Utjecaj vodenog ekstrakta Cistanches Herba na gubitak kostiju kod pacova sa ovarijektomijom

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Haidong Liang 1,*, Fang Yu 2, Zhihong Tong 1 i Zaiguo Huang 3

1 Hands and feet microsurgery, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: tongzhih37@sina.cn

2 School of Medicine, Dalian University, Dalian 116033, China; E-Mail: yufangk7@sina.cn

3 Orthopedics Department, Dalian Municipal Central Hospital, Dalian 116033, China; E-Mail: huangzg41@sina.com

sažetak:Da bi se procijenila sposobnost tradicionalne kineske medicine Cistanches Herba ekstrakt (CHE) da spriječi gubitak koštane mase kod pacova sa ovariektomijom (OVX), ekstrakt Cistanches Herba (CHE) je primijenjen intragastrično pacovima. Ženke pacova su anestezirane pentobarbital natrijumom (40 mg kg-1, ip), a jajnici su im uklonjeni obostrano. Pacovi u grupi lažno operisanih su anestezirani, laparotomija i zašiveni bez uklanjanja jajnika. Nakon 1 sedmice oporavka od operacije, OVX pacovi su nasumično podijeljeni u tri grupe i oralno tretirani H2O (OVX grupa) ili CHE (100 ili 200 mg kg-1 dnevno) tokom 3 mjeseca. Lažno operirana grupa (n=8) je oralno liječena H2O. Nakon 3 mjeseca, ukupna tjelesna mineralna gustina kostiju (BMD), mineralni sadržaj kosti (BMC), biomehanički indeks kostiju, nivoi minerala u krvi i aktivnosti antioksidativnih enzima u krvi ispitani su kod lažno operiranih, ovarijektomiranih i tretiranih ekstraktom Cistanches Herba pacova. Rezultati su pokazali da tretman ekstraktom Cistanches Herba značajno ovisno o dozi povećava mineralnu gustoću kosti (BMD), sadržaj minerala kostiju (BMC), maksimalno opterećenje, pomak pri maksimalnom opterećenju, naprezanje pri maksimalnom opterećenju, opterećenje pri automatskom prekidu, pomak pri automatskom prekidu , stres pri autoprekidanju i aktivnosti antioksidativnih enzima u krvi, snizili su nivoe Ca, Zn i Cu u krvi u odnosu na OVX grupu. Ovaj eksperiment pokazuje da primjena ekstrakta Cistanches Herba štakorima sa ovariektomijom poništava gubitak kostiju i sprječava osteoporozu.

Ključne riječi:ovariektomija; pacov; kost; antioksidans; Cistanches Herba

Cistanches Herba

1. Uvod

Osteoporoza je bolest starenja povezana s gubitkom koštane mase koja se često javlja bez simptoma sve dok mikroarhitektonsko propadanje ne postane toliko značajno da se prijelomi kostiju uvijek dešavaju na mjestu gdje je smanjenje koštane mase ispod onoga što je potrebno za integritet kosti. Osteoporoza je od velikog značaja u zdravstvenoj zaštiti. Iako smanjene mase, kosti su normalne u odnosu na mineralizaciju, ali histološki, dolazi do smanjenja debljine korteksa i broja i veličine trabekula grube spužvaste kosti [1–3].

Posljednjih godina provedeno je mnoštvo studija o ovoj bolesti. Akumulirani podaci pokazuju da je gubitak estrogena u menopauzi glavni doprinos patogenezi bolesti jer je ovaj hormon glavni negativni regulator aktivnosti osteoklasta [4-6], a osteoklasti su glavne stanice odgovorne za remodeliranje kostiju kod osteoporoze. [7].

