Trenutni status neuroprotekcije kod kongenitalnih srčanih bolesti, dio 2

Mikroskopske slike su zatim podvrgnute proračunu slike pomoću softvera ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Signal Hsp60 je pomnožen sa "x".

Hsp60 je važan proteinski molekul koji igra važnu biološku ulogu u ljudskom tijelu. Istraživanja posljednjih godina su pokazala da je prisustvo Hsp60 usko povezano s ljudskim pamćenjem.

Hsp60 je molekularni protein šaperon koji je uglavnom uključen u savijanje, odvijanje, stabilizaciju i degradaciju proteina. Ovi procesi su veoma važni za normalan metabolizam i ćelijsku funkciju ljudskog organizma. Istovremeno, Hsp60 ima i antioksidativno, protuupalno i imunomodulatorno djelovanje, te igra veliku ulogu u održavanju zdravlja ljudi i ravnoteže imunog sistema.

Istraživanje je pokazalo da Hsp60 igra ključnu ulogu u formiranju i održavanju pamćenja. Tokom procesa učenja i pamćenja, moždane ćelije proizvode veliki broj molekula Hsp60. Ovi molekuli mogu zaštititi ćelije od smetnji i oštećenja iz vanjskog okruženja kako bi osigurali nesmetan napredak učenja i pamćenja. Osim toga, Hsp60 također može utjecati na ljudsko razmišljanje i ponašanje mijenjajući prijenos signala moždanih stanica i razvoj neurona te ima pozitivan utjecaj na spoznaju i otpornost na stres.

Iako je uloga Hsp60 pokazala pozitivne učinke na ljudsko tijelo, ljudi također moraju shvatiti da i višak i nedostatak Hsp60 mogu imati negativne efekte na ljudsko zdravlje. Stoga bismo trebali aktivno istraživati ​​i proučavati mehanizam Hsp60 u različitim fiziološkim i patološkim stanjima ljudskog tijela kako bismo bolje razumjeli položaj i ulogu Hsp60 u ljudskom zdravlju. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer Cistanche deserticola djeluje antioksidativno, protuupalno i protiv starenja, što može pomoći u smanjenju oksidacije i upalnih reakcija u mozgu, čime se štiti zdravlje nervnog sistema. Osim toga, Cistanche deserticola također može promovirati rast i popravak nervnih ćelija, čime se poboljšava povezanost i funkcija neuronskih mreža. Ovi efekti mogu pomoći u poboljšanju pamćenja, sposobnosti učenja i brzine razmišljanja, a također mogu spriječiti razvoj kognitivne disfunkcije i neurodegenerativnih bolesti.

Kliknite Znaj da poboljšate kratkoročno pamćenje

Vrijednost "x" određena je na sljedeći način: oduzimanjem "x" presavijenog Hsp60 signala od signala mitohondrijske DNK u kontrolnoj grupi, vrijednost mitohondrijske DNK je manja ili jednaka nuli. Signal histona H2B je pomnožen sa "y".

Vrijednost "y" određena je na sljedeći način: oduzimanjem "y"-savijenog histon-H2B signala od signala nuklearne DNK u kontrolnoj grupi, vrijednost nuklearne DNK je manja od ili jednaka nuli. Ako pozadinski signal postane visok od množenja, kontrast umnožene slike može se podesiti za iste uslove u svim uzorcima.

Slika bojenja dsDNK, umanjena za prilagođenu sliku multipliciranog Hsp60 i histona H2B, korištena je za naknadnu analizu. Koristeći funkciju "Adjust-Threshold", ove slike su binarizirane. Odabrali smo dsDNA puncta veličine od 2 do 20 µm2 (kružnost 0,1–1,0), a oni su prebrojani pomoću funkcije "Analiziraj-Analiziraj čestice".

2.3. Elektronska mikroskopija

Jedan dan prije transfekcije, HeLa ćelije su postavljene na gustinu od 600 ćelija/µL. Ekspresija gena od interesa je utišana u HeLa ćelijama korištenjem Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) u Lipofectamine RNAiMAX reagensu za transfekciju (ThermoFisher Scientific) prema uputstva proizvođača (sa konačnom koncentracijom RNK od 10 nM).

Četiri dana nakon pada siRNA, ćelije su podvrgnute fiksaciji. Uzorci ćelijske kulture su fiksirani sa 2% PFA i 2% glutaraldehida u 0.1 M fosfatnom puferu, pH 7,4, na 37 ◦C, zatim stavljeni u 4 ◦C frižider na 30 min. Uzorci su fiksirani u 2% glutaraldehida u 0.1 M fosfatnom puferu preko noći na 4 ◦C. Uzorci su tri puta isprani sa 0.1 M fosfatnim puferom tokom 30 minuta i naknadno fiksirani sa 2% osmijum-tetroksida u 0,1 M fosfatnom puferu na 4 ◦C tokom 1 h.

Uzorci su dehidrirani rastvori etanola, prebačeni u smolu (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokio, Japan) i polimerizovani na 60 ◦C tokom 48 h. Polimerizovane smole su izrezane na ultratanke 70-nm-sekcije dijamantskim nožem koristeći ultramikrotom (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Njemačka) i zatim su postavljene na bakarne rešetke.

