Trenutni status neuroprotekcije kod kongenitalnih srčanih bolesti, dio 1

sažetak:

Prisustvo ektopične DNK u citoplazmi izaziva upalu i smrt ćelije. Naširoko je objavljeno da se curenje nuklearne DNK u citoplazmu uglavnom može osjetiti cikličkom GMP-AMP sintazom (cGAS).

DNK je molekul koji određuje genetske informacije svake osobe i nalazi se u svakoj našoj ćeliji. Nedavna istraživanja pokazuju da DNK može procuriti u citoplazmu kroz određene puteve i utjecati na naše pamćenje.

Ovaj fenomen je čest kod starijih osoba i osoba sa kognitivnim oštećenjima. Kada DNK procuri u citoplazmu, ona ometa normalne funkcije unutar ćelije i povećava rizik od gubitka pamćenja i kognitivnog oštećenja.

Međutim, zbog ovoga se ne moramo osjećati depresivno i beznadežno. Postoji mnogo načina da poboljšamo pamćenje i kognitivne sposobnosti koji nam pomažu u održavanju zdravog mozga.

Prvo, morate voditi zdrav način života. To uključuje uravnoteženu ishranu, dovoljno sna, umjereno vježbanje i smanjenje stresa. Ove prakse promovišu zdravlje mozga, čime se izbjegava curenje DNK i poboljšava pamćenje.

Drugo, potrebna je kognitivna obuka. To može uključivati igranje matematičkih igrica, čitanje, učenje novih vještina, itd. Ove aktivnosti mogu pomoći u stimulaciji mozga i promoviranju neurogeneze kako bi se izbjeglo curenje DNK.

Konačno, zadržite pozitivan stav. Emocionalna nestabilnost i pretjerani stres mogu uzrokovati promjene u hemiji mozga koje potiču curenje DNK. Stoga moramo naučiti da se pozitivno suočimo sa životnim izazovima i zadržimo optimističan stav.

Ukratko, iako curenje DNK u citoplazmu može utjecati na pamćenje, možemo poboljšati zdravlje mozga, izbjeći curenje DNK i na kraju poboljšati naše pamćenje usvajanjem ispravnog načina života, uključivanjem u kognitivni trening i održavanjem pozitivnog načina razmišljanja. Memorija i kognitivne sposobnosti. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje jer je cistanche deserticola tradicionalni kineski ljekoviti materijal koji ima mnogo jedinstvenih učinaka, od kojih je jedno poboljšanje pamćenja. Djelotvornost Cistanche deserticola dolazi od višestrukih aktivnih sastojaka koje sadrži, uključujući taninsku kiselinu, polisaharide, flavonoidne glikozide, itd. Ovi sastojci mogu promovirati zdravlje mozga na različite načine.

improve memory

Kliknite znati 10 načina za poboljšanje pamćenja

Nedavno smo izvijestili da citoplazmatska dvolančana DNK (dsDNA) izvedena iz mitohondrija koja je izbjegla lizozomsku degradaciju inducira značajnu citotoksičnost u stanicama u kulturi i in vivo. Pretpostavlja se da je citoplazmatska mitohondrijska DNK uključena u razne bolesti i poremećaje, a sve je više radova koji to potvrđuju. S druge strane, trenutna metoda za procjenu mitohondrijalne DNK u citoplazmi možda nije kvantitativna.

Ovdje detaljno predstavljamo metodu za procjenu ektopičnih mitohondrijalnih DNK stanica. Ova metoda je korisna u osnovnim istraživanjima, kao iu proučavanju starenja, Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, srčane insuficijencije, autoimunih bolesti, raka i drugih stanja.

Ključne riječi: ektopična DNK; mitohondrijalna DNK; mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM); Parkinsonova bolest.

1. Uvod

DNK sadrži važne informacije za preživljavanje i nasljeđivanje te ju je potrebno zaštititi od različitih stresora, uključujući oksidanse i mutagene. Eukariotske stanice sadrže mitohondrije, koje proizvode energiju, zajedno s puno aktivnih vrsta kisika, kroz aerobno disanje.

