Ekstrakt Cistanche Deserticola povećava formiranje kostiju u osteoblastima
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,ei Chih-Hsin Tangf,c
Abstract
Ciljevi:Istraživali smo efekatCistanche deserticola Ma. (CD) na formiranje kosti kultivisanim osteoblastima.MetodeAnaliza formiranja mineraliziranih nodula korištena je za ispitivanje in vitro efekata CD-a na formiranje kosti. Ekspresija alkalne fosfataze (ALP), koštanih morfogenetskih proteina (BMP)-2 i ekspresije mRNA osteopontina (OPN) analizirana je kvantitativnom lančanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu. Mehanizam djelovanja CD ekstrakta istražen je Western blottingom. In vivo anti-osteoporotski efekat CD ekstrakta je procenjen kod miševa sa ovariektomijom.Ključni nalaziEkstrakt CD-a nije imao utjecaja na proliferaciju, migraciju ili zacjeljivanje rana kultiviranih osteoblasta, ali je povećao ALP, BMP-2 i OPN mRNA i mineralizaciju kostiju. Inhibitori protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) ili nuklearnog faktora (NF)-kB smanjuju formiranje kostiju izazvano ekstraktom CD-a i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. Međutim, CD ekstrakt nije utjecao na osteoklastogenezu. Osim toga, ekstrakt CD-a spriječio je gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo.ZaključciCD može biti novo sredstvo za formiranje kostiju za liječenje osteoporoze.
Uvod
Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko tipova ćelija koje prolaze kroz kontinuirani proces obnove i popravke koji se naziva 'remodeliranje kosti'. Dva glavna tipa ćelija odgovorna za remodeliranje kosti su osteoklasti, koji resorbuju kost, i osteoblasti, koji formiraju novu kost. Remodeliranje kostiju reguliše nekoliko sistemskih hormona (npr. paratiroidni hormon, 1, 25-hidroksivitamin D3, polni hormoni i kalcitonin) i lokalni faktori (npr. dušikov oksid, prostaglandini, faktori rasta i citokini).[1]
Osteoporoza nastaje kada su resorpcija i formiranje kosti nekoordinirane i višak razgradnje kosti premašuje izgradnju kosti.[2] Trenutni tretmani za osteoporozu uključuju bisfosfonate, kalcitonin i estrogen, koji su inhibitori resorpcije kostiju koji održavaju koštanu masu inhibirajući aktivnost osteoklasta.[3] Međutim, učinak ovih lijekova na povećanje ili oporavak koštane mase je relativno mali, svakako ne više od 2 posto godišnje.[3] Stoga postoji potreba za sredstvima za izgradnju kosti, kao što je teriparatid, koji stimulišu formiranje nove kosti i koriguju promjenu u trabekularnoj mikroarhitekturi koja je karakteristična za uspostavljenu osteoporozu.[4,5] Budući da je formiranje nove kosti prvenstveno funkcija kostiju. osteoblast, agensi koji djeluju bilo povećanjem proliferacije ćelija osteoblastne loze ili indukcijom diferencijacije osteoblasta mogu poboljšati formiranje kosti.[5,6]
Iako mehanizmi osteoporoze ostaju nejasni, oni su vjerovatno povezani sa smanjenom dostupnošću ili efektima faktora rasta kostiju, kao što su koštani morfogenetski proteini (BMPs).[7] BMP, koji su strukturno povezani sa superporodicom faktora rasta-b koji se transformiše, prvobitno su identifikovani po njihovom kapacitetu da indukuju formiranje ektopične kosti kod glodara.[8] BMP igraju važnu ulogu u formiranju kostiju i diferencijaciji koštanih ćelija tako što stimulišu aktivnost alkalne fosfataze (ALP), kao i sintezu proteoglikana, kolagena i osteopontina (OPN). Nedavna studija je otkrila vezu između osteoporoze i specifičnih polimorfizama u genima BMP-2, ALP i OPN, sugerirajući da su povezani s razvojem osteoporoze.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; skraćeno CD) je autohtona biljka u Kini i široko se koristi u tradicionalnoj medicini kao terapeutsko sredstvo zbog svojih sedativnih, analgetskih i imunostimulirajućih svojstava.