Sekcije su obojene sa 2% uranil acetata na sobnoj temperaturi 15 minuta i isprane destilovanom vodom, nakon čega je usledilo sekundarno bojenje rastvorom za bojenje olova (Sigma-Aldrich, Tokio, Japan) na sobnoj temperaturi u trajanju od 3 minuta.

Mreže su posmatrane pod transmisionim elektronskim mikroskopom (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokio, Japan) na naponu ubrzanja od 80 kV (mozak zebrice) ili 100 kV (ćelija), a slike su snimljene pomoću kamere sa spojnim punjenjem (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Imunoelektronska mikroskopija

Uzorci na zlatnim diskovima su zamrznuti u tečnom propanu na -175 ◦C. Nakon što su uzorci zamrznuti, zamrznuti su supstituirani sa 1% taninske kiseline u etanolu i 2% destilovane vode na -80 ◦C tokom 24 sata.

Uzorci su zatim držani na -20 ◦C 4 sata, nakon čega je uslijedila inkubacija na 4 ◦C 1 sat. Zatim su uzorci dehidrirani u bezvodnom etanolu 3 puta po 30 min. svaki put, nakon čega slijedi infiltracija sa 50:50 mješavinom etanoland smole (LR bijelo: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) na 4 ◦C u trajanju od 1 sata. Uzorci su prebačeni u svježu 100% smolu i inkubirani na 4 ◦C 30 min, a ovaj proces je ponovljen tri puta.

Uzorci su prebačeni u svježu 100% smolu i polimerizirani na 50 ◦CO/N. Polimerizovane smole su ultra-tanko izrezane na 90 nm dijamantskim nožem pomoću ultramikrotoma (Ultracut UCT; Leica), a sekcije su postavljene na niklovane rešetke. Rešetke su inkubirane sa anti-dsDNA antitelom (35I9 DNK) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) u 1% BSA/PBS na 4 ◦CO/N, nakon čega su usledila tri ispiranja sa 1% BSA/PBS po 1 min.

Nakon toga su inkubirani sa ovim sekundarnim antitijelima konjugiranim sa {{0}}nm zlatnim česticama (kozje anti-mišje IgG poliklonsko antitijelo) 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja sa PBS, rešetke su stavljene u 2% glutaraldehidein 0,1 M kakodilat pufer.

Nakon toga, rešetke su osušene, a zatim obojene 2% uranil acetatom 15 minuta i otopinom olovne boje (Sigma-Aldrich) na sobnoj temperaturi 3 minute. Rešetke su posmatrane putem transmisionog elektronskog mikroskopa (JEM-1400 plus JEOLLtd.) na naponu ubrzanja od 100 kV. Digitalne slike su dobijene CCD kamerom (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Rezultati

3.1. Smanjen TFAM ili GBA izaziva povećanje ektopične mitohondrijalne DNK

Prvo smo pokazali primjer detekcije citoplazmatske DNK izvedene iz mitohondrija u HeLa ćelijama u kojima je TFAM protein oboren siRNA (slika 1A). TFAM je ključni faktor transkripcije mitohondrija i također funkcionira u replikaciji i popravci mitohondrijske DNK [20] .

Polimorfizmi sekvence u ovom genu su povezani sa Parkinsonovom bolešću [21,22]. Nakon 3 dana uništavanja TFAM proteina, u citoplazmi HeLa ćelija otkriveno je mnogo dvolančanih DNK tačaka.

Histoni su pozitivni markeri za DNK nuklearnog porijekla u citoplazmi, a negativni markeri za mitohondrijsku DNK i DNK mitohondrijalnog porijekla u citoplazmi [23]. Ove tačke se nisu ko-lokalizirale s histonima, što sugerira da nisu nuklearne DNK. Nadalje, neke od ovih citoplazmatskih, ektopičnih DNK tačaka nisu se ko-lokalizirale s Hsp60, markerom za mitohondrijski matriks, što ukazuje da su se nalazile izvan mitohondrija (Slika 1B, C).

Elektronska mikroskopija je takođe pokazala da je ektopična DNK iscurila iz mitohondrija (slika 2A, B). Ukratko, povećanje ektopičnih DNK tačaka u citoplazmi TFAM-om knockdownom nastalo je zbog curenja mitohondrijske DNK iz mitohondrija. Drugo, pokazali smo još jedan primjer detekcije citoplazmatske DNK izvedene iz mitohondrija u HeLa ćelijama u kojima je GBA protein srušen siRNA. (Slika 1A).

GBA je uzročnik za Gaucherovu bolest, ali heterozigotna mutacija GBA je također faktor rizika za Parkinsonovu bolest [24]. Mnogo dvolančanih DNK tačaka je otkriveno u citoplazmi HeLa ćelija nakon 3 dana uništavanja GBA proteina. Neke DNK tačke bile su ko-lokalizirane s histonima, što sugerira da su one nuklearne DNK.

Druge DNK tačke nisu bile ko-lokalizirane s histonima, što sugerira da to nisu DNK izvedene iz nuklearne elektrane, već DNK izvedene iz mitohondrija (slika 1D). Ukratko, povećanje ektopičnih DNK tačaka u citoplazmi zbog obaranja GBA barem je djelomično posljedica curenja mitohondrijske DNK iz mitohondrija.

For more information:1950477648nn@gmail.com