Odnos između ciklooksigenaze (COX-2) i bolesti izazvane hipoksijom

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Intracelularni prostaglandin E2 doprinosi smrti proksimalnih tubularnih ćelija izazvanoj hipoksijom

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J.Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proksimalne tubularne ćelije (PTC) su posebno osjetljive na apoptozu izazvanu hipoksijom, relevantan faktor zabolest bubrega. Ovdje smo pretpostavili da je smrt PTC-a pod hipoksijom posredovana ciklooksigenazom (COX-2) zavisnom proizvodnjom prostaglandina E,(PGE,), što je potvrđeno u ljudskim proksimalnim tubularnim HK-2ćelijama zbog hipoksije (1 posto O,)-indukovana apoptoza (i) je spriječena COX-2(ciklo-oksigenaze) i antagonistima prostaglandinskih (EP) receptora i (ii) je bio povezan s povećanjem intracelularnog PGE, (iPGE,) zbog faktora koji izaziva hipoksiju-1 -zavisnu transkripcijsku regulaciju COX{{3 }}(cyclo-oksigenaza). Apoptoza je također spriječena inhibitorima transportera PGT apsorpcije prostaglandina, što je pokazalo da iPGE doprinosi apoptozi izazvanoj hipoksijom (naprotiv, smrt PTC izazvana hipoksijom/reoksigenacijom bila je isključivo posljedica ekstracelularnog PGE). Stoga je iPGE novi akter u patogenezi tubularne ozljede izazvane hipoksijom, a PGT bi mogao biti novi terapeutski cilj za prevenciju lezija ovisnih o hipoksiji kod bubrežnih bolesti.

Dobro je poznato da je tubularna hipoksija relevantan faktor i za akutnu i za kroničnubolest bubrega'2 Proksimalne tubularne ćelije (PTC) su vrlo aktivne u smislu potrošnje kisika zbog aktivnosti reapsorpcije koje zahtijevaju energiju i, shodno tome, podložne su hipoksiji. Pokazalo se da apoptoza igra značajnu ulogu u kultivisanom PTC-u izloženom hipoksiji, ali signalni putevi odgovorni za aktivaciju apoptotičke mašinerije nisu istraženi. Mi i drugi smo otkrili da prostaglandin E, (PGE,), važan lipidni posrednik brojnih fizioloških i patoloških procesa ububreg, igra relevantnu ulogu u signaliziranju koje dovodi do apoptoze PTC nakon liječenja cisplatinom7, albuminom8 ili leptinom i gentamicinom. U svim slučajevima, utvrđeno je da povećanje PGE zavisi od pojačane ekspresije ciklooksigenaze-2(COX-2)(ciklo-oksigenaza), inducibilni enzim koji je, zajedno sa COX-1l, korak koji ograničava brzinu u sintezi prostaglandina. U ljudskombubreg, bazalni COX{0}}(ciklo-oksigenaza)izraz je manje intenzivan od COX-1. COX-2(ciklo-oksigenaza)je identificiran u podocitima i dijelovima Henleove petlje i bubrežne vaskulature u fiziološkim uslovima10. Međutim, u patološkim stanjima, COX{1}} imunoreaktivnost se može naći u mnogo više tipova ćelija unutarbubreguključujući PTC, i možda doprinosi oštećenju bubrega. Zanimljivo je da hipoksija povećava ekspresiju COX-2(ciklo-oksigenaza)i/ili proizvodnju PGE,12-i7 u mnogim tipovima ćelija. U stvari, ranije smo otkrili da hipoksija povećava intracelularni sadržaj u PGE, kao i njegovo oslobađanje u ekstracelularni medij8. Stoga je teoretski moguće da PGE posreduje u apoptotičkom efektu hipoksije na PTC.

Većina studija o apoptozi zavisnoj od PGE u suštini je bila fokusirana na mehanizme koji uključuju vanćelijski PGE jer je široko prihvaćeno da PGE ispoljava svoje biološke efekte kroz aktivaciju PGE-receptora vezanih za G-protein koji se proteže kroz membranu plazme (E serije prostaglandinskih receptora). EP1-4)1. Ipak, u nekim modelima, intracelularni PGE (iPGE,) je relevantan za apoptotičku smrt ćelije720-22. To implicira da PGE mora ponovo da dopre do intracelularnog medijuma da bi indukovao apoptozu i aktivirao podskup EP receptora, koji se nalaze unutar ćelije (iEP receptori). Pošto zadatak hvatanja PGE uglavnom obavlja transporter za unos prostaglandina (PGT)23-26, inhibicija PGT dovodi do prevencije iPGE posredovane apoptotske ćelijske smrti7.

Uzimajući u obzir ovu pozadinu, u ovom radu proučavali smo da li COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisno povećanje iPGE, nivoi posreduje hipoksijom izazvanu apoptozu u PTC.

Kliknite na organski Cistanche za bolest bubrega

Metode

Reagensi.