Postmenopauzalna osteoporoza je najčešća metabolička bolest kostiju, karakterizira je brz gubitak mineraliziranog koštanog tkiva, narušavanje trabekularne arhitekture kosti i promjena kristalnih svojstava mineralnih naslaga, koje rezultiraju strukturnim oštećenjem (frakturom) mjesta bogata spužvastom kosti, kao što su pršljenovi, kuk i distalna podlaktica [8–11]. Nedostatak estrogena se smatra glavnom determinantom gubitka koštane mase kod žena u postmenopauzi. Štakori i psi sa jajnicima su se intenzivno koristili u modelima osteoporoze. Godine 1996. su prijavljeni efekti ibandronata na pse sa ovariektomijom [12].

Cistanches Herba (CH), holoparazitska biljka Cistanche deserticola YC Ma, klasifikovana je kao tonizirajuće sredstvo u orijentalnoj tradicionalnoj medicini i obično se koristi za liječenje zaborava, gubitka sluha, neplodnosti i kroničnog zatvora. CH ima različite farmakološke aktivnosti, uključujući antinociceptivne, protuupalne i imuno-pojačavajuće efekte [13,14]. Prethodna studija je izvijestila da Cistanches Herba može usmjeravati koštane mezenhimalne matične stanice (BMSC) da se diferenciraju u osteoblaste, što obećava povoljne izglede za liječenje osteoporoze i razjedinjenja fraktura kostiju [15]. Chen et al. [16] izvijestili su da polisaharidi Cistanches Herba mogu promovirati tranziciju ćelijskog ciklusa koštane srži i oporavak hematopoetske funkcije kod anemičnih miševa s depresijom koštane srži, ubrzati hematogenezu kod soja rubrum i soja makronukleusa.

U ovoj studiji, mineralna gustina kostiju (BMD), sadržaj minerala u kostima (BMC), biomehanički indeks kostiju, nivoi minerala u krvi i aktivnosti antioksidativnih enzima u krvi ispitani su kod lažno operisanih, ovariektomiranih i tretiranih pacovima Cistanches Herba kako bi se proučavali učinci tretmana. sa ekstraktom Cistanches Herba na kvalitetu kostiju.

Tradicionalna kineska medicina Cistanches Herba ekstrakt (CHE)

2. Materijali i metode

2.1. Priprema vodenih ekstrakata Cistanches Herba

Cistanches Herba je sakupljen iz pustinje u alxa ligi autonomne regije Nei Mongol (Unutrašnja Mongolija) 2010. godine.

Osušena stabljika Cistanches Herba ekstrahovana je destilovanom vodom na 100 stepeni 2 h. Rastvor je centrifugiran na 4000 o/min 10 min. Ostaci su uklonjeni filtracijom, a kombinovani filtrat je uparen zagrijavanjem da bi se dobila željena koncentracija (2,1 g suvog biljnog ekvivalenta ekstrakta/mL). Prinos ekstrakcije bio je 13,7 posto (w/w). Vodeni ekstrakt je čuvan na 2-8 stepeni.

2.2. Životinje

Za istraživanje su korištene 32 ženke Wistar štakora stare 3 mjeseca, težine između 240 i 270 g na početku eksperimenta. Održavani su u standardnim laboratorijskim uslovima sa ciklusom svetla i tame od 12 h, sa slobodnim pristupom standardnoj laboratorijskoj hrani za pacove i vodi iz slavine.

2.3. Eksperimenti na životinjama.

Ženke pacova su anestezirane pentobarbital natrijumom (40 mg kg-1, ip), a jajnici su im uklonjeni obostrano. Pacovi u grupi lažno operisanih su anestezirani, laparotomija i zašiveni bez uklanjanja jajnika. Nakon 1 sedmice oporavka od operacije, OVX štakori su nasumično podijeljeni u tri grupe (n=8 u svakoj grupi) i intragastrično tretirani H2O (OVX grupa), ekstraktom Cistanches Herba (CHE) (100 ili 200 mg kg). −1 dnevno) tokom 3 mjeseca. Lažno operirana grupa (n=8) je oralno liječena H2O.

