Inhibicija trombocita sprječava aktivaciju inflamasoma NLRP3 i ozljedu bubrega uzrokovanu sepsom
Mar 28, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Marivee Borges-Rodriguez, et al
sažetak:
Trombociti, ćelijski posrednici tromboze, aktiviraju se tokom sepse i sve više se prepoznaju kao posrednici imunološkog odgovora. Aktivacija trombocita je značajno povećana kod pacijenata sa sepsom u odnosu na kontrolne pacijente na intenzivnoj nezi. Uprkos ovoj korelaciji, uloga aktiviranih trombocita u doprinosu patofiziologiji sepse ostaje nejasna. Prethodno smo demonstrirali aktivaciju inflamasoma inflamasoma proteina 3 receptora sličnog NOD receptoru (NLRP3) u trombocitima izazvanim sepsom kod pacova punkcije cekalne ligacije (CLP). Aktivirani trombociti su bili povezani sa povećanim plućnim edemom i glomerularnom ozljedom u CLP u odnosu na SHAM kontrolne skupine. U ovoj studiji smo istražili da li bi inhibicija aktivacije trombocita ublažila aktivaciju NLRP3 i ozljedu bubrega i pluća kao odgovor na CLP. CLP je izveden na mužjacima i ženkama Sprague Dawley (SD) pacova (n=10/grupi) da bi se izazvala abdominalna sepsa, a SHAM pacovi su služili kao kontrola. Podskup CLPanimals je liječen klopidogrelom (10 mg/kg/dan, CLP plus CLOP) kako bi se inhibirala aktivacija trombocita. 72 h nakon CLP-a procijenjeni su aktivacija trombocita i NLRP3 inflamasomski sklop, IL-1 i IL-18 su izmjereni u plazmi, a procijenjeni su tkiva, bubrežna i plućna patologija i bubrežna funkcija. Aktiviranih trombocita bilo je 7,8 ± 3,6 posto u Sham, 22 ± 6 posto u CLP i značajno smanjeno na 14,5 ± 0,6 posto u CLP plus CLOP (n=8-10/grupi, p < 0,05)="" .="" sklop="" nlrp3="" inflamasoma="" je="" inhibiran="" u="" trombocitima="" clp="" plus="" clop="" životinja="" u="" odnosu="" na="" clp.="" značajno="" povećanje="" il-1="" i="" il-18="" u="" plazmi="" i="" bubrezima="" kao="" odgovor="" na="" clp="" smanjeno="" je="" liječenjem="" klopidogrelom.="" povreda="" bubrega,="" ali="" ne="" i="" histologija="" pluća="" ili="" bubrežna="" funkcija="" je="" poboljšana="" u="" clp="" plus="" clop="" u="" odnosu="" na="" clp.="" ovi="" podaci="" pružaju="" dokaz="" da="" aktivirani="" trombociti="" mogu="" doprinijeti="" oštećenju="" bubrega="" uzrokovanom="" sepsom,="" vjerovatno="" putem="" aktivacije="" nlrp3="" u="" trombocitima.="" trombociti="" mogu="" biti="" terapijski="" cilj="" za="" smanjenje="" oštećenja="" bubrega="" kod="" septičkih="">
Ključne riječi:sepsa; NLRP3; trombociti; Clopidogrel; multiorganska povreda; aktivacija endotela;upala
ekstrakt cistanche tubolosa : protiv upala
1. Uvod
Sepsa je po život opasan disregulirani upalni odgovor domaćina na infektivni agens [1] i jedan je od vodećih uzroka smrti u svijetu. Najmanje 1,7 miliona odraslih u Americi razvije sepsu, a skoro 270,000 Amerikanaca godišnje umire od posljedica sepse [2]. Sepsa dovodi do multiorganske disfunkcije uključujući akutnu ozljedu pluća (ALI) [3],akutnabubregpovreda(AKI) [4,5], hematološka disfunkcija i disfunkcija centralnog nervnog sistema, između ostalog. Sve veći broj organa uključenih u sepsu povezan je sa povećanom smrtnošću [6]. Trenutni modaliteti liječenja fokusirani su na potpornu njegu; međutim, smrtnost je i dalje visoka. Prijavljeno je da je otprilike 35 do 50 posto smrtnih slučajeva u bolnici uzrokovano sepsom [7]. Ključno je identificirati terapijski cilj koji može poboljšati smrtnost zbog sepse.
Trombociti su prepoznali kao ulogu u imunitetu [8,9], osim uloge u hemostazi i trombozi. Trombocitopenija se često viđa kod sepse i smatra se da se javlja zbog aktivacije i konzumiranja trombocita; međutim, njegova uloga u procesu bolesti ostaje nejasna. Trombocitopenija je povezana sa razvojem (višeorganske insuficijencije) MOF i povećanim 90-dnevnim mortalitetom [10–14]. Trombociti mogu biti sastavni dio upalnog odgovora na sepsu. Potencijalni mehanizam pomoću kojeg trombociti mogu doprinijeti multiorganskim ozljedama je aktivacija NOD-like receptor proteina 3 inflamasoma (NLRP3). NLRP3 je citosolni imunološki signalni receptor koji dovodi do cijepanja posredovanog kaspazom-1 i aktivacije IL-1B i IL-18 i uključen je u patogenezu upalnih procesa bolesti poput astme [15 ], Parkinsonova bolest [16], inflamatorna bolest crijeva [17] i sepsa [18]. Pokazalo se da inhibicija sklopa inflamasoma NLRP3 štiti od povrede organa izazvane sepsom [19–23]. Prethodno smo pokazali da se inflamasom NLRP3 aktivira u trombocitima kao odgovor na punkciju cekalne ligacije (CLP) i da je povezan s višeorganskim ozljedama kao odgovor na polimikrobnu sepsu u 72 h CLP pacovskom modelu. U ovoj studiji pretpostavili smo da bi blokiranje aktivacije trombocita klopidogrelom (CLOP) smanjilo aktivaciju inflamasoma NLRP3, ozljedu bubrega i pluća kao odgovor na polimikrobnu sepsu.