AG1478, bromokrezolzelen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, kristalno ljubičasta, rastvor tripan plavog, bromosulfoftalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furil)-1-benzil indazol (YC1), i aktinomicin D su nabavljeni od Sigme (St. Louis, MO, SAD). Z-VAD-FMK i celekoksib su iz Calbiochema (Darmstadt, Njemačka) i Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, SAD), respektivno. TriReagent je kupljen od Vitro (Madrid, Španija), a PVDF membrane i Western blotting luminol reagens su nabavljeni od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA. SAD). ProLong Gold antifade reagens sa 4,6-diamidino{{14 }}Fenil indol (DAPI), aneksin-V-FITC (fluorescein izotiocijanat)/propidijum jodid (PI) komplet za detekciju apoptoze i 2',7'-diklorofluorescein diacetat (DCFH-DA) sonda kupljeni su od Invitrogena (Carlsbad, CA) SAD) i Molecular Probes (Oregon, SAD), respektivno. Antitela su dobijena iz sledećih izvora: anti-PGE i anti-COX-2(ciklo-oksigenaza)antitijela su iz Abcam-a (Cambridge, UK); anti-Bax i anti-Bcl-2 su iz Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA.SAD); anti-HIF-la antitijelo i -rabbit-Alexa-Fluor 488 su iz BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) i Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), respektivno; konjugat anti- -aktina i zečjeg anti-mišjeg IgG peroksidaze je kupljen od Sigme (St.Louis, MO, SAD).

Ćelijska kultura i eksperimentalni uvjeti.

Ljudske proksimalne tubularne HK-2 ćelije su kupljene od American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). Ćelije su održavane u 5 posto CO, na 37 stepeni Cin DMEM/F12 sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg serum (FBS), 1 posto penicilina/streptomicina/amfotericina B i 1 posto glutamina (Invitrogen. Carlsbad, Kalifornija, SAD) i 1 posto insulin-transferin-selen (ThermoFisher. Grand Island, NY, SAD). U svim eksperimentima ćelije postavljeni su na 70-90 posto ušća, a kada su potpuno vezani, uzgajani su u hipoksičnim (1 posto kisika) ili normoksičnim uvjetima (21 posto kisika).Hipoksijaeksperimenti su izvedeni u In vivo200hipoksijaradna stanica (Ruskin Technology, West Yorkshire, Ujedinjeno Kraljevstvo). Zahipoksija/eksperimentima reoksigenacije, ćelije su podvrgnutehipoksijatokom 24 h, a nakon toga ćelije su inkubirane u normoksičnim uslovima do 3 h (period reoksigenacije).

Imunofluorescentna analiza iPGE i Western blot analiza COX-2(ciklo-oksigenaza)i HIF-1 .

Ćelije za imunofluorescentnu analizu i Western blot analizu su podijeljene na staklenim pokrovnim stakalcima (4×104 ćelije/stakleni pokrov) ili u ploče sa šest jažica (15×104 ćelije/bažirić) i inkubirane kako je opisano u "Rezultati". Zatim, imunofluorescencija i imunobloting analiza su izvedeni u suštini kao što je prethodno opisano. Radna razrjeđenja antitela su bila: 1/50 za PGE,,1/1000 za COX-2(ciklo-oksigenaza)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 i 1/5000 za -aktin. Detekcija imunofluorescencije izvedena je pomoću konfokalnog mikroskopa Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka), preko Službe za konfokalnu mikroskopiju (ICTS 'NANBIOSIS'U17) Biomedicinskog istraživačkog centra za bioinženjering, biomaterijale i nanomedicinu (CIBER-BBN na Univerzitet Alcal, Madrid, Španija)

Prolazna transfekcija.

Prolazna transfekcija sa siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Kalifornija), vektorom ekspresije sisara pcDNA3 koji sadrži cDNK divljeg tipa ljudske 15-hidroksi-prostaglandin dehidrogenaze (p15-PGDH) ili luciferazni reporter plazmid konstrukti za ljudski COX-2(ciklo-oksigenaza)phPES{0}}Luc, čovjekhipoksijaelement odgovora (HRE)p9HIF1-Luc i R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) i određivanje aktivnosti luciferaze izvedeni su kao što je opisano na drugom mjestu27,28.

Broj ćelija i morfologija ćelija/jezgra.

Broj adherentnih ćelija određen je spektrofotometrijski modifikovanom metodom kristalno ljubičastog bojenja2. Da bi se otkrili dokazi apoptoze, morfologija stanica je promatrana pomoću fazno-kontrastne mikroskopije. Ćelijska jezgra su vizualizirana nakon bojenja DNK sa DAPI kao što je prethodno opisano0, tipična apoptotička morfologija koja je ispitivana uključivala je ćelijsko skupljanje, nuklearnu kondenzaciju i fragmentaciju, te formiranje apoptotičkih tijela. Za kvantifikaciju, šest polja je ispitano u svakom eksperimentalnom stanju na slijepi način kako bi se procijenio postotak jezgara sa izgledom sličnim apoptozi.