Posljednjeg dana studije životinje su izvagane i žrtvovane, a uzorci krvi su uzeti istovremeno. Femuri su secirani i odstranjeni od mekog tkiva za mjerenje biomehaničkog ispitivanja.

Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa istraživačkim protokolima koje je uspostavio kineski komitet za brigu o životinjama.

2.4. Bone Densitometrija

Mineralni sadržaj femoralne kosti (BMC) i mineralna gustina kostiju (BMD) određeni su pomoću Hologic QDR{{0}}W DXA. Instrument je prilagođen za mod ultra visoke rezolucije sa razmakom linija od 0.0254 cm, rezolucijom od 0,0127 cm i kolimatorom prečnika 0,9 cm. Kosti su stavljene u petrijevu posudu. Da bi se simulirala gustina mekog tkiva koja okružuje kosti, oko kostiju je izlivena voda iz slavine kako bi se postigla dubina od 1 cm. Rezultati su dati za BMC i za mjereno područje. BMD ovog područja se izračunava kao BMC podijeljen s površinom. Pored rezultata za ukupnu femur, distalni i srednji dio femura analizirani su kao podregije [17].

2.5. Biomehaničko ispitivanje kostiju

Kosti bedrene kosti su držane na 4 stepena do određivanja čvrstoće na lomljenje pomoću 5-kN Flexure Fixture, konfigurirane za testove savijanja u tri tačke i pričvršćene na Instron univerzalnu mašinu za testiranje model 4502 opremljenu sa 10- kN load cell (Instron, Canton, MA, USA), kao što je prethodno opisano [18]. Brzina poprečne glave bila je 50 mm/min, a brzina uzorkovanja podataka 10 uzoraka/s. Maksimalno opterećenje, napon pri maksimalnom opterećenju, opterećenje pri kvaru i napon pri kvaru određivani su u femurima korištenjem Serije IX, v 8.08.{11}} softvera (Instron).

2.6. Biohemijska analiza

Nivoi Ca, Zn i Cu u krvi izmjereni su atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom.

Na osnovu metode Kinga i Armstronga [19], aktivnost alkalne fosfataze (ALP) je ispitana korištenjem dinatrijum fenil fosfata kao supstrata. Razvijena boja očitana je na 510 nm u UV-vis spektrofotometru nakon 10 min. Aktivnosti ALP-a su izražene kao IU/L.

Koncentracija malondialchehyche (MDA) u krvi određena je metodom koju su opisali Jain et al. [20], zasnovano na TBA reaktivnosti. Ukratko, 0.2 mL peleta eritrocita ili supernatanta dobijenih iz tkiva, 0.8 mL fosfatnog pufera (pH 7,4), 0.025 mL BHT, i { {19}}.5 mL 30% TCA je dodano u epruvete i pomiješano. Nakon 2 h inkubacije na -20 stepeni, smjesa je centrifugirana (4000× g) 15 min. Nakon toga, uzeto je 1 mL supernatanta i dodato u svaku epruvetu, a zatim 0,075 mL 0,1 M EDTA i

0.25 mL 1 posto TBA je dodano. Ove epruvete sa teflonskim poklopcima na navoj su inkubirane na 90 stepeni u vodenom kupatilu 15 minuta i ohlađene na sobnu temperaturu. Optička gustina je izmjerena na 532 za koncentraciju MDA u krvi.

Aktivnost glutation peroksidaze (GSH-Px) određena je metodom Lawrencea i Burka [21]. Smjesa za analizu sastojala se od 2.0 mL 75 mM fosfatnog pufera (pH 7.0), 50 μL 60 mM glutationa, {{15} }.1 mL 30 jedinice/mL glutation reduktaze, 0.1 mL 15 mM EDTA, 0.1 mL 3 mM NADPH i odgovarajuća količina supernatanta tkiva do konačne zapremine od 3.0 mL . Reakcija je započela dodavanjem 0,1 mL 7,5 mM H2O2. Brzina promjene apsorpcije tokom konverzije NADPH u NADP plus je zabilježena spektrofotometrijski na 340 nm tokom 3 min. Aktivnost GSH-Px za tkiva izražena je kao μmol NADPH oksidiranog u NADP plus min-1 mg-1 proteina.

Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) određivana je u krvi prema metodi Sun et al. [22]. Princip metode zasniva se na inhibiciji redukcije nitroplavog tetrazolijuma (NBT) korišćenjem sistema ksantin-ksantin oksidaze kao generatora superoksida. Aktivnost je procijenjena u supernatantima 10000 g metanol/hloroform (5/3, v/v) ekstrakta tkivnih homogenata (10 posto). Jedna jedinica SOD je definirana kao količina enzima koja uzrokuje 50 posto inhibicije stope smanjenja NBT.

Aktivnost katalaze (CAT) mjerena je Abeijevom [23] metodom. Serum je dodat u kivetu koja sadrži 2,89 mL 50 mmol/L fosfatnog pufera (pH 7.0). Reakcija je pokrenuta dodavanjem 0.1 mL svježe pripremljene 30 mmol/L H2O2 da bi se dobila konačna zapremina od 3,0 mL na 25 stepeni. Brzina razgradnje H2O2 je mjerena na 240 nm tokom 5 minuta na spektrofotometru. Jedna jedinica (U) CAT je definisana kao količina enzima potrebna za razgradnju 1 nmol H2O2 u minuti, na 25 stepeni i pH 7,8.

2.7. Statistička analiza

Eksperimentalni rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD za osam životinja u svakoj grupi. Biohemijski parametri su statistički analizirani korišćenjem jednosmerne analize varijanse ANOVA, nakon čega je usledio Dunettov test višestrukog poređenja (DMCT). P-vrijednost od<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Rezultati

Dvije životinje su istekle tokom studije. Prema tome, brojevi za grupe na kraju studije su bili: 8 u lažnoj kontroli; 7 u OVX grupi; 7 u grupi koja je primala CHE (100 mg kg-1 dnevno), i 8 u grupi koja je primala CHE (200 mg kg-1 dnevno). Dva dana nakon operacije, pacovi su unosili hranu i vodu nešto niže nego prije operacije. Nijedna životinja nije bolovala od infekcije i anabioze. Nisu primećeni klinički evidentni neželjeni efekti kod pacova.

Prije operacije nije bilo značajne (p > {{0}}.01) razlike u tjelesnoj težini pacova između grupa. Tjelesna težina grupe OVX bila je značajno (p < 0.01)="" niža="" od="" one="" lažne="" grupe="" (tabela="" 1).="" davanje="" ekstrakta="" cistanches="" herba="" u="" dozi="" od="" 100="" i="" 200="" mg/kg="" dnevno="" značajno="" je="" (p="">< 0,05)="" povećalo="" tjelesnu="" težinu="" pacova="" u="" grupi="" tretiranoj="" che="" (100="" i="" 200="" mg/kg="" dnevno).="" podaci="" dobijeni="" od="" životinja="" pokazali="" su="" da="" postoje="" statistički="" značajne="" razlike="" između="" bmd="" i="" bmc="" grupe="" ovx="" i="" lažne="" kontrole="" (p="">< 0,01).="" kao="" što="" se="" i="" očekivalo,="" primjena="" ekstrakta="" cistanches="" herba="" u="" dozi="" od="" 200="" mg/kg="" dovela="" je="" do="" značajnog="" povećanja="" bmd-a="" i="" bmc-a="" u="" grupi="" liječenoj="" che="" (p="">< 0,05;="" p=""><>

4. Diskusija

Osteoporoza je jedan od najčešćih poremećaja povezanih sa nedostatkom estrogena i starenjem. Menopauza rezultira povećanom presnovom kostiju, neravnotežom između formiranja kostiju i resorpcije kosti, te neto gubitkom kosti. Gubitak koštane mase uzrokovan nedostatkom estrogena prvenstveno je posljedica povećanja osteoklastične resorpcije kosti i kod ljudi i kod eksperimentalnih životinja [24].

