Procjena toksičnosti ekstrakta cvijeta Dolichandrone Serrulata (DSF) na funkciju bubrega i jetre

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Procjena toksičnosti ekstrakta cvijeta Dolichandrone serrulata na vitalne i reproduktivne organe kod odraslih mužjaka štakora

C. Chaimontria i S. Iamsaard

Abstract

IakoDolichandrone serrulata cvijetPokazalo se da vodeni ekstrakt (DSF) posjeduje farmakološka svojstva, a njegovu sistemsku toksičnost tek treba procijeniti. Ova studija je imala za cilj da istraži subhronični toksični efekat DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt o biohemijskim parametrima i histološkim strukturamajetra, bubreg, testis. i epididimis plus sjemenovod. Odraslim mužjacima štakora je davan DSF (Dolichandrone serrulata cvijet) na 100.300 i 600 mg/kg TM putem oralne sonde tokom 48 uzastopnih dana dok je kontrola primala destilovanu vodu. Na kraju eksperimenta, krv.jetra, bubregSakupljeni su uzorci testisa, epididimisa i sjemenovoda kako bi se utvrdile bilo kakve promjene u biohemijskim komponentama seruma uključujući nivoe ALT, ALP i kreatinina i histološke strukture. Rezultati nisu otkrili značajnu razliku u tjelesnoj težini i potrošnji hrane ili vode između kontrole i DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)-tretirane grupe. Utvrđeno je da DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)značajno povećava težinu epididimisa plus sjemenovoda, dok sebubregijetrapokazalo smanjenje u grupi sa visokim dozama (P vrijednost< 0.05).="" histological="" changes="" in="" these="" vital="" and="" reproductive="" tissues="" including="" fibrosis="" were="" not="" observed="" after="" administration="" but="" alt,="" alp,="" and="" creatinine="" levels="" were="" significantly="" altered="" in="" the="" treated="" groups(pwlue="" <="" 0.051.="" these="" altered="" levels.="" however,="" were="" still="" within="" normal="" ranges="" in="" conclusion,="" these="" findings="" demonstrated="" that="" d.serulata="" flower="" extract="" had="" no="" sub-chronic="" toxicity="" on="" vital="" and="" reproductive="" structures="" but="" slightly="" altered="" some="">funkcije jetre i bubrega.

Kliknite na Cistanches i Cistanche za bolest bubrega

Ključne riječi:Dolichandroneserrulata, jetra, bubreg, testis, epididimis.

