Trenutni status neuroprotekcije kod kongenitalnih srčanih bolesti, dio 3

3.2. Semi-kvantitativna evaluacija ektopične mitohondrijalne DNK

Slike bojenja Hsp60 (mitohondrijski matriks) i bojenja histon-H2B (nuklearni marker) su oduzete od slika bojenja dsDNK. Zatim, koristeći funkciju "AdjustThreshold" softvera lmage] (Nacionalni institut za zdravlje), slike su binarizirane.

Mitohondrije su tvornice energije u ćelijama, odgovorne za sintezu ATP-a kako bi se osigurala energija potrebna stanicama. Mitohondrijski matriks je unutrašnja tekućina mitohondrija, koja sadrži razne enzime i ione i ključno je mjesto za različite biokemijske reakcije mitohondrija. Pamćenje je jedna od najvažnijih kognitivnih sposobnosti ljudskih bića. Iako ovo dvoje može izgledati nepovezano, oni su usko povezani.

Istraživanja pokazuju interakciju između mitohondrijske matrice i pamćenja. Enzimi i joni u mitohondrijskom matriksu mogu direktno uticati na ekscitabilnost neurona regulacijom energetskog metabolizma i statusa jonskih kanala u neuronskim ćelijama, čime utiču na pamćenje. Osim toga, postoji niz signalnih molekula u mitohondrijskom matriksu, koji se mogu prenijeti na nizvodne neurone kroz aksone i sinapse neurona, utječući na efikasnost transdukcije signala neurona, čime se utječe na formiranje i konsolidaciju pamćenja.

Istovremeno, memorijska aktivnost također direktno utječe na stanje mitohondrijalnog matriksa. Memorijske aktivnosti će povećati potrošnju energije neurona i promovirati redoks reakciju u mitohondrijskom matriksu, čime će utjecati na metabolički nivo mitohondrija i intracelularnu ravnotežu jona, dodatno utječući na ekscitabilnost i efikasnost transdukcije signala neurona.

Stoga je održavanje dobrog zdravlja mitohondrija ključno za održavanje dobre funkcije pamćenja. Održavanjem dobrih životnih navika, kao što su redovna prehrana, umjereno vježbanje, adekvatan san, itd., možete pomoći u održavanju zdravlja mitohondrijalnog matriksa. Osim toga, memorijska funkcija se također može poboljšati odgovarajućom farmaceutskom intervencijom kako bi se promovirale biokemijske reakcije i signalizacija unutar mitohondrijalnog matriksa.

U svakodnevnom životu možemo vježbati pamćenje na mnogo načina, kao što su čitanje, učenje, razmišljanje, igre itd. U isto vrijeme trebamo obratiti pažnju i na održavanje dobrog zdravlja kako bismo bolje održali zdravlje mitohondrijalnog matriksa. Vjerujem da ćemo kroz ove napore sigurno imati bolje pamćenje i bolje se nositi sa raznim izazovima u životu i radu. Vidi se da moramo poboljšati pamćenje, a Cistanche deserticola može značajno poboljšati pamćenje, jer i Cistanche deserticola može regulisati ravnotežu neurotransmitera, kao što je povećanje nivoa acetilholina i faktora rasta. Ove supstance su veoma važne za pamćenje i učenje. Osim toga, Cistanche deserticola također može poboljšati protok krvi i promovirati isporuku kisika, što može osigurati da mozak dobije dovoljno hranjivih tvari i energije, čime se poboljšava vitalnost i izdržljivost mozga.

Kliknite znati suplemente za jačanje pamćenja

Odabrali smo dsDNA puncta veličine od 2 do 20 um' (kružnost 0.1-1.0) koristeći funkciju "Analiziraj-Analiziraj čestice". ako je potrebno, originalne slike su pregledane radi konačnog brojanja. Da je signal histona H2B bio mali. tada su oduzete slike pokazale strukture nalik krofnama.