Iako osteoporoza pogađa i starije muškarce i žene, žene u postmenopauzi su primarni fokus osteoporoze [25,26]. Dramatični nedostatak ženskih hormona najvažniji je faktor za osteoporozu žena u postmenopauzi. OVX model štakora najčešće se koristi u istraživanjima postmenopauzalne osteoporoze [27,28], u kojoj ovariektomija rezultira viškom resorpcije kosti u odnosu na formiranje kosti u početku i uzrokuje gubitak kosti. OVX operacija uzrokuje značajno povećanje tjelesne težine što bi moglo biti smjernica za procjenu uspjeha operacije [29]. Na kraju ove studije, tjelesna težina OVX grupe je značajno smanjena u odnosu na lažnu grupu, a tretman ekstraktom Cistanches Herba u potpunosti je spriječio ovo smanjenje. Pretpostavljamo da je OVX izazvao tešku fiziološku nelagodu koja je uticala na unos hrane pacova. Nakon toga, tjelesna težina OVX grupe je značajno smanjena.

Mineralna gustina kostiju je opisana kao samo surogat mjera čvrstoće kosti [30]; međutim, mikroarhitektonska svojstva su novonastali marker za procjenu pravog uticaja tretmana na kvalitet trabekularne kosti. Iako je niska koštana masa glavni faktor rizika za prijelom [31], očuvanje trabekularne arhitekture kosti značajno doprinosi snazi ​​kosti i može smanjiti rizik od prijeloma izvan BMD i BMC, kao što je pokazano brojnim studijama koje su objavile bliske korelacije između mikrostrukturnih svojstva i biomehaničku čvrstoću kostiju [32,33]. U ovom radu utvrđeno je da se BMD i BMC značajno razlikuju između lažnih i ovarijektomiranih grupa. Tretman ekstraktom Cistanches Herba značajno je poboljšao BMD i BMC kod OVX pacova. Osim toga, primjena ekstrakta Cistanches Herba i dalje je značajno ovisno o dozi povećala maksimalno opterećenje, pomak pri maksimalnom opterećenju, naprezanje pri maksimalnom opterećenju, opterećenje pri automatskom prekidu, pomak pri automatskom prekidu i stres kod grupa koje su tretirane CHE automatskim probijanjem. u poređenju sa OVX grupom. Ovi rezultati su pokazali da kosti femura pacova hranjenih ekstraktom Cistanches Herba imaju veće opterećenje u slučaju loma i stoga mogu biti otpornije na frakture stresa. Osim toga, pacovi u OVX grupi imali su više razine Ca, Zn i Cu u krvi od onih u lažnoj grupi. Davanje ekstrakta Cistanches Herba smanjilo je nivoe Ca, Zn i Cu u krvi kod OVX pacova.

Ideja da je oksidativni status važan kod osteoporoze u skladu je sa snažnom epidemiološkom vezom između osteoporoze i ateroskleroze, bolesti u kojoj oksidativni stres igra glavnu ulogu. Štaviše, nedavno je uočeno da kod žena postoji povezanost između oksidativnog stresa (mjerenog biomarkerom oksidativnog stresa, 8-iso-PGF2-) [34], nivoa antioksidansa [35] i mineralna gustina kostiju. Kliničke studije koje su ispitivale odnos između ishrane i/ili suplementacije askorbata i koštane mase kod ljudi takođe ukazuju na povezanost sa povećanom koštanom masom [36].