[11] Moderne farmakološke studije su pokazale da ekstrakti CD-a mogu stimulirati imunitet,[12] uklanjati slobodne radikale[13] i povećati aktivnost superoksid dismutaze.[14] Anti-inflamatorni i antioksidativni agensi imaju potencijal za liječenje osteoporoze povećanjem formiranja kostiju i/ili suzbijanjem resorpcije kosti.[15,16] Međutim, učinak CD-a na funkciju koštanih stanica još nije utvrđen. Ovdje izvještavamo da CD ekstrakt nije utjecao na proliferaciju, migraciju ili aktivnost zacjeljivanja rana kultiviranih osteoblasta, ali je povećao ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i mineralizaciju kostiju. Osim toga, pokazujemo da signalni putevi protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i nuklearnog faktora (NF)-kB mogu biti uključeni u CD-posredovano povećanje ekspresije gena i mineralizacije kostiju. Nasuprot tome, CD ekstrakt nije potisnuo osteoklastogenezu in vitro. Posebno, tretman miševa ekstraktom CD-a spriječio je gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom in vivo. Naši podaci, stoga, sugeriraju da se CD može koristiti za stimulaciju formiranja kostiju u liječenju osteoporoze.
Cistanche deserticola
Materijali i metode
Ekstrakt i materijali Cistanche deserticola
Ekstrakt CD-a je kupljen od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Tajvan). Ekstrakcija i izolacija CD-a su praćeni kako je prethodno opisano (na osnovu spektralnih podataka identifikovali su hemijski sastav uključujući beta-sitosterol, daukosterol, jantarnu kiselinu, triakontanol, akteozid, betain i polisaharid).[17] Zečja poliklonska antitela specifična za p-ekstracelularne signalno regulisane kinaze (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminalne kinaze (JNK), JNK, p-p65 i p65 kupljena su od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, SAD). ELISA komplet za osteokalcin kupljen je od Biosource Technology (Nivelles, Belgija). C-terminalni telopeptidi ELISA kompleta tipa I kolagena dobijeni su od Cross Lapsa (Herlev, Danska). Dominantno negativni mutant p38 dao je dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, SAD). JNK dominantno-negativnog mutanta dao je dr. M. Karin (Univerzitet Kalifornije, San Dijego, SAD). ERK2 dominantno-negativni mutant dao je dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Svi ostali reagensi su nabavljeni od Sigma-Aldrich (St Louis, SAD).
Ćelijska kultura
Mišja ćelijska linija osteoblasta MC3T3-E1 je kupljena od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, SAD). Ćelije su uzgajane u 95 posto zraka, 5 posto CO2 sa a-MEM koji je dopunjen sa 20 mm HEPES i 10 posto toplinom inaktiviranim fetalnim telećim serumom, 2 mm glutamina, penicilina (100 U/ml) i streptomicina (100 mg /ml).
Mjerenje formiranja mineraliziranih nodula
Formiranje mineralizovanih nodula je procenjeno kako je opisano.[18] Ukratko, osteoblasti su kultivisani u medijumu koji sadrži vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm) tokom dve nedelje, a podloga je menjana svaka tri dana. Nakon 12 dana inkubacije sa ekstraktom CD-a, ćelije su dva puta isprane sa 20 mm Tris puferovanom fiziološkom otopinom koja je sadržavala
0.15 m NaCl (pH 7,4), fiksiran u ledeno hladnom 75 posto (v/v) etanolu 30 minuta i osušen na zraku. Depozicija kalcijuma određena je bojenjem alizarinom crvenom-S. Ukratko, ćelije i matriks fiksirane etanolom obojeni su 1 h sa 40 mm alizarinskim crvenim-S (pH 4,2) i opsežno isprani vodom. Vezana mrlja je eluirana sa 10 posto (w/v) cetilpiridinijum hlorida, a alizarin crveni-S u uzorcima je kvantifikovan merenjem apsorbancije na 550 nm i upoređen sa standardnom krivom. Jedan mol alizarin crvenog-S selektivno veže približno dva mola kalcijuma.
Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu
Ukupna RNK je ekstrahirana iz osteoblasta pomoću TRIzol kita (MDBio Inc., Tajpej, Tajvan). Reverzna transkripcija je izvedena korišćenjem 2 mg ukupne RNK i oligo(dT) prajmera.[19,20] Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qPCR) izvedena je korišćenjem TaqMan® jednostepene PCR Master Mix-a (Applied Biosystems, Carlsbad, Carlsbad, PCR). SAD). Dodata je ukupna cDNK (100 ng po 25-ml reakciji) sa prajmerima specifičnim za sekvencu i Taqman® sondama. Svi ciljni genski prajmeri i sonde su kupljeni komercijalno, uključujući b-aktin kao internu kontrolu (Applied Biosystems). qPCR testovi su izvedeni u tri primjerka na StepOnePlus sistemu za detekciju sekvenci (Applied Biosystems). Uslovi ciklusa bili su 10-min aktivacije polimeraze na 95 stepeni nakon čega je slijedilo 40 ciklusa od 95 stupnjeva u trajanju od 15 s i 60 stepeni tokom 60 s. Prag je postavljen iznad kontrolne pozadine bez šablona i unutar linearne faze amplifikacije ciljnog gena da bi se izračunao broj ciklusa u kojem je transkript otkriven (označen CT).
Western blot analiza
Ćelijski lizati su pripremljeni kako je prethodno opisano.[21,22] Proteini su razdvojeni pomoću SDS-PAGE i prebačeni na Immobilon polivinil difluoridne membrane (Millipore, Billerica, SAD). Mrlje su blokirane sa 4 posto goveđeg serumskog albumina 1 h na sobnoj temperaturi, a zatim ispitane zečjim anti-humanim antitijelima protiv p-65, ili p-p65 (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Nakon tri ispiranja, mrlje su inkubirane sa sekundarnim anti-zečjim antitelom konjugovanim s peroksidazom (1:1000) 1 h na sobnoj temperaturi. Mrlje su vizualizirane pojačanom hemiluminiscencijom korištenjem X-OMAT LS filma (Eastman Kodak, Rochester, SAD).
Osteporoza izazvana ovarijektomijom
Za ovo istraživanje korištene su ženke ICR miševa, stare četiri sedmice, težine 22~28 g. Miševi su obostrano podvrgnuti ovariektomiji pod anestezijom trikloro-acetaldehidom (100 mg/kg), a kontrolni miševi su lažno operisani (Sham) radi poređenja. Mineralna gustina kostiju i mineralni sadržaj kostiju mjereni su nakon oralne primjene različitih koncentracija CD ekstrakta svaka dva dana tokom četiri tjedna. Ukupna tjelesna mineralna gustina kostiju i mineralni sadržaj kostiju određeni su dvoenergetskim rendgenskim apsorpciometrom (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, SAD) koristeći način rada za male subjekte kao što je prethodno opisano.[18, 23] Svi protokoli su bili u skladu sa institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Komiteta za brigu o životinjama Kineskog medicinskog univerziteta.