Dakle, u eukariotskoj ćeliji, DNK postoji u jezgru ili mitohondrijima, spakovana unutar nuklearne membrane ili mitohondrijalne membrane, respektivno. Međutim, DNK može biti prisutna u citoplazmi pod određenim uslovima, kao što su tokom virusnih ili nevirusnih infekcija [1– 4].

Čak iu nekim neinfektivnim stanjima (na primjer, starenje ili različiti poremećaji povezani sa starenjem ili rak), DNK može procuriti u citoplazmu iz jezgra ili mitohondrija [5-7].

DNK u citoplazmi može biti inflamatorna i toksična za stanice. Opširno je objavljeno da curenje nuklearne DNK u citoplazmu izaziva upalu, citotoksičnost i sekretorni fenotip povezan sa starenjem (SASP), uglavnom preko cikličkog GMP-AMP sintaze (cGAS)-stimulatora puta gena za interferon (STING). 5,6].

Nedavno smo izvijestili da se pokazalo da citosolna dvolančana DNK (dsDNA) mitohondrijskog porijekla koja bježi od lizozomske degradacije indukuje citotoksičnost i neurodegeneraciju u ćelijskim modelima Parkinsonove bolesti [8]. Na prisustvo ili povećanje takve ektopične DNK često su ukazivale reprezentativne mikroskopske slike i posredni dokazi, a ne samo povećanje curenja DNK.

short term memory how to improve

Očekuje se da će evaluacija ove ektopične DNK postati sve važnija, ne samo za osnovna istraživanja već i za istraživanja o starenju i drugim bolestima, kao što su Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, zatajenje srca, autoimune bolesti, dijabetes, nealkoholni steatohepatitis (NASH) i rak. Prijavljeno je da je cGAS–STING put ključan ne samo u starenju, već iu patogenezi ovih bolesti [8–17].

Vjerovatno zbog oksidativnih okolnosti oko mitohondrija i nedostatka efikasnog sistema za popravku DNK za mitohondrijsku DNK, mitohondrijska DNK je mnogo podložnija mutacijama ili oštećenjima od nuklearne DNK [18,19].

Za razliku od nuklearne DNK, mitohondrijska DNK postoji u više kopija u jednoj ćeliji i sintetizira se po potrebi. Stoga, mitohondrijska DNK može imati mnogo veće šanse da procuri u citoplazmu tokom starenja ili u malignim stanjima kao što su poremećaji povezani sa starenjem, mitohondrijska disfunkcija ili raka.

Detekcija i mjerenje takve citoplazmitohondrijalne DNK moglo bi biti važno u razumijevanju patogeneze različitih bolesti i starenja i moglo bi postati biomarker i terapeutska meta.

Razvili smo semi-kvantitativnu metodu za procjenu ektopične mitohondrijalne DNK koja curi u citoplazmu, a ovdje detaljno opisujemo metodu. Ovaj rad omogućava objektivnu procjenu curenja mitohondrijske DNK i koristan je u proučavanju različitih patologija bolesti.

2. Materijali i metode

2.1. Ćelijske linije, tretman siRNA i kvantitativna PCR (qPCR) analiza

HeLa ćelije su izvedene iz ćelija raka grlića materice pacijentice (ATCC,CCL-2). HeLa ćelije su uzgajane na 37 ◦C pod 5% CO2 u Dulbecco-ovom modificiranom EagleMedium-u (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg mesa (FBS) (Biowest, Nuaillé, Francuska) i otopinom penicilina (streptomina). 100 jedinica/mL penicilina G i 100 µg/mL streptomicin sulfata, Wako, Osaka, Japan).

Jedan dan prije transfekcije, HeLa ćelije su postavljene u gustinu od 600 ćelija/µL. Ekspresija gena od interesa utišana je u HeLa ćelijama korištenjem Stealth RNAi siRNA (mitohondrijalni transkripcijski faktor A, TFAM: HSS144251, glukocerebrozidaza, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, SAD) u Lipofectaminer Transkripcionom institutu (SAD) u Lipofectaminer. uputstva proizvođača (konačna koncentracija RNK od 10 nM).