cistanche flavonoidi: protiv upale
2. Rezultati
2.1. Aktivacija ploče i sklop NLRP3 inflamamasoma
Koristeći protočnu citometriju, odredili smo postotak aktivacije trombocita među grupama. Otkrili smo da je aktivacija trombocita povećana kod CLP štakora za 22 ± 6 posto, u poređenju sa SHAM 7,8 ± 3,6 posto (p < 0.{{10}}}5),="" i="" oslabljena="" u="" clp-u="" plus="" clop="" štakori="" za="" 14,5="" ±="" 0,6="" posto="" (p="">< 0,05,="" slika="" 1).="" sklapanje="" inflamasoma="" nlrp3="" u="" trombocitima="" procijenjeno="" je="" vizualizacijom="" ko-lokalizacije="" nlrp3="" s="" proteinom="" nalik="" na="" tačkice="" (asc)="" povezanim="" s="" apoptozom="" korištenjem="" imunocitokemije="" (slika="" 2).="" ko-lokalizacija="" komponenti="" inflamasoma="" u="" clp="" trombocitima="" bila="" je="" 83="" puta="" veća="" u="" poređenju="" sa="" sham="" trombocitima="" (slika="" 2c).="" štaviše,="" sklapanje="" inflamasoma="" je="" smanjeno="" u="" trombocitima="" clp="" plus="" clop="" u="" poređenju="" sa="">
2.2. Citokini povezani sa inflamazomom
Aktivacija NLRP3 rezultira oslobađanjem proinflamatornih citokina IL-1 i IL-18 u njihove aktivne oblike. Izmjerili smo oba citokina u plazmi,pluća, ibubreghomogenatiSHAM, CLP i CLP plus CLOP putem ELISA. IL u plazmi{{0}} značajno je povećan sa 9 ± 21 pg/mL u Sham na 77 ± 31 pg/mL u CLP (p < {{10}}.0="" 5,="" slika="" 3a).="" primjena="" klopidogrela="" pokazala="" je="" smanjenje="" il-1="" 48="" u="" plazmi="" ±="" 38="" pg/ml;="" međutim,="" smanjenje="" nije="" bilo="" statistički="" značajno="" u="" poređenju="" sa="" clp-om="" (p="">< 0.05="" u="" odnosu="" na="" sham).="" slično,="" bubrežni="" il-1="" je="" bio="" povišen="" u="" clp="" 4="" ±="" 3="" pg/mg,="" u="" poređenju="" sa="" sham="" 2,5="" ±="" 0,9="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" slika="" 3b).="" liječenje="" klopidogrelom="" značajno="" je="" smanjilo="" bubrežni="" il-1="" na="" 1,8="" ±="" 0,8="" pg/mg="" (p="">< 0,05).="" u="" plućima,="" il-1="" je="" značajno="" povećan="" sa="" 70="" ±="" 16="" pg/mg="" u="" sham="" na="" 106="" ±="" 36="" pg/mg="" u="" clp="" (p="">< 0,05)="" i="" nije="" se="" značajno="" razlikovao="" kod="" životinja="" tretiranih="" klopidogrelom="" (80="" ±="" 23="" pg="" g,="" slika="">
IL{{0}} u plazmi nije detektovan kod SHAM štakora; međutim, prosječni IL-18 u plazmi bio je 26 ± 6 pg/mL u CLP. Važno je da je primjena klopidogrela rezultirala nižim nivoima IL-18 u plazmi (12 ± 9 pg/mL; p < 0.{{20}}5,="" slika="" 3d).="" slično,="" bubrežni="" il{{10}}="" je="" bio="" povišen="" u="" clp="" (396="" ±="" 65="" pg/mg)="" u="" poređenju="" sa="" sham="" (317="" ±="" 73="" pg/mg;="" p="">< 0,05).="" liječenje="" klopidogrelom="" smanjilo="" je="" bubrežni="" il-18="" na="" 214="" ±="" 70="" pg/mg="" (p="">< 0,05,="" slika="" 3e).="" u="" plućima,="" il-18="" je="" značajno="" povećan="" sa="" 704="" ±="" 219="" pg/mg="" u="" sham="" na="" 999="" ±="" 158="" pg/mg="" u="" clp="" (p="">< 0,05)="" i="" ostao="" je="" povišen="" kod="" životinja="" tretiranih="" klopidogrelom="" 1014="" ±="" 235="" pg/mg="" (pg/mg).="" p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" sham,="" slika="">
2.3. Endotelna aktivacija
Izmjerili smo nivoe angiopoetina{{0}} i endokana u plazmi kao markera aktivacije endotela u Sham, CLP i CLP plus CLOP grupama putem ELISA-e. Endokan plazme je značajno povećan sa 1234 ± 327 pg/mL u Sham na 1978 ± 306 pg/mL u CLP (p < {{20}}.05="" u="" odnosu="" na="" sham).="" endokan="" je="" značajno="" smanjen="" na="" 1521="" ±="" 283="" pg/ml="" kod="" pacova="" tretiranih="" clopidogrelom="" (p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" clp,="" slika="" 4a).="" slični="" rezultati="" su="" pronađeni="" za="" angiopoetin-2.="" angiopoetin{13}}="" je="" značajno="" povećan="" sa="" 5603="" ±="" 2142="" pg/ml="" u="" sham="" na="" 56,767="" ±="" 40,000="" pg/ml="" u="" clp="" (p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" sham)="" i="" značajno="" je="" smanjen="" kod="" pacova="" tretiranih="" clopidogrel="" do="" 22,486="" ±="" 13,616="" pg/ml="" (p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" clp,="" slika="">
2.4. Povreda pluća