Statistička analiza
Statistička analiza je izvršena korištenjem Prism 4.01 softvera. (GraphPad Software Inc., San Diego, SAD). Date vrijednosti su srednja vrijednost ± SEM. Statistička analiza između dva uzorka izvršena je pomoću Studentovog t-testa. Statistička poređenja više od dvije grupe izvršena su korištenjem jednosmjerne analize varijanse sa Bonfer-Ronijevim posthoc testom. U svim slučajevima, P < 0,05="" se="" smatra="">
Ekstrakt cistanche deserticola
Rezultati
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava mineralizaciju kostiju osteoblastima
Dodavanje CD ekstrakta tokom 24 ili 48 h nije uticalo na proliferaciju mišjih osteoblastnih MC3T3-E1 ćelija u MTT testu (podaci nisu prikazani). Budući da je diferencijacija osteoblasta složen proces koji uključuje proliferaciju i migraciju ćelija, testirali smo i migracionu sposobnost MC3T3-E1 ćelija nakon tretmana sa ekstraktom CD-a. Koristeći Transwell i testove zacjeljivanja rana, otkrili smo da ekstrakt CD-a ne utječe na migraciju osteoblasta (podaci nisu prikazani). Formiranje mineraliziranih nodula jedan je od markera sazrijevanja osteoblasta. Bojenje Alizarinom crvenom S pokazalo je da se mineralizirani noduli formiraju kada su osteoblasti kultivirani dvije sedmice u mediju koji sadrži vitamin C (50 mg/ml) i b-glicerofosfat (10 mm), a to je povećano na način ovisan o koncentraciji dodavanjem CD-a (slika 1a). Stoga je CD ekstrakt inducirao formiranje koštanih nodula kultiviranim osteoblastima, ali ne i njihovu proliferaciju ili migraciju. Također smo ispitali ulogu ekstrakta CD-a u osteoklastogenezi izazvanoj RANKL-om, ali nismo našli nikakav učinak (podaci nisu prikazani).
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava alkalnu fosfatazu, koštani morfogenetski protein-2 i ekspresiju osteopontina u kultivisanim osteoblastima
Diferencirani osteoblasti pokazuju povišenu aktivnost ALP, što je u korelaciji sa visokim nivoom ekspresije enzima.[18] Otkrili smo da tretman sa ekstraktom CD-a u trajanju od 72 h značajno povećava aktivnost osteoblasta ALP (slika 1b). S obzirom na ključnu ulogu BMP-2, ALP i OPN-a u diferencijaciji osteoblasta, testirali smo da li ekstrakt CD-a djeluje na diferencijaciju osteoblasta regulacijom ekspresije BMP-2, ALP i OPN. Tretman ćelija ekstraktom CD-a povećao je ekspresiju mRNA ALP, BMP-2 i OPN na način ovisan o koncentraciji (Slika 1c), pokazujući da CD ekstrakt inducira diferencijaciju osteoblasta povećanjem ALP, BMP-2 , i OPN izraz.
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula putem puta protein kinaze aktiviranog mitogenom
Prijavljeno je da MAPK igra važnu ulogu u formiranju kosti[24,25] pa smo zatim ispitali da li je ovaj signalni put uključen u mineralizaciju kostiju izazvanu ekstraktom CD-a. Predtretman ćelija sa ERK inhibitorom U0126, inhibitorom p38 SB203580 ili JNK inhibitorom SP600125 smanjio je CD ekstrakt-povećala mineralizaciju kostiju (Slike 2a, 3a i 4a). Nadalje, inhibitori su također blokirali ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN izazvanu ekstraktom CD-a (Slike 2b-4c). Transfekcija ćelija sa ERK2, p38 ili JNK mutantima smanjila je povećanje ekspresije CD ekstrakta u ALP, BMP-2 i OPN mRNA (Slike 2c, 3c i 4c). Zatim smo direktno ispitali aktivaciju ERK, p38 i JNK nakon tretmana CD ekstraktom. Inkubacija ćelija sa ekstraktom CD-a izazvala je fosforilaciju ERK, p38 i JNK (Slike 2d, 3d i 4d). Stoga, ERK, p38 i JNK posreduju u povećanom formiranju kosti izazvanom CD tretmanom osteoblasta.