Budući da MDA ima visoku reaktivnost prema amino grupama, on inhibira sintezu nukleinskih kiselina i proteina, a također deaktivira enzime [37,38]. Stoga, smanjenje antioksidativnih enzima femura uočeno nakon OVX-a može biti posljedica povećane peroksidacije lipida. Antioksidativni enzimi su uključeni u sistem odbrane od oštećenja tkiva ili ćelija posredovanih slobodnim radikalima. Oni metaboliziraju ili slobodne radikale ili intermedijere reaktivnog kisika u neradikalne proizvode. Ovi enzimi uključuju porodicu enzima zavisnih od glutationa [39]. U ovoj studiji izvještavamo o značajnom smanjenju nivoa antioksidativnih enzima, tj. SOD, GSH-Px, CAT u krvi štakora sa ovariektomijom. Ovi nalazi sugeriraju da je nedostatak hormona jajnika u korelaciji s neuspjehom u borbi protiv oksidativnog stresa. Davanje ekstrakta Cistanches Herba značajno je ovisno o dozi povećalo aktivnosti SOD, GSH-Px i CAT u krvi kod OVX pacova. Čini se da ovi rezultati ukazuju na bolji zaštitni učinak ekstrakta Cistanches Herba protiv oksidativnog stresa izazvanog tokom OVX.

Ukratko, ekstrakt Cistanches Herba efikasan je u prevenciji gubitka koštane mase uzrokovane nedostatkom hormona jajnika, što se vidi iz BMD-a femura, vrijednosti BMC-a i nivoa Ca, Zn i Cu u krvi. Kako je osteoporoza povezana s oksidativnim stresom, studije ove vrste potvrđuju važnost terapijskih vrijednosti antioksidansa. Pretpostavljamo da ekstrakt Cistanches Herba poboljšava kvalitet kostiju možda dijelom kroz povećanje aktivnosti antioksidativnih enzima OVX pacova i smanjenje mineralnih elemenata kostiju.

Ekstrakt Cistanches Herba: sprečava gubitak koštane mase

Reference

1. Canalis, E.; Giustina, A.; Bilezikian, JP Mehanizmi anaboličke terapije za osteoporozu. N. Engl. J. Med. 2007, 357, 905–916.

2. Heaney, RP; Recker, RR; Saville, PD Menopauzalne promjene u remodeliranju kostiju. J. Lab. Clin. Med. 1978, 92, 964–970.

3. McNamara, LM; Ederveen, AGH; Lyons, CG; Price, C.; Schaffer, MB; Weinans, H.; Prendergast, PJ Snaga spužvastog koštanog trabekularnog tkiva normalnih, ovariektomiranih i liječenih pacovima tokom starenja. Bone 2006, 39, 392–400.

4. Compston, JE Hormonska nadomjesna terapija. Clin. Reumatol. 1997, 11, 583–596.

5. Meiner, SE Osteoporoza u širenju pejzaža: mogućnosti liječenja danas. Adv. Nurse Pract.1999, 7, 26–31.

6. Aubin, JE; Bonnelye, E. Osteoprotegerin i njegov ligand: Nova paradigma za regulaciju osteoklastogeneze i resorpcije kostiju. Osteoporos. Int. 2000, 11, 905–913.

7. Roodman, GD Napredak u biologiji kostiju: osteoklast. Endocr. Rev. 1996, 17, 308–332.

8. Kesten, CH, III. Terapija lijekovima: kalcitonin, bisfosfonati i anabolički steroidi. U osteoporozi: etiologija, dijagnoza i upravljanje; Riggs, BL, Melton, LJ, III, ur.; Lippincott-Raven: Philadelphia, PA, SAD, 1995.

9. Quan, Q.-M.; Wu, W.; Li, Y.-X.; Cai, Q.-R. Varijacije u sadržaju ikarina i flavonoida u vrstama Barrenwort. J. Med. Plants Res. 2010, 4, 1176–1181.

10. Du, XG; Pan, HZ; Zhang, CY; Zhang, HY; Liu, HM; Chen, ZY; Zeng, XY Zingiber officinale ekstrakt modulira imunosupresiju izazvanu g-zracima kod miševa. J. Med. Plants Res. 2010, 4, 1647–1655.