Histološka analiza pluća iz svake grupe pokazala je značajno povećanje infiltracije neutrofila sa prosječnim rezultatom od {{0}}.6 ± 0.2 kod CLP štakora u poređenju sa rezultatom od {{6} }.10 ± {{10}}.10 kod lažnih pacova (p < 0.05).="" također="" smo="" primijetili="" da="" primjena="" klopidogrela="" clp="" pacovima="" nije="" promijenila="" infiltraciju="" neutrofila="" (skor="" 0,5="" ±="" 0,4,="" slika="" 5a).="" slični="" rezultati="" su="" pronađeni="" u="" debljini="" alveolarnog="" zida="" sa="" značajnim="" povećanjem="" clp-a="" sa="" prosječnom="" debljinom="" od="" 1,2="" ±="" 0,1="" µm="" u="" poređenju="" sa="" 0,8="" ±="" 0,3="" µm="" kod="" sham="" pacova="" (p="">< 0,05).="" primjena="" klopidogrela="" clp="" pacovima="" nije="" poboljšala="" debljinu="" alveolarnog="" zida="" (slika="">
2.5. Povreda bubrega
Kao što smo ranije objavili, GFR se značajno smanjio sa 2,1 ± 0,8 mL/min/100 g, ali kod lažnih štakora na {{10}} .7 ± 0.2 mL/min/100 g, ali kod CLP pacova (p < 0.05).="" primena="" klopidogrela="" je="" pokazala="" poboljšanu="" gfr="" na="" 1,3="" ±="" 0,5="" ml/min/100="" g,="" ali="" u="" poređenju="" sa="" clp,="" međutim="" nije="" statistički="" značajno="" (slika="" 6a).="" histološka="" analiza="" je="" pokazala="" povećano="" oštećenje="" glomerula="" u="" clp="" grupi="" u="" odnosu="" na="" sham.="" tretman="" klopidogrelom="" značajno="" je="" poboljšao="" ozljedu="" glomerula="" kod="" clp="" životinja="" (slika="">
cistanche zdravstvene prednosti: bolja funkcija bubrega
3. Diskusija
Sepsa je neregulirani imunološki odgovor na infektivni agens, često povezan sa zatajenjem više organa i za koji se zna da ima visok mortalitet. Postoji potreba za identifikacijom nove terapije koja može modulirati upalni odgovor i smanjiti smrtnost. Pretpostavlja se da trombociti imaju ulogu u imunomodulaciji. Naravno, kaskada koagulacije i aktivacija trombocita bili su istaknuti fokus istraživanja. Primena proteina C, endogenog enzima antikoagulansa, povezana je sa poboljšanim preživljavanjem kod pacijenata sa teškom sepsom [24]. U Japanu, smjernice za sepsu uključuju korištenje vremenski ograničene primjene antitrombina kod septičkih pacijenata sa DIC-om i pokazale su poboljšane ishode [25]. Ovo sugerira da inhibicija aktivacije trombocita može poboljšati ishode sepse. Upalni odgovor tokom sepse je definitivno složen i može uključivati više od jednog puta. Ranije smo objavili da trombociti iz CLP modela polimikrobne sepse imaju povećano sastavljanje/aktivaciju trombocita NLRP3 i da su povezani s ozljedom pluća i bubrega [26]. U ovoj studiji, postavili smo cilj da odredimo ulogu inhibicije trombocita u inflamatornom odgovoru na istom modelu koristeći inhibitor P2Y12, klopidogrel.
Kao što je ranije objavljeno, aktivacija trombocita je povećana kao odgovor na polimikrobnu sepsu u CLP modelu u poređenju sa Sham štakorima. Otkrili smo da je primjena klopidogrela smanjila aktivaciju trombocita kod CLP pacova i zanimljivo je da je također uočeno smanjenje sklapanja NLRP3 inflamasoma u trombocitima. Također smo pronašli trend smanjenja cirkulirajućih IL-1B i IL-18 u plazmi životinja tretiranih klopidogrelom u poređenju sa CLP grupom. U prethodno objavljenoj studiji izvijestili smo da je direktna inhibicija inflamasoma NLRP3 sa MCC950 rezultirala smanjenjem IL-1B i IL-18 u plazmi [27]. Ovo sugerira da je inhibicija aktivacije trombocita klopidogrelom i smanjenje inflamatornih citokina u ovom modelu sepse djelomično posredovani NLRP3 mehanizmima. Stoga je potrebno provesti daljnje studije kako bi se jasnije definirali upalni putevi posredovani NLRP3 u trombocitima.
Multi-organ failure (MOF) occurs frequently in sepsis. Previously published studies reported that in mice, the CLP model caused significant pulmonary damage; and depletion of platelets reduced CLP-induced edema and neutrophil recruitment in the bronchoalveolar space by >60 posto [28]. Ranije smo objavili da je povećana aktivacija trombocita povezana s višestrukom disfunkcijom i ozljedom u CLP modelu štakora [26]. Naši podaci pokazuju značajno smanjenje IL-1 i IL-18 ububreziživotinja liječenih klopidogrelom. Kombinacija akutnog zatajenja bubrega i sepse povezana je sa 70 posto smrtnosti, u poređenju sa 45 posto mortaliteta samo kod pacijenata sa akutnom bubrežnom insuficijencijom [29]. Brzina glomerularne filtracije (GFR) je pokazateljbubregfunkcijai opada sa povećanim oštećenjem bubrega. Liječenje klopidogrelom poboljšalo je oštećenje bubrega kod CLP pacova, što sugerira da aktivacija trombocita može igrati ulogu u razvoju AKI izazvane sepsom.