Test apoptoze protočne citometrije i test vitalnosti stanica pomoću testa isključenja tripan plave boje.

Adherentne ćelije na ploči su odvojene tripsinizacijom i, zajedno sa odvojenim ćelijama koje su prethodno izvučene iz medijuma kulture, korišćene su za test.

Annexin-V-FITC/PI komplet za detekciju apoptoze omogućio je detekciju apoptotičkih i nekrotičnih HK-2 ćelija protočnom citometrijom, kao što je prethodno opisano. bojenje. Nekrotične ćelije su bile pozitivne samo na PI, a žive HK-2 ćelije nisu pokazale bojenje.

Test isključenja tripan plave boje korišten je za procjenu vitalnosti stanica. Vibilne ćelije (bijele) i mrtve ćelije (plave) su izbrojane pomoću svjetlosnog mikroskopa i hemocitometra.

Statistička analiza.

Svaki eksperiment je ponovljen najmanje tri puta. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost±SEM. Oni su bili podvrgnuti jednosmjernoj analizi varijanse (ANOVA) nakon čega je uslijedio Bonferonijev test za višestruka poređenja. Nivo značajnosti je postavljen na P manje od ili jednako 0.05.

Rezultati

Hipoksija inducira proksimalne tubularne HK-2 ćelijske smrti.

Hipoksijasmanjio je broj HK-2 ćelija, kako je procijenjen kristalno ljubičastim testom (slika la), a također je inducirao zaokruživanje ćelija i odvajanje od ploče (slika lb, gornji panel). Kao što je očekivano,hipoksijapokrenuo model ćelijske smrti sa jasnim morfološkim karakteristikama apoptoze (vidi nuklearno bojenje sa DAPI na sl. lb, donji panel, lijevo) kao što je skupljanje ćelije uz značajnu nuklearnu kondenzaciju, fragmentaciju i formiranje apoptotičkih tijela.Hipoksija-indukovana apoptoza dodatno je potvrđena povećanjem bojenja aneksinom V-FITC, što je procijenjeno protočnom citometrijom, i njenom prevencijom inhibitorom pan-kapaze Z-VAD-FMK (slika lc).Hipoksijatakođer je utvrdio smanjenje broja živih ćelija, ali nije inducirao statistički značajne promjene u broju nekrotičnih ćelija (slika lc, umetak).

Slika 1. Hipoksija inducira proksimalne tubularne HK{1}} ćelijske smrti.(a) Smanjen broj ćelija (kristalno ljubičasti test). (b) Morfološke karakteristike apoptoze. Reprezentativne fotomikrografije sa faznim kontrastom (gornji panel, originalno uvećanje, 10×) DAPI fotomikrografije za bojenje (donji panel, originalno povećanje, 40×). (c) Povećanje apoptoze (studije protočne citometrije). Aneksin V plus ćelije sadrže Aneksin V plus /propidijum jodid-ćelije (tj. rane apoptotičke ćelije sa očuvanim integritetom plazma membrane) i aneksin V plus /propidijum jodid plus ćelije (tj. ćelije kasne apoptoze). Umetak: Tipovi staničnih populacija (aneksin V-/propidijum jodid plus ćelije su nekrotične ćelije, a aneksin V-/propidijum jodid-su žive ćelije). Rezultati su izraženi u procentima u odnosu na ukupan broj događaja. Opće informacije: (1) Ćelije su inkubirane 24 h u normoksičnim (21 posto O2) ili hipoksičnim (1 posto O,) uslovima, kao što je navedeno u "Metodi?". Inhibitor pan-kapaze Z-VAD-FMK (25 μM) je bio dodano 1 h prije početka izlaganjahipoksija. (2)Mikrofotografije su reprezentativni primjeri tri nezavisna eksperimenta. Trake i trake greške u grafikonima: Svaka traka predstavlja srednju vrijednost±SEM 3 različita eksperimenta *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">hipoksija;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">hipoksijaplus ZVAD.

COX{0}}(ciklo-oksigenaza)/iPGE,/EP receptorski put posreduje proksimalne tubularne HK{0}} ćelijske smrti izazvane hipoksijom.

Kako bi se procijenila uloga COX-2(ciklo-oksigenaza)/iPGE2/EP receptorski put uhipoksija-indukovane HK-2 ćelijske smrti, prvo smo prethodno inkubirali ćelije sa celekoksibom, COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibitor1; AH6809, antagonist EP1, EP2 i EP3 receptora ili GW627368X, antagonist EP4 receptora33; ili sa bromokrezol zelenim ili bromosul-foftal u oba inhibitora PGT435. PGT je također srušen transfekcijom sa siRNA.