1. Uvod

Upotreba ljekovitog bilja u liječenju bolesti je dugogodišnja tradicija. Potencijalna ljekovita svojstva biljaka zavise od vrste i količine njihovih kemijskih spojeva. Poznato je da svaki dio pojedinih ljekovitih biljaka ima različite spojeve. Pored toga, vrsta i količina supstanci mogu varirati u zavisnosti od drugih faktora kao što su biljne vrste, okruženje za sadnju i period berbe (Sringeunyuan i Hongwiset, 1990). Trenutno, vlada Tajlanda promoviše upotrebu ljekovitih biljaka i bilja, koje se smatraju ljekovitim alternativama modernoj zdravstvenoj zaštiti (Sringeunyuan i Hongwiset., 1990.) s obzirom da su biljni proizvodi uglavnom netoksični. Štaviše, biljni tretmani potiču iz lokalnog znanja o tajlandskoj tradicionalnoj medicini. Khae Na orDolichandrone serrulata(iliD.serrulata cvijet(DSF)) je drevna ljekovita biljka za koju se tradicionalno vjeruje da ima mnoga farmakološka svojstva (Sriprasert, 2016). Većina dijelova (cvijet. mahuna, kora i korijen) ove biljke su korisni i konzumiraju se zbog svojih brojnih farmakoloških svojstava (Sriprasert, 2016; Kiratipaiboon et al., 2012). Trenutna studija je otkrila zaštitni efekat DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)protiv reproduktivnog oštećenja kod dijabetičkih štakora (Yannasithinon et al., 2021). Biološka istraživanja metanolnog ekstrakta DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)je pokazao svoje obećavajuće antioksidativno djelovanje (Phanthong et al., 2015.). Utvrđeno je da DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakti su sadržavali šest jedinjenja uključujući haleron, protokatekuinsku kiselinu, rengiolon, kleroindicin B iznutra i izomaltozu (Phanthong et al, 2015). Štaviše, prethodna studija je procijenila fitokemijske profile i biološke aktivnosti DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)etanolni ekstrakti (Sriprasert, 2016). Fitokemijske studije etanolnih ekstrakata iz ove biljke otkrile su sekundarne metabolite kao što su flavonoidi, kumarini, saponini, tanini, terpenoidi, steroidi i srčani glikozidi (Sriprasert,2016). Nedavno je vodeni ekstrakt DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)prijavljeno je da ima antioksidativni kapacitet i monoterpenoide kao što su rengiolon i kleroindicin B (Chaimontriet al., 2021). Međutim, pokazalo se da su neke biljke srodne ovoj D. serrulata toksične za vitalne i reproduktivne organe. Na primjer, vodeni ekstrakt P.alliaceum, ekstrahiran etanolom u studiji akutne toksičnosti, smanjio je sposobnost bijelih krvnih zrnaca (Granados-Echegoyenet al., 2015). Prethodno su Aba i Amadi (2019) izvijestili da ekstrakt voća A. carambola može oštetiti jetreno i bubrežno tkivo. Osim toga, otkriveno je da ginseng može promijeniti parametre krvnog seruma uključujući ALT, ALP i nivoe kreatinina, što ukazuje nadisfunkcije jetre i bubrega(Kim et al. 2013). Štaviše, Azu et al. (2010) izvještavaju da visoke doze ekstrakta voća K. Africana mogu inhibirati spermatogenezu. Uočeno je da kontinuirana konzumacija nedavnih biljnih proizvoda tokom dužeg perioda može oštetiti vitalne i reproduktivne organe (Kiratipaiboon et al, 2012; Freitas et al, 2013; Joshi et al, 2011; Karnati et al, 2013; Lee et al, 2012). Iako DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)se konzumira dugo vremena, toksični efekti njegovog vodenog ekstrakta najetra, bubreg, testis i epididimis tek treba da se procijene. Kako bismo poboljšali naše razumijevanje ovog pitanja, ova studija je nastojala istražiti subkroničnu toksičnost DSF-a. (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakti na vitalnim i reproduktivnim organima kako bi se utvrdila mogućnost bezbednog konzumiranja ove supstance tokom dužeg perioda.

Dolichandrone serrulata cvijet(DSF)

2. Materijali i metode

2.1. Životinje

Četrdeset odraslih mužjaka Sprague-Dawley pacova (120-150g) kupljeno je od Nomura Siam International, Bangkok, Tajland. Životinje su držane u kavezima od nerđajućeg čelika u eksperimentalnim sobnim uslovima (ciklus svjetlo/mrak 12 sati, temperatura 23±2 stepena, vlažnost 40-60 posto, zvuk<85 decibels,="" and="" light="" intensity="" approximately="" 350-400="" lux)in="" the="" northeast="" laboratory="" animal="" center,="" khon="" kaen="" university,="" thailand.="" this="" experimental="" study="" was="" approved="" by="" the="" animal="" ethics="" committee="" research="" of="" northeast="" laboratory="" animal="" center="" khon="" kaen="" university.="" the="" code="" of="" this="" animal="" ethic="" is="">