Prednosti ekstrakta cistanche: poboljšava funkciju bubrega
U skladu sa svojom ulogom u izazivanju MOF-a, razvoj ALI i sindroma akutnog respiratornog distresa (ARDS) uobičajen je kod pacijenata sa sepsom i često dovodi do potrebe za mehaničkom ventilacijom u ovoj populaciji pacijenata. Dokazi sugeriraju da aktivacija trombocita igra važnu ulogu u razvoju MOF kod septičkih pacijenata [8,30]. Prethodne studije su to podržale pokazujući smanjenu infiltraciju neutrofila u plućima septičkih miševa izazvanih CLP-om nakon deplecije trombocita [28]. Nadalje, Liverani et al. objavili su da su miševi prethodno tretirani klopidogrelom otporni na ALI izazvan sepsom [31]. Međutim, trenutna studija nije mogla pokazati bilo kakve značajne dokaze o smanjenju IL- 1, infiltracije neutrofila ili debljine alveolarnog zida u plućima. To može biti zbog upotrebe različite životinjske vrste, doze klopidogrela i drugih razlika u eksperimentalnom dizajnu.
Kapilarno curenje je istaknuta karakteristika sepse. Poznato je da proteini kao što je vaskularni faktor rasta angiopoetin-2 potiču upalu, endotelnu disfunkciju i povezuju se sa povećanom bolničkom smrtnošću kod pacijenata sa sepsom [32]. Endokan je još jedan marker disfunkcije endotelnih ćelija i povezan je sa ozbiljnošću bolesti i ishodom septičkih pacijenata [33]. Također smo otkrili da su ovi markeri endotelne aktivacije i disfunkcije bili povišeni u CLP modelu, a smanjeni u grupi koja je primala Clopidogrel. Slično, uočili smo blagi, ali beznačajni porast GFR u grupi koja je primala klopidogrel. Ovo sugerira da aktivacija trombocita ima neki modulacijski učinak na upalni odgovor na sepsu.
U ovoj studiji, inhibicija aktivacije trombocita nije dovela do značajnih poboljšanja funkcije organa. Moguće je da je odabrana doza od 10 mg/kg/dan bila dovoljna da umanji aktivaciju trombocita, aktivaciju NLRP3, citokine i markere aktivacije endotela, ali nije dovela do slabljenja ozljede pluća ili poboljšanja bubrežne funkcije. Liverani, et al. prethodno koristio početnu dozu od 30/mg/kg/dan kod divljeg tipa i P2Y12 nokaut miševa, što je dovelo do inhibicije ozljede pluća izazvane sepsom [31]. U istoj studiji, Klopidogrel je primijenjen prije indukcije sepse. Ova velika razlika može objasniti nedostatak značajnih poboljšanja plućne ili bubrežne funkcije uočenih u našoj studiji.
Iako trenutna studija sugerira ulogu aktivacije trombocita u doprinosu upali i aktivaciji endotela kao odgovoru na sepsu, postoje ograničenja koja treba napomenuti. Prvo, dok su mjereni markeri endotelne aktivacije, opravdani su dodatni eksperimenti za procjenu funkcije endotela. Štaviše, doprinos drugih faktora koji potiču od trombocita nije kontrolisan u ovoj studiji. Dakle, još uvijek postoje neodgovorena pitanja o tome kako trombociti doprinose patologiji uzrokovanoj sepsom i zatajenju organa.
Uloga klopidogrela u smanjenju mortaliteta kod sepse bila je kontroverzna s izvještajima o smanjenju incidencije ARDS-a i mehaničke ventilacije, ali bez smanjenja mortaliteta [34]. Potrebno je provesti daljnje studije kako bi se utvrdio tačan mehanizam kojim trombociti doprinose ozljedi organa i disfunkciji u sepsi. Ova studija podržava dalje istraživanje trombocita kao terapijske mete kod septičkih pacijenata.
cistanche tubolosa zdravstvene prednosti: poboljšava funkciju bubrega
4. Materijali i metode
4.1. Životinje
Korištene su ženke i mužjaci pacova Sprague Dawley kupljeni od Envigo (Indianapolis, IN, SAD). Svi eksperimentalni postupci izvedeni u ovoj studiji bili su u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za upotrebu i njegu životinja. Sve protokole je odobrila institucionalna komisija za brigu o životinjama i korištenje pri Medicinskom centru Univerziteta Misisipi. Briga i postupanje sa životinjama bili su u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za etički tretman životinja.