Slika 2. COX-2(ciklo-oksigenaza)/iPGE,/EP receptorski put posreduje smrt proksimalnih tubularnih HK-2 ćelija izazvanu hipoksijom.(a) Prevencija ćelijske smrti inhibitorima puta. Gornji panel; Trake pokazuju postotak ukupne stanične smrti (lijevo) ili postotak apoptotičkog aneksina V plus ćelija (desno). Prije izlaganjahipoksija, ćelije su prethodno inkubirane 1 h sa 3 μM celekoksiba (COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibitor）;10 μuM AH6809, (antagonist EP1-3 receptora), 10 μM GW627368X (antagonist EP4 receptora); ili sa 50 μM bromokrezol zelenim (BG) ili 25 μM bromosulfoftaleinom (BrS), dva PGT inhibitora. Donji panel: Lijevo: Prevencija ćelijske smrti obaranjem PGT transfekcijom siRNA (test isključenja tripan plavog). Umetak: Efikasnost uništavanja PGT (Western blot analiza) Desno: Zavisnost od koncentracije preventivnog efekta bromokrezol zelenog (BG). (b) Prevencija ćelijske smrti transfekcijom vektorom ekspresije sisara koji sadrži enzim koji inaktivira prostaglandin 15-hidroksi-prostaglandin dehidrogenazu (15-PGDH) cDNA (test isključenja tripan plave boje). Umetak: Ekspresija {{ 11}}PGDH (Western blot analiza) u transficiranim ćelijama. (c)Hipoksijainducira PGT-osjetljivo povećanje iPGE, lijevo: PGE, ovisna imunofluorescencija sama ili spojena s nuklearnim bojenjem sa DAPI prikazana je (originalno povećanje, 40×) Desno: Kvantitativni pristup slikama predstavljenim na lijevom panelu pomoću softvera Image J. (d) Inhibitor aktivacije EGFR AG1478 ne sprečava smrt HK-2 ćelija EGFR. Ćelije su prethodno inkubirane 1 h sa l μM AG1478 prije nego što su podvrgnutehipoksija. （e） PGT inhibitor BG ne modificira ekspresiju Bax i Bcl-2 u HK-2 ćelijama podhipoksija(Western blot analiza). (f) Sprečavanjehipoksija/reoksigenacijom izazvana ćelijska smrt inhibitorima puta (test isključenja tripan plave boje). Ćelije su prethodno inkubirane sa inhibitorima puta i podvrgnutehipoksijakao u (a). Zatim su ćelije izložene normoksiji 3 h. Opće informacije: (1) Ćelije su inkubirane 24 h u normoksičnim (21 posto O,) ili hipoksičnim (1 posto O,) uvjetima, kao što je navedeno u "Metodi". (2)Mikrofotografije su reprezentativni primjeri tri nezavisna eksperimenta. (3) Rastvarači inhibitora (luL/mL medijum) nisu modifikovali efekathipoksijana smrt ćelije (rezultati nisu prikazani). (4) Western blot analiza: Jednaki protein je potvrđen ispitivanjem sa anti- -aktinom ili anti-GAPDH antitijelom. (5) Trake i trake greške u grafikonima: Svaka traka predstavlja srednju vrijednost±SEM 3 različita eksperimenta.*P<0.01><0.01>hipoksijailihipoksija/reoksigenacija.

Kao što je prikazano na slici 2a,hipoksija-indukovana proksimalna tubularna ćelijska smrt je spriječena u svim slučajevima. Inhibicija apoptoze celekoksibom ukazuje na to da COX-2(ciklo-oksigenaza)igra relevantnu ulogu uhipoksija-indukovana apoptotska smrt ćelije (slika 2a, gornji panel, desno). Tačnije, činjenica da je apoptoza spriječena antagonizmom EP receptora govori da apoptozu posreduje COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisna proizvodnja PGE. S druge strane, najverovatnije je da iPGE doprinosihipoksija-indukovana smrt ćelije HK-2 jer je spriječena; (i) inhibicijom PGT (slika 2a) ili (i) prekomjernom ekspresijom 15-PGDH (slika 2b), koja inaktivira iPGE2 kroz svoj oksidacija25 (treba napomenuti da je sam postupak transfekcije povećao osjetljivost HK-2 ćelija nahipoksija: ćelijska smrt je bila 45-55 posto za transfekciju u kontrolnim uslovima u poređenju sa 15-20 posto u netransficiranim ćelijama). Dalja podrška doprinosu iPGE-a, zahipoksija-indukovana HK{1}} ćelijska smrt, naši su prethodni nalazihipoksijaodređuje povećanje ćelijskog sadržaja iPGE,1 i da je to povećanje spriječeno PGT inhibitorima (slika 2c).

MAPK signalni putevi mogu inducirati apoptozu. Budući da iEP receptori transaktiviraju receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR)36, što dovodi do aktivacije MAP kinaza ERK1/2 i p38 u HK-2 ćelijama0, pitali smo da li pre -spriječena inkubacija HK{7}} ćelija sa inhibitorom EGFR aktivacije AG1478hipoksija-indukovana ćelijska smrt. Pronašli smo negativne rezultate (slika 2d) i stoga je malo vjerovatno da transaktivacija EGFR posreduje smrt HK-2 ćelije podhipoksija.