Ekstrakt Cistanche deserticola povećava formiranje koštanih nodula putem nuklearnog faktora-kB puta
Kao što je ranije spomenuto, aktivacija NF-kB je neophodna za formiranje kosti.[26,27] Zatim smo tretirali osteoblaste NF-kB inhibitorima pirolidin ditiokarbamatom (PDTC) i N-tozil-L-fenilalanin hlorometil ketonom (TPCK) kupljenim od strane kompanije. Calbiochem (Darmstadt, Njemačka) kako bi se utvrdilo da li je aktivacija NF-kB uključena u mineralizaciju kostiju izazvanu ekstraktom CD-a. Slika 5a pokazuje da je predtretman osteoblasta sa PDTC ili TPCK inhibirao formiranje koštanih nodula izazvano ekstraktom CD-a, a također je smanjio povećanje ekspresije ALP, BMP-2 i OPN (Slike 5b i 5c). Fosforilacija NF-kB p65 podjedinice je indikator aktivacije NF-kB;[28] u skladu s tim, otkrili smo da CD ekstrakt povećava fosforilaciju p65 u osteoblastima (Slika 5d). Ovi rezultati pokazuju da je aktivacija NF-kB važna za ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN-a izazvanu ekstraktom CD-a i formiranje koštanih nodula.
Inhibicija gubitka kosti ekstraktom Cistanche deserticola kod miševa sa ovariektomijom
Da bi se ispitao učinak ekstrakta CD-a na gubitak koštane mase, osteoporoza je inducirana kod ženki miševa ovarijektomijom. Kao što se i očekivalo, miševi sa ovariektomijom pokazali su smanjenu ukupnu tjelesnu mineralnu gustinu kostiju i sadržaj minerala u kostima (Slike 6a i 6b). Tretman CD ekstraktom u trajanju od četiri sedmice inhibirao je gubitak mineralne gustine kostiju i mineralnog sadržaja kosti na način ovisan o dozi (Slike 6a i 6b). Koncentracije ALP u krvi mogu odražavati aktivnost osteoblasta.[29] Kao što je prikazano na slici 6c, ekstrakt CD-a inhibirao je smanjenje aktivnosti ALP u serumu izazvano ovarijektomijom. Osim toga, CD ekstrakt je također povećao nivo osteokalcina, markera formiranja kosti, i smanjio nivo C-terminalnih telopeptida kolagena tipa I, markera resorpcije kosti (Slike 6d i 6e). Ovi nalazi stoga podržavaju moć i efikasnost ekstrakta CD-a u prevenciji gubitka kosti in vivo.
Diskusija
Cistanche deserticolaMa, autohtona biljka u Kini, naširoko se koristi u tradicionalnoj medicini za različite terapeutske tretmane zbog svoje sedativne, analgetičke i imunostimulirajuće aktivnosti.[11–15] Ovdje smo pokazali da ekstrakt CD-a izaziva mineralizaciju kostiju u kultiviranim osteoblastima, ali jeste. ne utiču na njihovu ćelijsku migraciju ili proliferaciju. Osim toga, otkrili smo da su ALP, BMP-2 i OPN ciljni proteini signalizacije izazvane ekstraktom CD-a, što zahtijeva aktivaciju ERK, p38, JNK i NF-kB.
Kost je složeno tkivo sastavljeno od nekoliko tipova ćelija koje kontinuirano prolaze kroz proces obnove i popravke.[30] Kada su resorpcija i formiranje kosti neuravnotežene, slom kosti nadjačava formiranje kosti i rezultira osteoporozom.[30] Koristili smo miševe sa ovariektomijom da ispitamo anti-osteoporotski učinak ekstrakta CD-a. Miševi sa ovarijektomijom imali su smanjenu ukupnu tjelesnu mineralnu gustinu kostiju i sadržaj minerala kostiju, što je ublaženo tretmanom CD ekstraktom. Ekstrakt CD-a je takođe povećao nivoe osteogenog markera ALP i osteokalcina u serumu. Stoga je CD sredstvo za formiranje kostiju koje sprječava gubitak koštane mase uzrokovan ovariektomijom in vivo.
Iako mehanizmi osteoporoze nisu sasvim jasni, oni su vjerovatno povezani sa smanjenom dostupnošću ili smanjenim efektima faktora rasta kostiju, kao što su ALP, BMP{0}} i OPN. Ova tri faktora igraju važnu ulogu u procesu formiranja i remodeliranja kostiju,[31] i dobro je dokumentovano da stimulaciju diferencijacije ćelija osteoblasta karakteriše uglavnom povećana ekspresija ALP, BMP-2 i OPN.[32] ] U ovoj studiji smo otkrili da ekstrakt CD-a povećava ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i poboljšava mineralizaciju kostiju. Stoga ekstrakt CD-a dijelom posreduje u formiranju kostiju tako što povećava ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN.
