Abstract

Poremećaji hiperpigmentacije kože, kao što su melazma, pjege i postinflamatorna hiperpigmentacija (PIH), često su izazvani ultraljubičastim-B (UVB) zračenjem, ozljedama kože i lokalnom upalom kože. Prekomjerno taloženje melanina narušava izgled kože i negativno utječe na psihičko stanje pacijenta. Konvencionalni agensi za depigmentaciju, kao što je hidrokinon, prvenstveno ciljaju tirozinazu sa jednostrukim djelovanjem i nose dobro dokumentirane sigurnosne rizike. Višeciljne prirodne botaničke mješavine pojavile su se kao obećavajuće alternative za moderne funkcionalne kozmetičke formulacije.

Feniletanoidni glikozidi (PhG) su prepoznatljivi bioaktivni sastojci izolovani izCistanche deserticola, dobro poznata ljekovita biljka iz sušnih pustinjskih krajeva. Glabridin (Gla), prenilovani izoflavan ekstrahovan izGlycyrrhiza glabra, nadaleko je poznat kao prirodni spoj visoke snage za posvjetljivanje kože. Ovo istraživanje sistematski je istraživalo sinergistički učinak PhG-a u kombinaciji s glabridinom protiv hiperpigmentacije. In-vitro biohemijski testovi uključujući inhibiciju tirozinaze, DPPH i ABTS⁺ testove uklanjanja slobodnih radikala primijenjeni su za preliminarni skrining masenog omjera. Nadalje su konstruirana tri ćelijska modela: UVB-ozračeni B16F10 model pigmentacije ćelija melanoma miša; model inflamacije HaCaT keratinocita stimulisan lipopolisaharidom (LPS); Model HaCaT oksidativnog stresa izazvan AAPH. Indikatori koji pokrivaju aktivnost intracelularne tirozinaze, sadržaj melanina, proinflamatorno oslobađanje citokina (IL‑6, TNF‑), aktivnost enzima superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) su kvantificirani. Proračun kombiniranog indeksa (CI) je implementiran kako bi se kvantitativno identificirala sinergijska interakcija između dva botanička ekstrakta.

Među testiranim proporcijama, omjeri mase m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 i 10:1 pokazali su istaknutu sinergiju supresije tirozinaze i antioksidansa. Pri ukupnoj koncentraciji od 0,4 g/L u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom (PBS) pH 6,8, stope inhibicije tirozinaze dostigle su 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) i 88,06 % (10:1). Odgovarajući procenti uklanjanja radikala DPPH bili su 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; Kapaciteti uklanjanja radikala ABTS⁺ kationa ostvareni su 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Pri radnoj koncentraciji od 25 ug/mL, sve tri formulacije spojeva nisu pokazale značajnu citotoksičnost prema B16F10 i HaCaT ćelijskim linijama. Kombinirana grupa 1:1 postigla je superiornu sveobuhvatnu efikasnost: rezidualna intracelularna aktivnost tirozinaze je pala na 23,80 %, relativni sadržaj melanina je smanjen na 30,90 %. Štaviše, PhGs/Gla (1:1) je izvršio najjaču supresiju na IL-6 i TNF- sekreciju i maksimalno obnovio aktivnost enzima antioksidansa SOD i CAT. Eksperimentalni rezultati su potvrdili da PhG upareni s glabridinom postižu sinergističke rezultate protiv hiperpigmentacije putem trostrukih puteva: inhibiranjem biosinteze melanina, ublažavanjem upale kože i suzbijanjem oksidativnog stresa. Maseni omjer 1:1 pruža optimalne integrirane biološke performanse. Ova studija pruža eksperimentalne dokaze koji podržavaju primjenuCistanchefeniletanoidni glikozidi-glabridin kompozitni materijali u razvoju sirovog materijala za izbjeljivanje kože biljnog porijekla za čistu ljepotu.

Ključne riječi: Cistanche deserticolafeniletanoidni glikozidi; glabridin; sinergijski efekat; protiv hiperpigmentacije; antioksidans; protiv upale; kozmetičke botaničke sirovine

1. Uvod

Prekomjerna akumulacija melanina u epidermalnim slojevima dovodi do heterogenih fenotipova pigmentacije kože, uključujući melazmu, efelide i postinflamatornu hiperpigmentaciju (PIH). UVB ultraljubičasto zračenje predstavlja primarni pokretač okoline; trauma kože i kronični lokalni upalni odgovori dodatno pojačavaju pigmentne poremećaje. Dobro je poznato da unakrsni razgovor između epidermalnih keratinocita i melanocita dominira progresijom pigmenta. Nakon vanjske stimulacije, aktivirani keratinociti oslobađaju reaktivne kisikove vrste (ROS) i proinflamatorne medijatore. Ovi signalni molekuli difundiraju i djeluju na susjedne melanocite, regulišući katalitičku aktivnost tirozinaze, ubrzavajući sintezu melanina i promovirajući transport melanosoma prema keratinocitima, konačno stvarajući vidljive pigmentirane lezije na površini kože. Shodno tome, efikasna intervencija za hiperpigmentaciju ne može se fokusirati samo na inhibiciju tirozinaze. Multimodalne terapijske strategije trebale bi istovremeno pokrivati ​​inhibiciju melanogeneze, antiinflamatornu intervenciju i neutralizaciju oksidativnog stresa.

