg) su usitnjene u prah i ekstrahirane sa 50 posto etanola 2 h na 70 stepeni. Nakon uklanjanja rastvarača pod sniženim pritiskom, etanolni ekstrakt (212,5 g) je otopljen i suspendovan u vodi (2 L) i ekstrahovan sa n-butanolom (2 L × 3). Ekstrakt n-butanola (110 g) je hromatografiran na poliamidnoj koloni i eluiran sa etanolom/vodom (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) dajući pet frakcija (A-E) . Frakcija B (65 g) je frakcionisana na ODS koloni; eluiranje sa etanolom: voda (1:9) odvojeno jedinjenje 1 (3 g). Frakcija D (10,5 g) je frakcionisana na ODS koloni; eluiranje sa etanol/voda (1:4) odvojeno jedinjenje 2 (1 g).

NMR spektri su snimljeni na Bruker Avance 600 spektrometru u CD3OD sa tetrametilsilanom (TMS) kao internim standardom. Maseni spektri su rađeni na BioTOF-Q masenom spektrometru.

Cell Culture

EA.hy926 ćelijske linije su dobijene iz American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Ćelije su uzgajane u mediju RPMI 1640, dopunjen sa 10 posto (v/v) fetalnog goveđeg seruma i 1 posto (v/v) penicilin-streptomicina u vlažnoj sredini sa 5 posto CO2 na 37 stepeni.

Cell Viability

Vijabilnost ćelija je procijenjena korištenjem MTT i CCK{{0}} testova. Jedinjenja 1 i 2, i njihovi aglikoni, kafeinska kiselina (3) i 3,4-dihidroksilfeniletanol (4) otopljeni su u DMSO do konačne koncentracije DMSO < 0,1="" posto="" (v/v)="" u="" mediju="" za="">

EA.hy926 ćelije su posađene na 96-ploče sa 4 × 103 ćelija/jažici. Nakon inkubacije od 24 sata, ćelije su tretirane sa 6,25-50 μM jedinjenja 1, 2, 3 ili 4 tokom 24 sata. Medij za kulturu je uklonjen i ćelije su dva puta isprane sa fosfatnim puferom (PBS). Alikvoti (10 μL) osnovnog MTT rastvora (5 mg·mL-1) su dodani u svaku jažicu koja sadrži 100 μL medijuma i inkubirana sa ćelijama 4 h. Nakon inkubacije, medij je uklonjen i 150 μL alikvota DMSO je dodano u svaku jažicu da bi se kristali formazana rastvorili. Apsorpcija je izmjerena na 490 nm pomoću čitača mikroploča (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, SAD). Vijabilnost ćelija je izražena kao procenat smanjenja MTT, pri čemu se vrednost od 100 procenata dodeljuje apsorbanciji kontrolnih ćelija. Svi eksperimenti su izvedeni tri puta i predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD).

CCK-8 test je izveden prema literaturi uz male modifikacije [23]. Konkretno, ćelije su tretirane sa 6,25-50 μM jedinjenja 1, 2, 3 ili 4 tokom 24 h i isprane dva puta sa PBS pre dodavanja 10 μL CCK-8 rastvora i 100 μL medija za kulturu. Nakon inkubacije mikroploče na 37 stepeni tokom 2 sata, mjerena je apsorpcija na 450 nm pomoću čitača mikroploče. Vijabilnost ćelija je izražena kao procenat živih ćelija u odnosu na kontrolne ćelije (100 procenata). Svi eksperimenti su izvedeni tri puta i izraženi kao srednja vrijednost ± SD.

Procjena apoptoze po Hoechst 33342 bojenju

Apoptotične morfološke promjene uočene su Hoechst 33342 bojenjem. Ukratko, ćelije EA.hy926 su posađene na 48- ploče (2 × 104 ćelije/jažicu) i tretirane sa 50 μM jedinjenja 1, 2, 3 ili 4 tokom 48 sati na 37 stepeni, isprane dva puta sa PBS, i fiksiran sa 4 posto (v/v) paraformaldehida 15 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dva puta ispiranja sa PBS, ćelije su obojene sa Hoechst 33342 (10 ug·mL-1) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi i dva puta isprane sa PBS. Hoechst-om obojena jezgra su vizualizirana pomoću fluorescentnog mikroskopa (Olympus, Tokyo, Japan).

Analiza apoptoze pomoću protočne citometrije

Apoptotične ćelije su otkrivene dvostrukim bojenjem aneksinom V-FITC/PI i analizom protočne citometrije. Ukratko, nakon tretmana sa 50 μM jedinjenja 1, 2, 3 ili 4 tokom 48 h, ćelije su sakupljene i resuspendovane u PBS-u pri 1 × 105 ćelija·mL-1. Nakon centrifugiranja na 500× g tokom 5 minuta na 25 stepeni, dodato je 195 μL aneksin V-FITC veznog pufera i 5 μL aneksina V-FITC. Nakon laganog vorteks miješanja, smjesa je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon centrifugiranja na 500×g tokom 5 minuta na 25 stepeni, dodato je 190 μL FITC-konjugovanog pufera za vezivanje aneksina V i 10 μL PI. Nakon laganog vorteks miješanja, uzorci su analizirani korištenjem FACSCalibur protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornija, SAD) u roku od 30 minuta.

Statistička analiza

Svi eksperimentalni podaci izraženi su kao srednja vrijednost ± SD. Značajnost razlika između eksperimentalnih uzoraka i odgovarajuće kontrole procijenjena je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem softvera SPSS (verzija 11.5). Statistička značajnost je postavljena na p <>

Zaključci

Naši rezultati sugeriraju da bi precjenjivanje broja živih ćelija uočeno u MTT testu moglo prikriti citotoksičnost određenih spojeva. Stoga, tokom procesa skrininga lijekova, preporučujemo korištenje različitih metoda za određivanje efekta specifičnog jedinjenja na vitalnost ćelija (kao što su CCK-8 i 3 H-TdR testovi) kako bi se izbjeglo generiranje obmanjujućih rezultata.