U nekoliko eksperimentalnih modela, smanjenje mitohondrijalnog ATP-a tokomhipoksijauzrokuje povećanje ekspresijskog omjera pro-apoptotičkog proteina Bax i anti-apoptotičkog proteina Bcl-2, što dovodi do oslobađanja citokroma C u citosol, aktivacije kaspaze 9 i naknadnog cijepanja i aktivacije nizvodnog efektora caspases37,38. Međutim, pre-inkubacija sa PGT inhibitorom BG u HK-2 ćelijama podhipoksijanije rezultiralo promjenama kompatibilnim sa anti-apoptotičkim pomakom u ravnoteži između ekspresije Bc-2 i Bax(Sl.2e), što ne podržava ulogu ovih proteina u HK-2 ćeliji smrt ispodhipoksija.

Nakon hipoksične izloženosti, epizode reoksigenacije (ishemija/reperfuzijska ozljeda) mogu izazvati dodatno oštećenje stanica. "Paradoks" povrede reoksigenacije može se shvatiti uzimajući u obzir da ćelije prolaze kroz specifične promjene u aktivnostima enzima, mitohondrijalnoj funkciji, strukturi citoskeleta, membranskom transportu i antioksidantnoj odbrani kao odgovor nahipoksija, što onda zajedno predisponira za ozljedu reoksigenacije39. Reoksigenacija doprinosi akutnoj ozljedi bubrega tijekom ishemijskog moždanog udara, transplantacije bubrega, zatajenja cirkulacije ili bubrežne i kardiovaskularne operacije. U ovom kontekstu, potencijalna terapijska vrijednost inhibicijehipoksija/reoksigenacijom izazvana smrt proksimalnih tubularnih ćelija kroz intervenciju u COX-2(ciklo-oksigenaza)/iPGE,/iEP receptorski put je evidentan. Stoga smo pitali da li iPGE specifično posredujehipoksija-indukovana ćelijska smrt ili takođe posredujehipoksija/smrt izazvana reoksigenacijom (in vitro model koji oponaša in vivo bubrežnu ishemiju/reperfuzijsku ozljedu). Kao što je prikazano na Sl.2f, ćelijska smrt (kako je procijenjena testom isključenja tripan plavog) je spriječena COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibitor celekoksiba kao i antagonisti EP receptora AH6809 ili GW627368X. Kao i na slici 2a, ovi rezultati sugeriraju da COX-2 igra relevantnu uloguhipoksija/ćelijska smrt izazvana reoksigenacijom i, preciznije, ta ćelijska smrt je posredovana COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisna proizvodnja PGE, jer je spriječena antagonizmom EP receptora. Međutim, budući da smrt ćelije nisu spriječili PGT inhibitori bromokrezol zeleni ili bromosulfoftalein (slika 2f i dodatna slika 2d), vjerovatnije je dahipoksija/reoksigenacijom indukovana HK-2 ćelijska smrt je posredovana isključivo ekstracelularnim PGE.

HIF-1 -zavisna regulacija transkripcije COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija gena doprinosi ahipoksija-indukovano povećanje iPGE, u proksimalnim tubularnim HK-2 ćelijama. PGE, biosinteza uključuje oslobađanje iz membranskih glicerofosfolipida arahidonske kiseline pomoću fosfolipaze A, nakon čega slijedi konverzija COX izoenzima arahidonske kiseline u prostaglandin H, i, konačno, izomerizacija proste žlijezde u H, u PGE, od strane prostaglandina E. kao što je mikrosomalna PGE sintaza-1 (mPGES-1)19. To smo našlihipoksija-indukovana apoptoza u HK-2 ćelijama je najvjerovatnije posredovana COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisno povećanje proizvodnje PGE,(Sl.2). S obzirom da COX-2(ciklo-oksigenaza)je enzim čija ekspresija može biti izazvanahipoksija, pretpostavili smo da ahipoksija-indukovano povećanje PGE, proizvodnja u HK-2 ćelijama može biti posljedica povećanja ekspresije COX-2(ciklo-oksigenaza). Kako bismo potvrdili našu hipotezu, proučavali smo (i)učinakhipoksijao izrazu COX-2(ciklo-oksigenaza)protein i mRNA i (ii) efekat COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibitor celekoksiba nahipoksija-indukovano povećanje iPGE, naši rezultati su to pokazalihipoksijaodređena na prolazan način transkripcijska regulacija COX-2(ciklo-oksigenaza)izraz (slika 3a,b) i da COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibicija je smanjila povećanje iPGE, u HK-2 ćelijama ispodhipoksija(Sl.3c). Zanimljivo,hipoksijatakođer je odredio prolaznu regulaciju ekspresije mPGES-1 proteina (Slika, 3a, umetak), ali nije utjecao na ekspresiju mPGES-1 mRNA (Slika, 3b. umetak). Ovi rezultati su pokazali da povećana ekspresija COX-2(ciklo-oksigenaza)a mPGES-1 je odgovoran zahipoksija-indukovano povećanje iPGE.