4.2. Ligacija i punkcija cekalnog creva
Svi naši eksperimenti in vivo izvedeni su na 12- do 13-sedmično starim mužjacima i ženkama pacova težine približno 225-325 g. Životinje su nasumično podijeljene u dvije grupe: lažnu operacijsku grupu (SHAM, n=10) i grupu za punkciju cekalne ligacije (CLP, n=10). Pod anestezijom izofluranom, CLP operacija je izvedena na podgrupi štakora kako bi se izazvala abdominalna polimikrobna sepsa kao što smo prethodno opisali [26,27]. Zagrijani fiziološki rastvor (20 mL/kg, 37 ◦C) je supkutano ubrizgan odmah nakon operacije radi reanimacije. Lažno operirane životinje podvrgnute su istom kirurškom zahvatu bez podvezivanja ili punkcije cekuma. Pacovi su nakon operacije vraćeni u kaveze, a hrana i voda su im davani ad libitum. 24 h nakon CLP-a, prethodni rez je ponovo otvoren i nekrotični cekum je pažljivo izrezan. Trbušna šupljina je isprana sa 10 mL toplog sterilnog fiziološkog rastvora. Abdominalni rez je ponovo zatvoren u slojevima. Životinjama je dnevno davan antibiotik širokog spektra (Naxcel 5 mg/kg), a analgezija je postignuta buprenorfinom SR (1,2 mg/kg) tokom eksperimentalnog perioda od 72 sata. Agregacija trombocita je blokirana svakodnevnom primjenom klopidogrela (10 mg/kg/dan) tokom 3 dana u podskupini CLP pacova (CLP plus CLOP; n=12) putem ezofagusne sonde tokom 3 dana. Na kraju protokola, životinje su žrtvovane pod dubokom anestezijom. Uzeti su krv i tkiva za dalju analizu.
4.3. Izolacija trombocita
Arterijska krv je izvučena u kiselo-citrat-dekstroza vacutainer epruvete i centrifugirana na 200× g tokom 20 minuta da se dobije plazma bogata trombocitima. Plazma bogata trombocitima (PRP) je pomešana sa jednakom zapreminom HEP pufera (140 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 3,8 mmol/L HEPES, 5 mmol/L EGTA, pH 7,4) koji sadrži 1 µM PGE1. Ova mješavina je zatim centrifugirana na 100 × g 20 minuta da se peletiraju preostali RBC i WBC u kojima je 40 µL supernatanta korišteno za brojanje trombocita. PRP je zatim centrifugiran na 800 × g 20 minuta, supernatant je odbačen i pelet je resuspendiran u Tyrodeovom puferu (134 mmol/L NaCl, 12 mmol/L NaHCO3, 2,9 mmol/L KCl, 0,34 mmol/L Na2HPO4, mmol/L MgCl2, 10 mmol/L HEPES) koji sadrži 5 mmol/L glukoze i 3 mg/mL BSA.
4.4. Protočna citometrija
Svježe izolirane trombocite (106) su resuspendirane u 50 µL Tyrodeovog pufera. Trombociti su inkubirani (RT 30 min) sa fluorescein izotiocijanatom (FITC) -konjugiranim anti-mišjim CD41 (Clone MWReg30, BioLegend, San Diego, CA, USA) i alofikocijaninom (APC) konjugiranim protiv miša/pacova CD62P{Clone RMP{ {9}}, Biolegend). Najmanje 10,000 događaja po izlazu je prikupljeno pomoću MACsQuant Analyzer 10 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, SAD) i analizirano korištenjem softvera FlowLogic (Innovation, Sydney, Australija). Trombociti su se razlikovali po specifičnom vezivanju anti-CD41 i karakterističnom raspršenju naprijed i sa strane. Trombociti pozitivno obojeni na CD41 i CD62P označeni su kao aktivirani trombociti.
4.5. Konfokalna i svjetlosna mikroskopija
Trombocitima (107) lažnih ili CLP pacova ili stimuliranim sa ili bez LPS-a je dozvoljeno da prianjaju na permanox stakalce (Lab-Tek, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Adherirane ćelije su fiksirane u 10% formalina tokom 30 minuta, isprane 3X sa PBS tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi i permeabilizovane sa ledeno hladnim 100% metanolom tokom 10 minuta. Stakalca su blokirana u PBS sa 10 posto kozjeg i zečjeg seruma 1 h, isprana i inkubirana sa zečjim anti-NLRP3 antitijelom (NBP2-12446, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) 2 h na sobnoj temperaturi. Stakalca su zatim isprana i inkubirana sa anti-zečjim Alexa Fluor 488 (A11070, Thermo FisherScientifific) 1 h na sobnoj temperaturi. Stakalca su ponovo isprana i inkubirana sa Alexa Fluor{19}}konjugiranim zečjim anti-ASC antitijelom (NBP1-78977AF647, Novus Biologicals) 1 h na sobnoj temperaturi. Kontrole su obrađene identično, osim izostavljanja primarnih antitijela. Preparati su montirani u Cytoseal 60 (Thermo Fisher Scientific) i analizirani na konfokalnom skenirajućem mikroskopu Nikon C1 (Nikon Inc., Melville, NY, SAD). Slike su snimljene mikroskopom Nikon Eclipse 55i opremljenim Nikon-Fi1 kamerom u boji (Nikon) i analizirane pomoću NIS-Elements D 3.0 softvera.
4.6. Kvantifikacija biomarkera endotelne aktivacije i citokina
Nivoi angiopoietina-2 u plazmi (MANG20, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) i Endocan-1 (MBS039900, MyBioSource, San Diego, CA, USA) mjereni su kao markeri endotelne disfunkcije pomoću ELISA-e prema prema protokolu proizvođača. plazma,bubreg, a plućni IL-1 (RLB00, R&D Systems) i IL-18 (ab213909, Abcam, Boston, MA, SAD) su kvantificirani ELISA-om prema protokolu proizvođača.Bubrezii plućni lizati su pripremljeni sa BioPlex Cell Lysis Kit (171304011, BioRad, Hercules, CA, USA) prema protokolu proizvođača.