2.2. Sakupljanje i priprema cvijeta D.serrulata

Biljni primjerci svježe Khae Na prikupljeni su iz podokruga Ban Thum, okruga Mueang, provincije Khon Kaen, Tajland, a autentičnost ih je potvrdio doc. dr Pimwadee Pornpongrungrueng, Odsjek za biologiju, Prirodno-matematički fakultet Univerziteta Khon Kaen (uzorci vaučera D.serrulata, čuvani u herbarijumu KKU sa brojem S.lamsaard02). U ekstrakciji, osušeni DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)je narezan na male komade prije nego što je natopljen i kuhan u destilovanoj vodi na 90-95 stepena 40 min. Vodeni DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt je liofiliziran pomoću liofilizatora (M-00359-1/57,13-1011-18-2019, Labconco, Becthai Scientific Industry, Tajland). Procentualni prinos sirovog DSF ekstrakta bio je 40,78 posto. Ovaj ekstrakt je dobijen od dr. Sitthichai Lamsaarda kao što je prethodno opisano u detaljima ekstrakcije (Chaimontri et al., 2021; Yannasithinon et al, 2021).

2.3. Eksperimentalni dizajn

Nakon 7 dana aklimatizacije, mužjaci pacova su nasumično podijeljeni u 4 grupe (10 pacova po grupi) uključujući kontrolnu, DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)100, DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)300 i DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)600 grupa, respektivno. DSF (Dolichandrone serrulata cvijet) doze ekstrakta su izračunate na osnovu maksimalne doze potrošnje DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)kod osobe prosječne težine 60 kg. Ukratko, doza od 600 mg/kg TM izračunata je iz mogućnosti potrošnje od 40 cvjetova/dan/osobi. Proporcionalni omjeri srednje (300 mg) i najniže (100 mg) doze su izračunati od 600 mg. Za DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)tretirane grupe, pacovi su tretirani DSF-om (Dolichandrone serrulata cvijet)-ekstrakt rastvoren u destilovanoj vodi (DW) u dozama od 100, 300 i 600 mg/kg TM, respektivno, putem oralne sonde. Životinjama u kontrolnoj grupi davana je samo DW. Njihova tjelesna težina je bilježena dnevno tokom primjene tokom 48 uzastopnih dana.

2.4. Biohemijska analiza

Na kraju eksperimenta, svi pacovi su anestezirani tiopental natrijem (60 mg/kg TM preko ip) prije eutanazije cervikalnim dislokacijom. Nakon otvaranja torakalnog zida, krv je sakupljena punkcijom srca i centrifugirana na 12,000 r/minuti 10 minuta na 4 stepena, koristeći mikrocentrifugu (Microfuge 22R Centrifuge, Beckman Coulter TM, USA) za odvajanje krvnih stanica iz seruma. Krvni serum je odmah poslat u imunološku jedinicu, bolnicu Srinagarind, Medicinski fakultet Univerziteta Khon Kaen, Tajland radi određivanja azota uree u krvi (BUN) i kreatinina (zabubregfunkcije)i albumin, aspartat aminotransferaza (AST), alanin aminotransferaza (ALT) i alkalna fosfataza (ALP) (za funkcije jetre). Biohemijski nivoi su određivani korišćenjem elektrohemiluminiscentnog imunoeseja (Roche Diagnostics) sa Cobas i imunološkim analizatorom (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemačka).

2.5. Histološka studija vitalnih organa

Nakon uzimanja krvi,jetra, bubreg, a reproduktivni organi uključujući testis i epididimis brzo su prikupljeni i izvagani. Sva tkiva su fiksirana 10-postotnim rastvorom fiksatora formalina tokom 72 sata. Zatim su obrađeni za rutinske parafinske rezove i obojeni Massonovim trihromnim bojama kako bi se istražio razvoj kolagenih vlakana. Ukratko, isječci tkiva su deparafinizirani ksilenom i rehidrirani serijskim opadajućim alkoholima. Zatim su rezovi uronjeni u Bouin-ov rastvor i obojeni Weigertovim željeznim hematoksilinom. Nakon toga, rezovi su obojeni Massonovim trihromskim kompletima za bojenje (kataloški broj HT15, Sigma-Aldrich, Inc, USA). Konačno, sekcije su isprane sa 1 posto sirćetne kiseline. Histološke promjene vitalnih organa i reproduktivnih organa promatrane su i fotografirane Nikon svjetlosnim mikroskopom ECLIPSE E200 opremljenim digitalnim fotoaparatom DXM1200.