Slika 3. HIF-la-zavisna transkripcijska regulacija COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija gena doprinosi povećanju iPGE izazvanom hipoksijom, u proksimalnim tubularnim HK-2 ćelijama.(a)Izraz COX-2(ciklo-oksigenaza)proteina se prolazno povećava zahipoksija(Western blot analiza). Umetak: Ekspresija mPGES-1 proteina je također prolazno reguliranahipoksija. (b)Izraz COX-2(ciklo-oksigenaza)mRNA se prolazno povećava zahipoksija. Umetak: na ekspresiju mPGES-1 mRNA ne utičehipoksija. (c) Prevencija celekoksibom, COX-2(ciklo-oksigenaza)inhibitor povećanja iPGE-a izazvanoghipoksija. Ćelije su prethodno inkubirane 1 h sa 3 μM celekoksiba. Prikazana je lijeva∶PGE, imunofluorescencija zavisna sama ili spojena s nuklearnim bojenjem sa DAPI (originalno povećanje, 40×). Desno: Kvantitativni pristup slikama predstavljenim na lijevom panelu pomoću softvera Image J. (d) Doprinos transkripcionih mehanizama. Lijevo: Inhibitor transkripcije aktinomicin D (Akt. D) sprječava ahipoksija-indukovano povećanje COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija proteina (Western blot analiza). Ćelije su prethodno tretirane za lh sa 1 ug/ml Act. D prije izlaganjahipoksijaza 3 h. Desno: povećanje aktivnosti COX-2(ciklo-oksigenaza)reporterska konstrukcija. (e) Inhibitor HIF-la YC-1 sprečavahipoksija-induciran transkripcijski COX-2(ciklo-oksigenaza)up-regulation. Ćelije su prethodno inkubirane 1 h sa 0.5 uM YC-1. Lijevo: Prevencija COX-2(ciklo-oksigenaza)up-regulation. Ćelije su bile izloženehipoksijaza 8 h. Centar: Prevencija povećanja aktivnosti COX-2(ciklo-oksigenaza)reporterska konstrukcija. Desno: Inhibicija aktivnosti reporterske konstrukcije koju vodi HRE. Ćelije su bile izloženehipoksijatokom 8 h. (f) HIF-la inhibitor YC-1 povećava apoptotičku smrt ćelije (studije protočne citometrije). Prije izlaganjahipoksija, ćelije su prethodno inkubirane 1 h sa 0.5 μM YC-1. Inset∶ YC-1 inhibirahipoksija-indukovano povećanje HIF-1a ekspresije (Western blot analiza). Opšte informacije: (1) Ćelije su inkubirane 24 h u normoksičnim (21 posto O,) ili hipoksičnim (1 posto O,) uslovima, kao što je navedeno u "Metodi". (2)Mikrofotografije su reprezentativni primjeri tri nezavisna eksperimenta. (3) Western blot analiza: Jednaki protein je potvrđen ispitivanjem sa anti- - antitijelom (4) Trake i trake greške u grafikonima: Svaka traka predstavlja srednju vrijednost±SEM 3 različita eksperimenta *P<0.01 vs.="" other="">

Da se dalje ispita doprinos transkripcijskih mehanizama povećanju COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija proteina ispodhipoksija, izraz COX-2(ciklo-oksigenaza)je procijenjen u HK-2 ćelijama, koje su prethodno inkubirane sa inhibitorom transkripcije aktinomicinom D prije nego što su podvrgnutehipoksijaza 5 h. Kao što je prikazano na sl.3d,hipoksija-indukovano povećanje COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija proteina je spriječena aktinomicinom D. Nadalje,hipoksijatakođer utvrdio povećanje aktivnosti COX-2(ciklo-oksigenaza)promotorski konstrukt prethodno transficiran u HK-2 ćelijama (slika 3d desno). Uzeti zajedno, rezultati prikazani na slici 3d sugeriraju da transkripcijski mehanizmi doprinose ahipoksija-indukovano povećanje COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija proteina. Ipak, došlo je do neslaganja između vremena aktivacije COX-2 promotora i vremena maksimalnog COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija mRNA: dok prolazno povećanje COX-2(ciklo-oksigenaza)Ekspresija mRNA je bila maksimalna nakon 2 h (Sl.3b), COX-2 promotor je aktiviran nakon 3 h (Sl.3d), što vjerovatno odražava doprinos post-transkripcijskih mehanizama povećanju COX{{6 }}(cyclo-oxygenase)izraz4. Shodno tome, nagađamo da COX-2(ciklo-oksigenaza)mRNA je stabilizovana podhipoksija, što bi rezultiralo povećanim nivoima COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija mRNA bez ikakvog doprinosa (u tom trenutku) povećane aktivnosti COX-2(ciklo-oksigenaza)promoter. Međutim, također je moguće da vremenski razmak između aktivacije promotora i akumulacije mjerljivog supstrata također može doprinijeti neskladu između vremena aktivacije COX-2 promotora i vremena maksimalnog COX{{1 }}(ciklo-oksigenaza)ekspresija mRNA.