4.7. Procjena ozljede pluća
Histological evaluation was performed on the lungs via hematoxylin and eosin (H&E)staining. A lung lobe was formalin-fixed. The tissue was subsequently paraffin-embedded and 5-µm sections were stained with (H&E). Sections were evaluated for neutrophil infiltration into the alveolar space. Five sections were scored in a blinded fashion on a scale of0–2 with 0 representing o neutrophils in the alveolar space, 1 representing 1–5 neutrophils in the alveolar space, and 2 representing >5 neutrofila u alveolarnom prostoru. Slike su snimljene pomoću Nikon Eclipse 55i mikroskopa opremljenog Nikon DS-Fi1 kamerom u boji (Nikon Inc.) na 40X koristeći NIS-Elements D 3.{10}} softver. Debljina zida alveola merena je pomoću softvera NIS-Elements D 3.0. Podaci su normalizirani na lažne vrijednosti.
4.8. Procjena oštećenja bubrežnog glomerula
Bubreziwere collected, weighed, and fixed in a 10% buffered formalin solution. Paraffin sections (3 µm) were prepared and stained with Periodic acid-Schiff to assess the degree of glomerular injury on approximately 30 images per section, per rat. Thirtyglomeruli per section were scored in a blinded fashion on a 0–4 scale with 0 representing a normal glomerulus, 1 representing a 25% loss, 2 representing a 50% loss, 3 representing a 75% loss, and 4 representing >75 posto gubitka kapilara u čuperku. Slike su snimljene istim mikroskopom, kamerom i softverom kao što je prethodno spomenuto.
4.9. Mjerenje bubrežne funkcije
Tokom CLP procedure, kateter je umetnut u jugularnu venu i eksterioriziran supkutano na stražnjem dijelu vrata. Kateter je ispran hepariniziranom fiziološkom otopinom svaki dan do kraja trodnevnog protokola. Posljednjeg dana protokola, pacovi su bili podvrgnuti kratkoj anesteziji izofluranom kako bi se sklopio NIC-Bubreg uređaj (MediBeacon; Mannheim, Njemačka) napravljen od dvije diode koje emituju svjetlost koje pobuđuju FITC sinistrin na 480 nm, fotodiodu koja emituje svjetlost na 531 nm, mikroprocesor i baterija. Ovaj uređaj je pričvršćen na stražnji dio pacova pomoću dvostranog ljepljivog flastera (MediBeacon) i pričvršćen jaknom za glodare za obrijanu regiju na leđima pacova. Pacovima je ostavljeno da se oporave u odvojenim kavezima 15 minuta i snimljeno je osnovno mjerenje. Nakon početnih mjerenja, bolusna injekcija FITC-sinistrina (5 mg/100 g tjelesne težine; FTC-FS001, MediBeacon) je primijenjena kroz jugularnu venu nakon čega je uslijedila bolusna injekcija sterilnog fiziološkog rastvora. Tokom dvosatnog perioda nakon bolus injekcije, transkutano je izmjerena kinetika izlučivanja FITC-sinistrina i korištena je za izračunavanje poluvremena eliminacije (t1/2) FITC-sinistina korištenjem modela s jednim odjeljenjem sa softverom za evaluaciju MDPLab (MediBeacon) za izračunavanje GFR-a iz validiranog empirijski izvedenog faktora konverzije [35,36].
cistanche recenzija: poboljšava funkciju bubrega
4.10. Statistička analiza
Analiza snage utvrđuje da bi n od 10–12 životinja/grupi postiglo snagu (1-) od 0.80 i vjerovatnoću greške tipa 1 ( ) od 0,05 za otkrivanje razlike od najmanje 5-10 posto u aktivaciji trombocita između pacova Sham i CLP. Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost± SD. Svi podaci su provjereni da budu u skladu s Gaussovom distribucijom pomoću D'Agostino-Pearsonovog testa normalnosti. Statističke analize su obavljene jednosmjernom ANOVA-om sa Tukeyjevim testom višestrukih poređenja kao post hoc analizom. Vrijednost p < 0,05="" smatrana="" je="" statistički="">
Doprinosi autora:
Konceptualizacija, CAS, JMW i DCC; metodologija, JMW i D.CC; validacija, OKT, JMW i DCC; formalna analiza, MB-R., CAS, OKT, JMW i D.CC; istraga, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW i DCC; resursi, JMW i DCC; kuriranje podataka, MB-R., CAS i DCC; pisanje – priprema originalnog nacrta, MB-R. i CAS; pisanje—pregled i uređivanje, MB-R., CAS, OKT, RWT, CHB, CAG, GAT, JMW i DCC; vizualizacija, MB-R., CAS, JMW i DCC; nadzor, OKT i DCC; administracija projekta, DCC; pribavljanje sredstava, DCC Svi autori su pročitali i složili se s objavljenom verzijom rukopisa.
finansiranje:
Istraživanje objavljeno u ovoj publikaciji podržano je od strane Nacionalnog instituta za opšte medicinske nauke Nacionalnog instituta za zdravlje pod brojem nagrade P20GM104357 i P30GM103328. Ovo istraživanje je finansirao Nacionalni institut za srce, pluća i krv Nacionalnog instituta za zdravlje pod brojevima nagrada F31HL149257 (OKT), R00HL130456 (DCC) i R01HL151407 (DCC) i Nacionalni institut za dijabetes i probavu iBubregBolestiNacionalnog instituta za zdravlje pod brojem nagrade R01DK109133 (JMW) Sadržaj je isključivo odgovornost autora i ne predstavlja nužno zvanične stavove Nacionalnog instituta za zdravlje.