Oni predstavljaju citosolnu dsDNK nuklearnog porijekla i treba ih eliminirati iz količine citosolne dsDNK mitohondrijalnog porijekla. Opseg veličine može se modificirati prema tipu ćelije ili porijeklu histoloških uzoraka. Slika lE prikazuje primjer brojanja ektopične mitohondrijalne DNK

tačke koristeći 1B D.

Alternativno, slike bojenja Hsp60 su oduzete od slika bojenja dsDNK. Zatim je broj dsDNA puncta prebrojan korištenjem funkcije "Adjust-Threshold "Analyze-Analyze Particles". Nakon toga, dsDNA puncta bez histon-H2B signala je prebrojan direktnim posmatranjem. Posljednja metoda je prikladna kada histon-H2B slike pokazuju nizak odnos signal-šum.

Sve u svemu, ova metoda može jasno pokazati ektopičnu mitohondrijsku DNK koja curi u citoplazmu i omogućava objektivnu i statističku procjenu takve ektopične mitohondrijalne DNK u stanicama.

4. Diskusija

U našem istraživanju razvili smo metodu koja omogućava prebrojavanje citoplazmatske mitohondrijalne DNK. Detekcija citoplazmatske mitohondrijalne DNK je prijavljena korišćenjem tehnika imunofluorescencije, ali metode nisu bile kvantitativne za procenu citoplazmatske mitohondrijalne DNK u većini slučajeva [15,25]. U drugoj studiji, PCR u kapljicama je proveden za kvantitaciju cirkulirajuće mitohondrijske DNK [9].

nedavno, Sato et al. [26,27] objavili su odličan protokol za procjenu citoplazmatske DNK imunofluorescentnomikroskopijom koristeći Lamin B1 (LMNB1) antitijela kao marker nuklearne strukture i podjedinicu citokrom c oksidaze 4 (COX4) kao marker mitohondrijalne strukture. Čini se da je ovaj protokol vrlo koristan za kvantitaciju citoplazmatske dsDNK nuklearnog porijekla.

Međutim, kada smo pokušali COX4 ili druge markere mitohondrijske membrane, uključujući i unutrašnje i vanjske markere, bilo je vrlo teško precizno razlikovati citoplazmu od mitohondrija.

Na primjer, ako smo promatrali kružne signale pomoću markera mitohondrijalne membrane i promatrali dsDNK signale unutar, tada bi ova dsDNK mogla predstavljati ili mitohondrijsku DNK unutar kružnih mitohondrija (normalno) ili citoplazmatsku mitohondrijsku DNK izvan mitohondrija nalik krofnama (ektopična). Stoga smo koristili Hsp60 kao marker koji označava njihov mitohondrijalni matriks za procjenu ektopične mitohondrijalne DNK u citoplazmi.

Kao što je opisano u nedavnom pregledu [23], postoji mnogo različitih tipova citoplazmatske DNK nuklearnog porijekla, a većina njih je pozitivna na histonske markere. Zbog ograničenja kombinacije antitijela koja se koriste za trostruko bojenje, koristili smo histon H2Bas kao histonski marker.

Međutim, ako se ovo ograničenje riješi, H2AX može biti bolji marker za citoplazmatsku dsDNK nuklearnog porijekla. Histon-H2B-negativna citoplazmatska dsDNK rijetko je uočena u kontrolnim HeLa stanicama korištenim u ovoj studiji, ali takva dsDNK nuklearnog porijekla može biti prisutna ako se koriste druge ćelijske linije ili uvjeti.

In situ hibridizacija mitohondrijske DNK korištena u našem nedavnom radu je pogodna za kvalitativnu procjenu, ali može biti teško koristiti in situ hibridizaciju za kvantitativnu evaluaciju [8].