11. Paschalis, EP; Betts, F.; DiCarlo, E.; Mendelsohn, R.; Boskey, AL FTIR mikrospektroskopska analiza biopsija ljudskog grebena ilijačne kosti iz neliječene osteoporotske kosti. Calcif. Tissue Int. 1997, 61, 487–492.

12. Motoie, H.; Kanoh, H.; Ogata, S.; Kawamuki, K.; Shikama, H.; Fujikura, T. Prevencija gubitka koštane mase bisfosfonatom YM175 kod pasa sa ovariektomijom uz ograničenje kalcija u ishrani. Jpn. J. Pharmacol. 1996, 71, 239–246.

13. Lin, LW; Hsieh, MT; Tsai, FH; Wang, WH; Wu, CR Anti-nociceptivna i protuupalna aktivnost uzrokovana Cistanche deserticola kod glodara. J. Ethnopharmacol. 2002, 83, 177–182.

14. Wu, XM; Gao, XM; Tsim, KW; Tu, PF Arabinogalaktan izolovan iz stabljike Cistanche deserticola indukuje proliferaciju kultivisanih limfocita. Int. J. Biol. Macromol. 2005, 37, 278–282.

15. Zeng, JC; Fan, YG; Liu, JR; Zeng YR; Yi, CZ; Liang Y. Eksperimentalna studija usmjerene diferencijacije koštanih mezenhimalnih matičnih stanica (BMSC) na osteoblaste vođena cistanche deserticola koja sadrži serum. Zhongguo Gu Shang 2010, 23, 606–608.

16. Chen, Z.-W.; Zhu, B.-D.; Xu H.-Y. Eksperimentalno istraživanje polisaharida cistanche u pustinji na reguliranoj hematogenezi kod miševa s depresijom anemije koštane srži. Brada. Arch. Tradit. Brada. Med. 2007, 25, 1473–1474.

17. Prakasam, G.; Yeh, JK; Chen, M.-M.; Castro-Magana, M.; Liang, CT; Aloia, JF Efekti hormona rasta i testosterona na formiranje kortikalne kosti i gustinu kostiju kod starijih pacova sa ovariektomijom. Bone 1999, 24, 491–497.

18. McClung, JP; Stahl, CH; Marchitelli, LJ; Morales-Martinez, N.; Makin, KM; Young, AJ; Scrimgeour, AG Efekti dijetetske fitaze na povećanje tjelesne težine, tjelesnu kompoziciju i biomehaniku kostiju kod pacova u rastu koji su hranjeni hranom sa niskim sadržajem cinka. J. Nutr. Biochem. 2006, 170, 190–196.

19. King, EJ; Armstrong, AR Pogodna metoda za određivanje aktivnosti seruma i žučne fosfataze. Može. Med. vanr. J. 1934, 31, 376–381.

20. Jain, SK; McVie, R.; Duett, J.; Herbst, JJ Peroksidacija lipida membrane eritrocita i glikozilirani hemoglobin u dijabetesu. Diabetes 1989, 38, 1539–1543.

21. Lawrence, RA; Burk, RF aktivnost glutation peroksidaze u jetri pacova sa nedostatkom selena. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976, 71, 952–958.

22. Sun, Y.; Oberley, LW; Ying, L. Jednostavna metoda za kliničko ispitivanje superoksid dismutaze. Clin. Chem. 1988, 34, 497–500.

23. Abei, H. Catalase in vitro. Metode Enzymol. 1988, 10, 121–126.

24. Mozaffari, Z.; Azarnia, M.; Abdolhamid Angaji, S. Procjena toksičnih efekata vodenog ekstrakta lista Trigonella foenum-graecum na razvoj dugog koštanog tkiva u fetusu pacova. J. Med. Plants Res. 2010, 4, 1148–1155.

25. Buencamino, MCA; Sikon, AL; Jain, A.; Thacker, HL. Opservacijska studija o pridržavanju smjernica za liječenje osteopenije. J. Zdravlje žena 2009, 18, 873–881.