Izjava institucionalnog odbora za reviziju:
Svi eksperimentalni postupci provedeni u ovoj studiji provedeni su u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za upotrebu i njegu životinja. Svi protokoli su odobreni od strane Komiteta za institucionalnu njegu i korištenje životinja pri Medicinskom centru Univerziteta Misisipi (Protokol 1487A, odobren 02.07.2019.). Briga i postupanje sa životinjama bili su u skladu sa smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje za etički tretman životinja.
Izjava o dostupnosti podataka:
Svi podaci u prilog prijavljenih rezultata su predstavljeni u rukopisu i slobodno dostupni.
Sukobi interesa:
Autori ne izražavaju sukob interesa.
Reference
1. Greco, E.; Lupia, E.; Bosco, O.; Vizio, B.; Montrucchio, G. Trombociti i zatajenje više organa u sepsi. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 2200.
2. Rhee, C.; Dantes, R.; Epstein, L.; Murphy, DJ; Seymour, CW; Iwashyna, TJ; Kadri, SS; Angus, DC; Danner, RL; Fiore, AE; et al. Incidencija i trendovi sepse u američkim bolnicama koristeći kliničke podatke o tvrdnjama, 2009–2014. JAMA 2017, 318, 1241–1249.
3. Kim, WY; Hong, SB Sepsa i sindrom akutnog respiratornog distresa: nedavno ažuriranje. Tuberc. Respir. Dis. (Seul) 2016, 79, 53–57.
4. Alobaidi, R.; Basu, RK; Goldstein, SL; Bagshaw, SM Akutna ozljeda bubrega povezana sa sepsom. Semin. Nefrol. 2015, 35, 2–11.
5. Umbro, I.; Gentile, G.; Tinti, F.; Murešan, P.; Mitterhofer, AP Najnovija dostignuća u patofiziologiji i biomarkerima akutne ozljede bubrega uzrokovane sepsom. J. Infect. 2016, 72, 131–142.
6. Bilevicius, E.; Dragosavac, D.; Dragosavac, S.; Araujo, S.; Falcao, AL; Terzi, RG Višeorganska insuficijencija kod septičkih pacijenata. Braz. J. Infect. Dis. 2001, 5, 103–110.
7. Liu, V.; Escobar, GJ; Greene, JD; Soule, J.; Whippy, A.; Angus, DC; Iwashyna, TJ Hospital smrti kod pacijenata sa sepsom iz 2 nezavisne kohorte. JAMA 2014, 312, 90–92.
8. Katz, JN; Kolappa, KP; Becker, RC Beyond thrombosis: Svestrani trombociti u kritičnoj bolesti. Škrinja 2011, 139, 658–668.
9. Smyth, SS; McEver, RP; Weyrich, AS; Morrell, CN; Hoffman, MR; Arepally, GM; francuski, PA; Dauerman, HL; Becker, RC; Trombocitni kolokvijum, P. Funkcije trombocita izvan hemostaze. J. Thromb. Haemost. 2009, 7, 1759–1766.
10. de Stoppelaar, SF; van 't Veer, C.; van der Poll, T. Uloga trombocita u sepsi. Thromb. Haemost. 2014, 112, 666–677.
11. Nawaz, M.; Dickfeld, T.; Bogner, C.; Fateh-Moghadam, S.; Neumann, FJ Funkcija trombocita u septičkim sindromima višeorganske disfunkcije. Intenzivna njega Med. 1997, 23, 379–385.
12. Layios, N.; Delierneux, C.; Hego, A.; Huart, J.; Gosset, C.; Lecut, C.; Maes, N.; Geurts, P.; Joly, A.; Lancellotti, P.; et al. Predviđanje sepse kod kritično bolesnih pacijenata pomoću markera aktivacije trombocita na prijemu u intenzivnu intenzivnu terapiju: prospektivna pilot studija. Intenzivna njega Med. Exp. 2017, 5, 32.
13. Russwurm, S.; Vickers, J.; Meier-Hellmann, A.; Spangenberg, P.; Bredle, D.; Reinhart, K.; Losche, W. Aktivacija trombocita i leukocita korelira sa ozbiljnošću disfunkcije septičkih organa. Šok 2002, 17, 263–268.
14. Vanderschueren, S.; De Weerdt, A.; Malbrain, M.; Vankersschaever, D.; Frans, E.; Wilmer, A.; Bobbaers, H. Trombocitopenija i prognoza na intenzivnoj njezi. Crit. Care Med. 2000, 28, 1871–1876.
15. Theofanis, E.; Semitekolou, M.; Morianos, I.; Sanitas, K.; Xanthou, G. Ciljanje aktivacije NLRP3 inflamasoma u teškoj astmi. J. Clin. Med. 2019, 8, 1615.
16. Haque, ME; Akther, M.; Jakaria, M.; Kim, IS; Azam, S.; Choi, DK Ciljanje mikroglijalnog NLRP3 inflamasoma i njegova uloga u Parkinsonovoj bolesti. MOV. Disord. 2020, 35, 20–33.
17. Liu, L.; Dong, Y.; Ye, M.; Jin, S.; Yang, J.; Joosse, ME; Sun, Y.; Zhang, J.; Lazarev, M.; Brant, SR; et al. Patogena uloga aktivacije inflamasoma NLRP3 u inflamatornim bolestima crijeva i kod miševa i kod ljudi. J. Crohn's Colitis 2017, 11, 737–750.
18. Danielski, LG; Giustina, AD; Bonfante, S.; Barichello, T.; Petronilho, F. NLRP3 inflamasom i njegova uloga u razvoju sepse. Inflammation 2020, 43, 24–31.
19. Luo, YP; Jiang, L.; Kang, K.; Fei, DS; Meng, XL; Nan, CC; Pan, SH; Zhao, MR; Zhao, MY Hemin inhibira aktivaciju inflamasoma NLRP3 kod akutne ozljede pluća izazvane sepsom, koja uključuje hem oksigenazu-1. Int. Immunopharmacol. 2014, 20, 24–32.