2.6. Statistička analiza

Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost± standardna devijacija (SD). Da bi se uporedile razlike između četiri grupe, korišćena su višestruka poređenja Post Hoc za normalno distribuirane podatke, a razlike podataka su izvedene korišćenjem One Way ANOVA korišćenjem programa SPSS statistika 19.0.2softver (statistički paket za društvene nauke, verzija 19.0.2, SPSS Inc, Armonk, New York, SAD instaliran iz KKUSoftware centra, Khon Kaen univerzitet) za analizu podataka. SPSS program je korišten za ispitivanje značajnih razlika između grupa. P-vrijednost<0.05 was="" considered="" a="" significant="">

3. Rezultati

3.1. Utjecaj ekstrakta cvijeta D.serrulata na tjelesnu težinu, vitalne i reproduktivne organe

Prosječno tijelo promijenilo tijelo, a težina testisa životinja u kontrolnoj i tretiranoj grupi nije pokazala značajnu razliku. Nasuprot tome, težina epididimisa plus sjemenovoda u DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)600 tretirana grupa je značajno povećana u poređenju sa kontrolnom. Unos vode i potrošnja hrane za sve životinje nisu pokazali značajne varijacije (Tabela 1). Zanimljivo, relativne težine odbubregi jetrau DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)300 i 600 tretiranih životinja značajno su smanjene u poređenju sa kontrolom (P < 0,05).

Tabela 1. Poređenje tjelesne težine, testisa, epididimisa plus sjemenovoda, bubrega i težine organa jetre između kontrolne i DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)-liječeni pacovi nakon 48 dana studije subkronične toksičnosti.

3.2. Utjecaj ekstrakta cvijeta D.serrulata na biohemijske parametre

Nakon analize seruma, biohemijski parametri koji ukazuju na funkciju jetre pokazali su da je DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)značajno smanjen nivo alanin aminotransferaze (ALT) i alkalne fosfataze (ALP) u poređenju sa kontrolnom grupom (P<0.05, table="" 2).="" by="" contrast,="" creatinine="" levels="" which="">funkciju bubrega, iz DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)100 i DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)300 grupa je značajno povećano u poređenju sa kontrolnom grupom (P<0.05, table="" 2).="" interestingly,="" no="" difference="" in="" renal="" function="" was="" indicated="" by="" aspartate="" aminotransferase="" (ast),="" albumin,="" and="" blood="" urea="" nitrogen(bun)levels="" in="" all=""> (Dolichandrone serrulata cvijet)tretirane grupe.

Tabela 2. Poređenja nivoa biohemijskih parametara u serumu između kontrolnih i tretiranih pacova nakon 48 dana studije subkronične toksičnosti

3.3.Utjecaj ekstrakta cvijeta D.serrulata na razvoj kolagenih vlakana u testisima, kaudalnom epididimisu, bubrezima i jetri pacova

Presjeci tkiva testisa, kaudalni epididimis,bubreg, i jetraobojeni Massonovim trihomom nisu pokazali razliku u debljini kolagenih vlakana između kontrolnih i tretiranih grupa kao što je prikazano na slikama 1-4. Nasuprot tome, obilna kolagena vlakna i fibroblasti pronađeni su na bazalnoj lamini ispod epitela sjemena (plave strelice na slici 1). Osim toga, kaudalni epididimis pokazuje fina kolagena vlakna zajedno sa tubulnim zidom i intertubularnim prostorima (crne zvijezde na slici 2. ). U bubrezima su kolagena vlakna prisutna u bazalnoj membrani bubrežnih tubula i Bowmanovom prostoru (plave strelice na slici 3). Štaviše, tkivo jetre svih grupa pokazalo je malu količinu kolagenih vlakana oko portalne trijade koja sadrži hepatičnu arteriju, portalnu venu i žučni kanal (plave strelice na slici 4).