Tri dana nakon pada siRNA, ukupna ćelijska RNK je izolirana korištenjem TRIzolreagensa prema uputama proizvođača (Thermo Fisher Scientific). cDNA šabloni su sintetizirani iz pročišćene RNK koristeći ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) sa oligo (dT)20 prajmerima. qPCR je izveden korištenjem TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) , Japan) i analizirana u Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). PCR prajmeri koji se koriste u ovoj studiji bili su GBA naprijed (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA revers (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM naprijed (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM revers (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehydehydrogens{1GCAGCAPte{101} AGCA) i GAPDH obrnuto (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Statističke analize su obavljene korišćenjem softvera GraphPad Prism, verzija 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Dvostrani Studentovi t-testovi korišteni su za poređenje aritmetičkih sredina između dvije grupe. Podaci su predstavljeni kao srednje vrijednosti i ± standardne greške srednjih vrijednosti.

2.2. Imunofluorescentna detekcija ektopične mitohondrijalne DNK i analiza slike

Jedan dan prije transfekcije, HeLa ćelije su postavljene na gustinu od 600 ćelija/µL. Ekspresija gena od interesa je utišana u HeLa ćelijama korištenjem Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) u Lipofectamine RNAiMAX transfekcionom reagensu (ThermoFisher Scientific) prema uputstva proizvođača (konačna koncentracija RNK od 10 nM).

ways to improve memory

Tri dana nakon pada siRNA, ćelije su podvrgnute imunofluorescentnom bojenju. Za detekciju mitohondrijalne DNK, anti-dsDNA antitijela (Abcam, Cambridge, UK, klon 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 ili EMD Millipore, Billerica, MA, SAD, klon AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) pokazao je bolji omjer signal-šum od Hoechst 33258, DAPI ili Picogreen. Ovdje smo kombinovali tri primarna antitijela: anti-dsDNA antitijela (35I9 DNK) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anti-histon-H2B antitijela (Abcam, Cat# ab134211) i anti-heat- antitijelo šok-proteina-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Druga antitijela se mogu odabrati ili fluorescentno označena histonom, ili se Hsp60 može koristiti alternativno, ali je potrebno optimizirati uvjete trostrukog bojenja za svaku kombinaciju.

Ćelije su dva puta isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) i fiksirane sa ledeno hladnim metanolom 10 min na 4 ◦C. Alternativno, 4% paraformaldehida (PFA) se može koristiti za fiksaciju, ali čini se da su pozadinski signali mnogo veći u uzorcima fiksiranim na PFA. Nakon fiksacije, ćelije su isprane tri puta fiziološkom otopinom puferovanom fosfatom sa Tween 20 (PBST) po 5 minuta svaka. Ćelije su permeabilizirane sa PBS-om koji sadrži 0,2% (w/v) Triton X-100 tokom 10 min.

Nakon što su tri puta isprane PBST-om po 5 minuta svaki put, ćelije su inkubirane sa 2% (w/v) albuminom goveđeg seruma (BSA) u PBST-u 30 minuta. Ćelije su inkubirane sa jednim primarnim antitelom, anti-histon-H2B antitelom (1/400, Abcam, Cat# ab134211) razblaženim u 2% (w/v) BSA u PBST O/N na 4 ◦C. Nakon što su tri puta isprane PBST-om po 5 minuta svaki put, ćelije su inkubirane sa Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) razrijeđen u 2% (w/v) BSA u PBST 1 sat na sobnoj temperaturi (RT).

Nakon što su tri puta isprane po 5 minuta svaki put sa PBST, ćelije su inkubirane sa primarnim antitelima i anti-dsDNA antitelom (35I9 DNK) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) i anti -Hsp60 antitijela (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) razrijeđena u 2% (w/v) BSA u PBST primijenjena su 1 sat na sobnoj temperaturi ili preko noći (O/N) na 4◦C.

Nakon što su tri puta isprane sa PBST po 5 minuta svaki put, ćelije su inkubirane sa visoko adsorbovanim Alexa Fluor 680-konjugiranim magarećim anti-zečjim IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043 , RRID: AB_2534018) i Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) razrijeđen u 2% (w/v) BSA u PBST-u 1 sat na sobnoj temperaturi.

memory enhancement