20. Moon, JS; Lee, S.; Park, MA; Siempos, II; Haslip, M.; Lee, PJ; Yun, M.; Kim, CK; Howrylak, J.; Ryter, SW; et al. UCP2-indukovana sintaza masnih kiselina potiče aktivaciju NLRP3 inflamasoma tokom sepse. J. Clin. Investig. 2015, 125, 665–680.
[PubMed]21. Gong, Z.; Zhou, J.; Li, H.; Gao, Y.; Xu, C.; Zhao, S.; Chen, Y.; Cai, W.; Wu, J. Kurkumin potiskuje aktivaciju inflamasoma NLRP3 i štiti od septičkog šoka izazvanog LPS-om. Mol. Nutr. Food Res. 2015, 59, 2132–2142.
22. Wang, P.; Huang, J.; Li, Y.; Chang, R.; Wu, H.; Lin, J.; Huang, Z. Egzogeni ugljični monoksid smanjuje akutnu ozljedu bubrega uzrokovanu sepsom i inhibira aktivaciju NLRP3 inflamasoma kod pacova. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 20595–20608.
23. Kalbitz, M.; Fattahi, F.; Trailer, JJ; Jajou, L.; Malan, EA; Stone, FS; Huber-Lang, M.; Russell, MW; Ward, PA Komplementom izazvana aktivacija srčanog NLRP3 inflamasoma u sepsi. FASEB J. 2016, 30, 3997–4006.
24. Bernard, GR; Vincent, JL; Laterre, PF; LaRosa, SP; Dhainaut, JF; Lopez-Rodriguez, A.; Steingrub, JS; Garber, GE; Helterbrand, JD; Ely, EW; et al. i rekombinantni humani protein CWEiSSsg. Efikasnost i sigurnost rekombinantnog humanog aktiviranog proteina C za tešku sepsu. N. Engl. J. Med. 2001, 344, 699–709.
25. Iba, T.; Thachil, J. Sadašnjost i budućnost antikoagulantne terapije upotrebom antitrombina i trombomodulina za diseminiranu intravaskularnu koagulaciju povezanu sa sepsom: perspektiva iz Japana. Int. J. Hematol. 2016, 103, 253–261.
26. Cornelius, DC; Baik, CH; Travis, OK; White, DL; Young, CM; Austin Pierce, W.; Shields, CA; Poudel, B.; Williams, JM NLRP3 aktivacija inflamasoma u trombocitima kao odgovor na sepsu. Physiol. Rep. 2019, 7, e14073.
27. Cornelius, DC; Travis, OK; Tramel, RW; Borges-Rodriguez, M.; Baik, CH; Greer, M.; Giachelli, CA; Tardo, GA; Williams, JM NLRP3 inhibicija inflamasoma smanjuje aktivaciju trombocita izazvanu sepsom i sprječava ozljedu više organa u punkciji cekalne ligacije. PLOS ONE 2020, 15, e0234039.
28. Asaduzzaman, M.; Lavasani, S.; Rahman, M.; Zhang, S.; Braun, OO; Jeppsson, B.; Thorlacius, H. Trombociti podržavaju plućnu regrutaciju neutrofila u abdominalnoj sepsi. Crit. Care Med. 2009, 37, 1389–1396.
29. Schrier, RW; Wang, W. Akutno zatajenje bubrega i sepsa. N. Engl. J. Med. 2004, 351, 159–169.
30. Vincent, JL; Yagushi, A.; Pradier, O. Funkcija trombocita u sepsi. Crit. Care Med. 2002, 30, S313–S317.
31. Liverani, E.; Rico, MC; Tsygankov, AY; Kilpatrick, LE; Kunapuli, SP P2Y12 receptor modulira upalu izazvanu sepsom. Arter. Thromb. Vasc. Biol. 2016, 36, 961–971. [CrossRef]
32. Siner, JM; Bhandari, V.; Engle, KM; Elias, JA; Siegel, MD Povišeni nivoi angiopoetina 2 u serumu povezani su sa povećanjem
smrtnost kod sepse. Šok 2009, 31, 348–353.
33. Scherpereel, A.; Depontieu, F.; Grigoriu, B.; Cavestri, B.; Tsicopoulos, A.; Gentile, T.; Jourdain, M.; Pugin, J.; Tonnel, AB; Lassalle, P. Endocan, novi endotelni marker u humanoj sepsi. Crit Care Med. 2006, 34, 532–537.
34. Valerio-Rojas, JC; Jaffer, IJ; Kor, DJ; Gajić, O.; Cartin-Ceba, R. Ishodi pacijenata sa teškim sepsom i septičkim šokom na hroničnom antitrombocitnom liječenju: povijesna kohortna studija. Crit. Care Res. Prakt. 2013, 2013, 782573.
35. Pill, J.; Issaeva, O.; Wonderer, S.; Sadick, M.; Kranzlin, B.; Fiedler, F.; Klotzer, HM; Kramer, U.; Gretz, N. Farmakološki profil i toksičnost sinistrina označenog fluoresceinom, novog markera za mjerenje GFR. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2006, 373, 204–211.
36. Pill, J.; Kraenzlin, B.; Jander, J.; Sattelkau, T.; Sadick, M.; Kloetzer, HM; Deus, C.; Kraemer, U.; Gretz, N. Sinistrin označen fluoresceinom kao marker brzine glomerularne filtracije. EUR. J. Med. Chem. 2005, 40, 1056–1061.