Slika 1. Reprezentativna histologija testisa obojenih Massonovim trihomom kontrole: (A), DSF100 (B), DSF300 (C) i DSF600 (D) grupe, respektivno. Crvene strelice=kolagena vlakna; SG=spermatogonija; RS=okrugli spermatid.	Slika 2. Reprezentativna histologija kaudalnog epididimisa obojenog Massonovim trihomom kontrole: (A), DSF100 (B), DSF300 (C) i DSF600 (D) grupe, respektivno. Crne zvjezdice=kolagena vlakna.
Slika 3. Reprezentativna histologija bubrega obojenog Massonovim trihomom kontrole: (A), DSF100 (B), DSF300 (C) i DSF600 (D) grupe, respektivno. Plave strelice=kolagena vlakna; RT=bubrežni tubuli.	Slika 4. Reprezentativna histologija jetre koja prikazuje portalnu trijadu obojenu Massonovim trihomom kontrole: (A), DSF100 (B), DSF300 (C) i DSF600 (D) grupe, respektivno. Plave strelice=kolagena vlakna.

4. Diskusija

Ova studija je pokazala da DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt nije uticao najetra, bubregi strukture reproduktivnih organa nakon primjene 48 dana. Međutim, DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)neznatno izmijenjenfunkcije jetre i bubrega, ali su njihovi nivoi u serumu i dalje bili unutar normalnog raspona u skladu sa standardnim vrijednostima. Prijavljeno je da visoke doze (500 mg/kg TM) iste vrste ove biljke potiskuju proizvodnju sperme (Azuet al., 2010); međutim, visoka doza DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)(600 mg/kg TM) nije promijenila težinu reproduktivnog organa ili histološke strukture. Ovaj rezultat se složio s prethodnom studijom koja je pokazala povećanu koncentraciju i kvalitet sperme u epididimu nakon DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)tretman (Chaimontri et al., 2021). Štaviše, DSF je poboljšao broj spermatozoida i fiziologiju, kao i histopatologiju testisa kod pacova sa dijabetesom tipa 1 (Yannasithinon et al., 2021). Zajedno sa našim rezultatima, ta istraživanja sugeriraju da vodeni DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)Ekstrakt nema subkroničnu toksičnost na muški reproduktivni sistem. Ovo se može objasniti vodenim DSF-om (Dolichandrone serrulata cvijet)pokazuju antioksidativne aktivnosti i sadrže ukupne fenolne sadržaje uključujući terpenoidne komponente (Chaimontri et al., 2021). Zaista, u literaturi se pokazalo da mnogi dijelovi D.serrulata ekstrahovani etanolom ili metanolom imaju antioksidativne kapacitete i supstance kao što su alkaloidi, flavonoidi, glikozidi, fenolna jedinjenja, saponini i tanini (Chatchanayuenyong i Sujayanont, 20 et al, 2018; Kiratipaiboon et al., 2012; Sinaphet et al, 2006; Sittiwet, 2009). Ovi antioksidativni kapaciteti DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)može smanjiti visok nivo brze glukoze u krvi (FBG) i malondialdehida u testisima (MDA) uz povećane nivoe testosterona kod pacova tretiranih sa DM tipa 2 (Yannasithinon et al., 2021).

Prethodne studije su izvijestile o toksičnosti mnogih supstanci uključujući biljne ekstrakte na naslage kolagenih vlakana u dijabetičkim testisima (Ismail et al. 2017), hipertenzivnom epididimisu (Mazen i Zidan, 2017), distribuciji zvjezdastih ćelija jetre (Nishimura et al, 2012; Towne et al., 2015), ihronična bolest bubregapacijenata (Allon et al, 2019). Kao što je pokazano u ovoj nedavnoj studiji, intenzitet kolagenih vlakana prisutnih u testisima, kaudalnom epididimisu, jetri i bubrežnim tkivima obojenim Massonovim trihromom, ne pokazuje razliku između kontrolne i DSF-a. (Dolichandrone serrulata cvijet)grupe tretmana. Ovi rezultati su ukazali da DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt nije inducirao histopatološke fibroze, akumulirana kolagena vlakna, u vitalnim i reproduktivnim tkivima. Ovi rezultati sugeriraju da konzumiranje DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt za subkronični period nije uzrokovao fibrozu u reproduktivnim ili vitalnim organima. Uočeno je da je debljina Bowmanove kapsule među DSF (Dolichandrone serrulata cvijet) tretirane grupe nisu pokazale očigledne promjene u poređenju sa kontrolnom grupom. Osim toga, težine tih organa nisu se značajno razlikovale između grupa, što se slagalo s prethodnom studijom koja je promatrala miševe tretirane tokom perioda akutne toksičnosti (Katisart i Konsue, 2019.).