26. Schmitt, MN; Schmitt, J.; Dören, M. Uloga fizičke aktivnosti u prevenciji osteoporoze kod žena u postmenopauzi – ažuriranje. Maturitas 2009, 63, 34–38.

27. Lelovas, PP; Xanthos, TT; Thomas, SE; Tekstovi, GP; Dontasi, IA Laboratorijski štakor kao životinjski model za istraživanje osteoporoze. Comp. Med. 2008, 58, 424–430.

28. Ncango, DM; Pohl, CH; van Wyk, PWJ; Kock, JLF Nesteroidni protuupalni lijekovi (NSAID) inhibiraju rast patogena kvasca. Afr. J. Microbiol. Res. 2011, 5, 1123–1125.

30. Fazliana, M.; Nazaimoon, WMW; Gu, HF; Ostenson, CG Ekstrakt Labisia pumila reguliše tjelesnu težinu i adipokine kod pacova sa ovarijektomijom. Maturitas 2009, 62, 91–97.

30. Bourrin, S.; Ammann, P.; Bonjour, JP; Rizzoli, R. Oporavak mineralne gustine i čvrstoće kostiju proksimalne tibije, ali ne i strukture spužvaste kosti, nakon dugotrajne terapije bisfosfonatima ili selektivnim modulatorom estrogenskih receptora kod starijih pacova. Bone 2002, 30, 195–200.

31. Borah, B.; Dufresne, TE; Chmielewski, PA; Gross, GJ; Prenger, MC; Phipps, RJ Risedronate čuva trabekularnu arhitekturu i povećava čvrstoću kostiju u pršljenima mini svinja sa ovarijektomijom, mjereno trodimenzionalnom mikrokompjuterskom tomografijom. J. Bone Miner. Res. 2002, 17, 1139–1147.

32. Müller, R.; Hannan, M.; Smith, SY; Bauss, F. Intermitentni ibandronat čuva kvalitet kostiju i snagu kostiju u lumbalnoj kičmi nakon 16 mjeseci liječenja kod majmuna cynomolgus sa ovariektomijom. J. Bone Miner. Res. 2004, 19, 1787–1796.

33. Lane, NE; Kumer, JL; Majumdar, S.; Khan, M.; Lotz, J.; Stevens, RE; Klein, R.; Phelps, KV Efekti sintetičkih konjugiranih estrogena, a (Cenestin) na strukturu i snagu trabekularne kosti u modelu štakora sa ovarijektomijom. Osteoporosis Int. 2002, 13, 816–823.

34. Basu, S.; Michaelsson, K.; Olofsson, H.; Johansson, S.; Melhus, H. Povezanost između oksidativnog stresa i mineralne gustine kostiju. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, 288, 275–279.

35. Maggio, D.; Barabani, M.; Pierandrei, M.; Cristina Polidori, M.; Catani, M.; Mecocci, P.; Senin, U.; Pacifici, R.; Cherubini, A. Izraženo smanjenje antioksidansa u plazmi kod starijih žena s osteoporozom: Rezultati studije poprečnog presjeka. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 88, 1523–1527.

36. Morton, DJ; Barrett-Connor, EL; Schneider, DL upotreba dodatka vitamina C i mineralna gustina kostiju kod žena u postmenopauzi. J. Bone Miner. Res. 2001, 16, 135–140.

37. Bird, RP; Draper, HH Efekat malonaldehida i acetaldehida na kultivisane ćelije sisara: Morfologija rasta i sinteza makromolekula. J. Environ. Health 1980, 6, 811–823.

38. Abdelhalim, MAK Potencijalni uticaj oksidativnog stresa izazvanog dijetom visokog holesterola na sastav i svojstva crvenih krvnih zrnaca kod kunića. Afr. J. Microbiol. Res. 2010, 4, 836–843.

39. Chaudiere, J.; Ferrari-Illiou, R. Intracelularni antioksidansi od hemijskih do biohemijskih mehanizama. Food Chem. Toxicol. 1999, 37, 949–962.