In situ hibridizacija izlaže uzorak visokim temperaturama, što može dovesti do deformacije ili buke nekih dijelova uzorka. S druge strane, imunocitokemijska metoda predstavljena u ovom radu može dobiti signale sa niskim pozadinskim šumom. U našem nedavnom radu, u ljudskim ćelijama i zebri korišćenim kao modeli Parkinsonove bolesti, pokazali smo da je mitohondrijska DNK iscurila u citoplazmu, koja je toksična za ćelije. Također smo primijetili da je količina citosolne mitohondrijalne DNK povećana u postmortem moždanim tkivima pacijenata s Parkinsonovom bolešću [8].

Ovi dokazi sugeriraju da povećana količina ektopične mitohondrijske DNK koja iscuri iz mitohondrija može izazvati akutnu i kroničnu upalu koja rezultira raznim bolestima, uključujući Parkinsonovu bolest i zatajenje srca; stoga bi pojačana regulacija degradacije citosolne DNK ili inhibicija njenih senzora mogla biti potencijalna terapijska meta za ove bolesti [8,28].

Metoda predstavljena u ovom radu za kvantitativnu procjenu ektopične mitohondrijalne DNK služi kao važan alat za dalja istraživanja u ovoj oblasti.

Doprinosi autora: HM i MTH su formulisali hipoteze, dizajnirali većinu eksperimenata, izveli eksperimente, analizirali podatke i napisali rukopis. NM je izveo eksperimente vezane za kultivisane ćelije. Svi autori su pročitali i pristali na objavljenu verziju rukopisa.

Finansiranje: Ovaj rad je podržan grantovima AMED-a (brojevi grantova JP21gm6110028 i JP19dm0107154 (HM)), Naučne fondacije Takeda (HM), JSPS KAKENHI (brojevi grantova JP14516799 (HM), JP35JPH777 (HM), JP35JPH767 ), JST (Moonshot R&D; grant broj JPMJMS2024 (HM)) i grantovi pomoći od TBRF-a (broj granta TBRF-RF 21-135 (HM)).

Izjava o dostupnosti podataka: Podaci i alati opisani u ovom rukopisu dostupni su na zahtjev.

Priznanja: Zahvaljujemo Shinano Kobayashiju na učešću u korisnim diskusijama i pružanju kontinuirane podrške. Zahvaljujemo Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) za pružanje TBRF postdoktorske stipendije za strane istraživače MH (TBRF-RF 21-135).

Sukob interesa: Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Reference

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sun, L.; Chen, ZJ Ključne uloge cGAS-cGAMP signalizacije u antivirusnoj odbrani i imunoadjuvantnim efektima. Nauka 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Acetilacija nuklearnog IFI16 izazvana prepoznavanjem herpesvirusnog genoma je neophodna za njegovu citoplazmatsku translokaciju, inflamazom i IFN-odgovore. PLoS Patog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, DM cGAS posredovana stabilizacija IFI16 promovira urođenu signalizaciju tokom infekcije virusom herpes simpleksa. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP koji luči intracelularna Listeria monocytogenes aktivira odgovor tipa Iinterferon domaćina. Science 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Citoplazmatski hromatin izaziva upalu u starenju i rak. Nature 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Barber, GN; et al. Smanjenje regulacije citoplazmatskih DNaza je uključeno u akumulaciju citoplazmatske DNK i SASP u starim ćelijama. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.; Chin, HS; et al. BAK/BAX makropore olakšavaju mitohondrijalnu hernijaciju i efluks mtDNK tokom apoptoze. Science 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Citosolna dsDNK mitohondrijalnog porijekla inducira citotoksičnost i neurodegeneraciju u ćelijskim modelima i modelima zebrice Parkinsonove bolesti. Nat. Commun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sun, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin i PINK1 ublažavaju upalu izazvanu STING-om. Nature 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, MP; Croteau, DL; Bohr, VA NAD(+) suplementacija smanjuje neuroinflamaciju i starenje stanica u transgenskom mišjem modelu Alchajmerove bolesti putem cGAS-STING-a. Proc. Natl.Acad. Sci. SAD 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com