Prijavljeno je da je p38 uključen u regulaciju ekspresije ALP tokom diferencijacije osteoblastičnih ćelija;[33] Slično, ERK1/2 je važan za proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta.[34,35] JNK je uključen u formiranje osteoklasta. .[36] Ovdje smo pokazali da CD ekstrakt inducira ERK, p38 i JNK fosforilaciju, a inhibitori ovih enzima antagoniziraju pojačavanje mineralizacije kosti posredovano ekstraktom CD-a, sugerirajući da aktivacija ERK, p38 i JNK igra obaveznu ulogu u formiranju kosti izazvanom ekstraktom CD-a. osteoblasti. Osim toga, inhibitori enzima i dominantno negativni mutanti ERK, p38 i JNK smanjili su ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN-a pojačanu ekstraktom CD-a. Ovi podaci sugeriraju da je aktivacija ERK, p38 i JNK puteva potrebna za povećanje ekspresije ALP, BMP-2 i OPN-a i sazrijevanje uzrokovano ekstraktom CD-a u osteoblastima. Prijavljeno je da ERK povećava proliferaciju i diferencijaciju osteoblasta.[34,35] Međutim, nismo otkrili efekat CD ekstrakta na proliferaciju osteoblasta. Stoga su drugi putevi mogli suprotstaviti ERK efektu nakon stimulacije CD ekstraktom ili biti neophodni za proliferaciju. S tim u vezi, otkrili smo da inhibitori PI3K i Akt također smanjuju mineralizaciju kostiju izazvanu ekstraktom CD-a i ekspresiju ALP, BMP-2 ili OPN mRNA (podaci nisu prikazani). Stoga, ovi putevi mogu biti potrebni za formiranje kostiju izazvano ekstraktom CD-a.
Pokazalo se da NF-kB kontroliše funkciju osteoblasta u kosti.[37] Rezultati ove studije pokazuju da aktivacija NF-kB doprinosi mineralizaciji kostiju izazvanoj ekstraktom CD-a i ekspresiji ALP, BMP-2 i OPN u kultivisanim osteoblastima i da inhibitori NF-kB-zavisnog signalnog puta (PDTC i TPCK ) inhibirao mineralizaciju kostiju izazvanu ekstraktom CD-a i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. p65 je fosforiliran na Ser536 raznim kinazama u nekoliko signalnih puteva, što povećava potencijal transaktivacije p65.[38] Rezultati ove studije pokazali su da ekstrakt CD-a povećava fosforilaciju p65. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je aktivacija NF-kB potrebna za formiranje kostiju izazvano ekstraktom CD-a u kultiviranim osteoblastima. Također smo otkrili da su inhibitori ERK, p38 i JNK preokrenuli aktivnost NF-kB luciferaze inducirane CD ekstraktom (podaci nisu prikazani), u skladu s tim da su ovi enzimi uzvodni medijatori aktivacije NF-kB izazvane ekstraktom CD-a. Stoga, CD ekstrakt inducira formiranje kosti putem ERK/p38/JNK/ i NF-kB puteva.
Zaključci
Ova studija je pokazala da ekstrakt CD-a izaziva diferencijaciju i sazrijevanje osteoblasta, ali ne i proliferaciju ili migraciju. Ekstrakt CD-a je također povećao ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN i mineralizaciju kostiju. Pokazali smo da su ERK, p38, JNK i NF-kB putevi uključeni u formiranje kosti posredovano ekstraktom CD-a i ekspresiju ALP, BMP-2 i OPN. Nadalje, CD ekstrakt spriječio je in vivo gubitak koštane mase izazvan ovariektomijom. Stoga CD može biti koristan u stimulaciji formiranja kostiju u liječenju osteoporotskih bolesti.