Jetra i bubrezimikrostrukture nisu pokazale očigledne promjene nakon DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)davanje u bilo kojoj dozi. Međutim, njihove funkcije su neznatno izmijenjene zbog sniženih razina ALT i ATP, dok su razine kreatinina značajno povećane. Takve funkcionalne promjene mogu se objasniti aktivnošću saponina koji se nalazi u DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)sirovi ekstrakt kao što je opisano u prethodnoj studiji (Kiratipaiboon et al. 2012). Ovaj mehanizam može biti sličan onom uočenom u tretmanu sunčanim ginsengom, čiji je sadržaj saponina doveo do promjena parametara krvnog seruma vezanih za jetru ibubregfunkcijakao što su nivoi ALT, ALP i kreatinina (Kim et al.2013). Međutim, takve fiziološke promjene nisu bile dovoljne da ozbiljno oštete jetru ibubregstrukture. Kao što je prikazano u tabeli 2; biohemijski parametri u krvnom serumu iz DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)tretirane grupe su izmijenjene u poređenju sa onima u kontrolnoj skupini, međutim, njihovi nivoi su i dalje bili unutar normalnih granica uključujući ALT[{{0}}U/L], ALP 62-230 U/L] i kreatinin [0.2-0.5 mg/dl kao što je prethodno objavljeno na životinjskom modelu (Hayakawa et al., 2013; Pereira et al., 2017). Kao ograničenje studije, druge toksične supstance u DSF-u (Dolichandrone serrulata cvijet)i apoptotske markere u tkivima treba dalje istražiti kako bi se utvrdila njihova sigurnost za upotrebu i konzumaciju tokom dužeg perioda.

5. Zaključak

Ova studija je pokazala da vodeni DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)Ekstrakt cvijeta nije imao toksičnost na vitalne organe i muško reproduktivno tkivo, ali je izazvao blage promjene nekih parametara zajetra ibubregfunkcija.

6. Budući izgledi

Na osnovu nalaza ovog članka, sigurnost DSF-a (Dolichandrone serrulata cvijet)prikazana je potrošnja tokom dužeg perioda za mikrostrukture bubrega i jetre. Konkretno, DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)pokazalo se da ekstrakt nije toksičan za testise i epididimis. Nadamo se, DSF (Dolichandrone serrulata cvijet)ekstrakt se može dalje razvijati kao dodatak prehrani za reproduktivno zdravlje muškaraca.

Reference

1. ABA, PE i AMADI, AU, 2019. Procjena mogućih hepatotoksičnih i nefrotoksičnih potencijala ekstrakta soka Averrhoa carambola kod ženki albino pacova. Časopis za osnovnu i kliničku fiziologiju i farmakologiju, vol.31,br.1.https:// doi.org/10.1515jbcpp-2019-0042.PMid:31536032.

2. ALLON,M.,LITOVSKY,SH,TEYJ,SUNDBERG,CA,ZHANG,Y,CHEN,Z.,FANG,Y.,CHEUNG,AK.i SHIU,YT,2019.Abnormalnosti vaskularne histologije i konfiguracije kolagenih vlakana u pacijenata sa uznapredovalomhronična bolest bubrega.The Journal of Vascular Access, vol. 20, br.1, str.31-40.http://dx. doi. org/10.1177/1129729818773305.PMid:29742957.

Bilješka:gore navedeno nije potpuna lista referenci