HIF-1 je heterodimerni transkripcijski faktor koji se sastoji od -podjedinice zavisne od kiseonika i konstitutivno eksprimirane -podjedinice. Ispodhipoksija, HIF-l se akumulira i ulazi u jezgro, gdje generiše faktor transkripcije HIF-1 nakon dimerizacije sa HIF-1 . HIF-1 zatim promovira ekspresiju svojih ciljnih gena vezivanjem zahipoksija-reagirajući elementi (HRE) prisutni u svom regulatornom području i nakon toga orkestriraju ćelijske adaptivne odgovore na borbuhipoksija 3. S obzirom na tohipoksijamože aktivirati COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresije na HIF-1-zavisan način kroz funkcionalni HRE prisutan u COX-2 promotorskoj sekvenci2, ispitali smo ulogu HIF-l uhipoksija-indukovano povećanje COX-2(ciklo-oksigenaza)izraz. Također smo pogledali aktivnost COX-2 promotorske konstrukcije transficirane u HK-2 ćelijama. Kao što je prikazano na slici 3e, pre-inkubacija sa HIF-1inhibitorom YC-1, koji je otupiohipoksija-indukovano povećanje ekspresije HIF-la i aktivnosti HRE reporterske konstrukcije, rezultiralo je prevencijom povećanja ekspresije oba COX-a-2(ciklo-oksigenaza)i aktivnosti COX-2(ciklo-oksigenaza)promotorska konstrukcija u HK-2 podvrgnutahipoksija. Ukratko, rezultati prikazani na slici 3a-e podržavaju ideju da HIF-1 -zavisna transkripcijska regulacija COX-2(ciklo-oksigenaza)je odgovoran zahipoksija-indukovano povećanje iPGE2.

Iako su posljedice aktivacije HIF-1a nahipoksija-indukovane apoptoze su kontroverzne (vjerovatno zato što mogu biti zavisne od konteksta), analizirali smo (preliminarno) ulogu HIF-1a u našem eksperimentalnom sistemu. Pošto smo ranije otkrili da je intervencija u COX-2(ciklo-oksigenaza)/iPGE, put EP receptora inhibira povećanje ekspresije HIF-la izazvanohipoksija8,56 pitali smo da li inhibicija HIF-la dovodi do prevencijehipoksija-indukovana apoptoza HK-2 ćelija. Kao što je prikazano na slici 3f, pre-inkubacija sa YC-1, inhibitorom HIF-l, je zapravo povećanahipoksija-indukovana apoptoza. Stoga je malo vjerovatno da će HlF-la

Diskusija

Tkivohipoksijasmatra se da je kritično relevantan u patofiziologiji i kronične bolesti bubrega i akutne ozljede bubrega, budući da je PTC najosjetljiviji dio bubrežnih tubula protivhipoksija. Ovdje smo ispitali ulogu PGE, u šteti koju su nanijelihipoksijana ljudski PTC i otkrili da povećana proizvodnja iPGE potiče od HIF-la-zavisne up-regulacije COX-2(ciklo-oksigenaza)ekspresija gena i povećana ekspresija mPGES-1, doprinosihipoksija-indukovana apoptotska smrt ćelija u HK-2 ćelijama. S obzirom da je tubularna hipoksija relevantan faktor i za akutnu i za hroničnu bolest bubrega-2, ovi rezultati ističu prostaglandinski transporter PGT kao novi terapeutski cilj kod bubrežnih bolesti.

Hipoksijane samo da povećava iPGE već i njegovo oslobađanje u ekstracelularni medij8 tako da izlučeni (vanćelijski) PGE također može igrati ulogu uhipoksija-indukovana apoptoza (na primjer, pokretanje apoptotičkih kaskada kroz kanonsku aktivaciju EP receptora koji se nalaze na ćelijskoj membrani). Dvije prethodne studije su pokazale da ćelijska smrt podhipoksijatakođer zbog COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisna proizvodnja PGE,1345. S druge strane, u određenim tipovima ćelija (fibroblasti, mikroglija, neuroni i ćelijske linije akutne limfoblastne leukemije), PGE.-indukovana apoptoza je posredovana PGE, ovisnom aktivacijom EP-receptora46-48. To smo našli ovdehipoksija-indukovana apoptoza HK-2 ćelija je spriječena i antagonizmom EP receptora (slika 2a, gornji panel, desno). Ali pošto su EP receptori klasično opisani kao receptori plazma membrane - tako da su nedostupni za iPGE2-, nagađamo da su EP receptori koji posreduju apoptotički efekat iPGE, u hipoksičnim HK-2 ćelijama podskup lociran intracelularno (tj. iEP receptori).

Za razliku od uloge iPGE2 uhipoksija-indukovane apoptoze u HK-2 ćelijama, otkrili smo da samo ekstracelularni PGE posredujehipoksija/reoksigenacijom indukovana smrt HK-2 ćelija jer je nisu sprečili inhibitori PGT (slika 2f). Iako su patološki mehanizmi stanične ozljede nakonhipoksija/reoksigenacija nisu u potpunosti shvaćeni, prihvaćeno je da ćelijska smrt u velikoj mjeri nastaje kroz proizvodnju prekomjernih reaktivnih vrsta kisika (ROS). Ovo posebno vrijedi za HK-2 ćelije49,50. Međutim, iakohipoksijamože također povećati proizvodnju ROS-a, koliko nam je poznato, nema dokaza da ROS igra važnu ulogu uhipoksija-indukovana smrt HK-2 ćelija. Ovo sugerira da su smrtonosni efekti hipoksije i hipoksije/reoksigenacije u HK-2 ćelijama posredovani različitim mehanizmima, što bi moglo objasniti zašto BG i BS štite odhipoksijaali ne protivhipoksija/reoksigenacija. Shodno tome, inhibicija PGT-a može pružiti terapeutske prednosti u PTC-u protiv oštećenja ćelija izazvanih hipoksijom, ali ne i protiv štetnog efektahipoksija/reoksigenacija.

HIF-1 -zavisna regulacija COX-2(ciklo-oksigenaza)bio kritičan događaj zahipoksija-indukovana apoptoza HK-2 ćelija (slika 3e). Međutim, naše zapažanje da HIF inhibitor YC-1 pojačava apoptotičku smrt ćelija (slika 3f) je zbunjujuće, iako su prethodni izvještaji već pokazali slične rezultate1. Jedno od mogućih objašnjenja je hipotetički scenario u kojem HIF-la ne samo da posreduje u pro-apoptotičkoj regulaciji COX-2(ciklo-oksigenaza)ali i povećanje regulacije zaštitnih molekula. Zaista, HIF-1-reguliše ekspresiju zaštitnih molekula protivhipoksijakao što je duga nekodirajuća RNK DARS-AS1' i mikroRNA-2103 je specifično pronađena u HK-2 ćelijama. Međutim, iako ovi dokazi podržavaju naš hipotetski scenarij, potrebno je provesti specifične eksperimente kako bi se to potvrdilo.

Ispitivanje odgovora bubrežnih ćelija nahipoksijamože poboljšati naše razumijevanje bubrežne patologije. Proučavali smo, iako preliminarno, ulogu povećanja ekspresijskog odnosa pro-apoptotičkog proteina Bax prema anti-apoptotičkom proteinu Bcl-2 uhipoksija-indukovana apoptoza u HK-2 ćelijama. Naši rezultati su pokazali da inhibicija PGL nije rezultirala promjenama kompatibilnim sa anti-apoptotičkim pomakom u ravnoteži između ekspresije Bcl-2 i Bax(Sl.2e), što ne podržava ulogu ovih proteina u iPGE-ovisna smrt HK-2 ćelija ispodhipoksija. Koliko nam je poznato, postoje samo dvije studije o implikaciji Bcl{0}}/Bax ose u hipoksijom izazvanoj apoptozi u PTC-u i obje su uključivale anoksične" ili skoro anoksične O, koncentracije5 Kada je PTC bio izložen 0,2 posto O., ekspresija Baxa je ostala nepromijenjena i apoptoza je bila povezana sa smanjenim stepenom ekspresije Bcl-2. Međutim, ekspresija Bcl-2 nije bila pod utjecajem 1 posto O, uprkos prisustvo apoptoze, što se poklapa sa našim rezultatima.Stoga treba uzeti u obzir druge mehanizme koji ne uključuju nužno kvantitativne promjene u Bcl-2 ili Bax ekspresiji: na primjer, indukcija apoptoze u kultiviranim ćelijama glioma pomoću iPGE2 zahtijeva samo njegova fizička povezanost sa Baxom, što pokreće translokaciju Baxa u mitohondrije 202. Stoga mehanizam putem kojeg iPGE doprinosi apoptozi HK{11}} ćelija zaslužuje dalje proučavanje.

Naša grupa je otkrila da COX-2(ciklo-oksigenaza)-zavisno povećanje iPGE, posreduje apoptotičku smrt u HK-2 ćelijama izloženim cisplatinu, apoptotičkim tijelima7" ihipoksija(naši trenutni rezultati). Budući da se PGE brzo oslobađa van ćelije nakon svnteze2, njegov unutrašnji transport putem PGl igra ključnu ulogu u iPGE, induciranoj apoptozi u HK-2 ćelijama. Stoga, kad god je oštećenje PTC posredovano iPGE, liječenje inhibitorima PGT može biti koristan terapijski pristup s potencijalnim primjenama kao što je prevencija oštećenja PTC izazvanog cisplatinom, inhibicija širenja tubularne ozljede kroz apoptotska tijela ili ograničavanje štetan efekat odhipoksijana PTC.