Tradicionalni sintetički aktivni sastojci za posvjetljivanje kože kao što je hidrokinon daju djelotvornost depigmentiranja uglavnom direktnom supresijom tirozinaze. Ipak, mehanizmi s jednom metom ograničavaju praktične performanse, a dugotrajna lokalna primjena hidrokinona može izazvati iritaciju kože, kontaktni dermatitis i potencijalne sigurnosne opasnosti, ograničavajući obim upotrebe kozmetičkih proizvoda. Prirodni biosastojci iz biljaka privlače sve veći interes kozmetičkih formulatora i potrošača zbog svojih blagih profila i višestrukog farmakološkog djelovanja. Složene mješavine različitih biljnih ekstrakata sposobne su proizvesti sinergističke biološke efekte, povećavajući ukupnu učinkovitost uz smanjenje efektivnih zahtjeva za dozom, što otvara nove tehničke smjernice za istraživanje kozmetičkih sirovina protiv pigmentacije Google

Cistanche deserticola, koji se obično naziva "pustinjski ginseng", klasična je tonik biljka u tradicionalnoj kineskoj medicini. Moderna fitokemijska istraživanja otkrivaju da feniletanoidni glikozidi (PhG) čine njegovu glavnu farmakološki aktivnu frakciju, sa ehinakozidom i akteozidom kao reprezentativnim spojevima. Objavljena farmakološka istraživanja pokazuju da PhG poseduju snažan antioksidativni kapacitet, antiinflamatornu bioaktivnost i umereni potencijal inhibicije tirozinaze, što implicira potencijalne izglede za primenu u dermatološkim materijalima za njegu kože. Glabridin je karakteristično jedinjenje izoflavonoida izolovano izGlycyrrhiza glabrakorijen, dobro poznat u kozmetičkoj industriji kao "zlato za izbjeljivanje". Snažno suzbija melanogenezu i istovremeno modulira kožne upalne kaskade. Iz teorijske perspektive tradicionalne medicine,Cistanchehrani esenciju bubrega i tonizira jang, dok korijen sladića tonizira slezinu i čisti toplotni toksin. Kombinovana upotreba je u skladu sa principima kompatibilnosti biljnih dermatoloških terapija.

Mehanistička hipoteza drži da kombinacija PhGs-glabridina može regulirati pigmentaciju kože putem višeciljnih i višeputnih načina: zajedničko inhibiranje katalitičke funkcije tirozinaze kako bi se prekinulo porijeklo proizvodnje melanina; gašenje nakupljanja reaktivnog kiseonika; ograničavanje prekomjernog oslobađanja proinflamatornog faktora, kako bi se prekinulo pojačanje signala posredovano ROS-om i citokinima za aktivaciju melanocita. Do danas, nekoliko istraživačkih radova je sistematski izvještavalo o sinergističkoj procjeni anti-hiperpigmentacije za ovu binarnu mješavinu.

Ovaj rad ima za cilj da istraži kombinovane biološke efekte izmeđuCistanchefeniletanoidni glikozidi i glabridin. Prvo su sprovedeni eksperimenti skrininga inhibicije enzima in-vitro i uklanjanja radikala. Za višedimenzionalnu procjenu efikasnosti konstruirana su tri reprezentativna ćelijska modela koja oponašaju taloženje pigmenta, upalu kože i oksidativno oštećenje. Metodologija kombinovanog indeksa primijenjena je za kvantificiranje interakcija sinergije ili antagonizma. Cilj nam je bio da odredimo optimalni omjer mase jedinjenja, razjasnimo funkcionalne mehanizme trostrukog režima i pružimo podršku eksperimentalnim podacima za razvoj prirodnih sinergističkih kozmetičkih sirovina za posvjetljivanje kože.

2. Materijali i metode

2.1 Reagensi, ćelijski sojevi i laboratorijski instrumenti

Ćelijska linija mišjeg melanoma B16F10 (STCC20013G‑1) kupljena je od Saierbio Co., Ltd. Imortalizirani humani epidermalni keratinocit HaCaT (iCell‑h066) je nabavljen od iCell Bioscience Inc.Cistanchefeniletanoidne glikozide (PhGs) i glabridin (Gla) komercijalno je isporučio Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Tirozinaza gljiva, arbutin, L-tirozin, L-DOPA, DPPH, ABTS diammonijumska so, L-AAV, L-AAA, L-tirozin, Triton X‑100, DMSO i drugi hemijski reagensi analitičkog kvaliteta nabavljeni su od glavnih dobavljača biohemijskih reagensa. Potrošni materijal za ćelijsku kulturu uključivao je DMEM medijum sa visokim sadržajem glukoze, fetalni goveđi serum, mešani rastvor penicilina i streptomicina. Kompleti za ELISA test koji ciljaju na humani IL-6, TNF-, CAT i komplet za detekciju total-SOD nabavljeni su od odgovarajućih biotehnoloških proizvođača.

Ključna laboratorijska oprema je sadržavala Multiskan FC čitač mikroploča pune talasne dužine, Heracell 371 CO₂ inkubator (Thermo Fisher); KQ‑200VDB ultrazvučni čistač; vodeno kupatilo konstantne temperature; DHG‑9246A pećnica za brzo sušenje; KN4006B UVB instrument za ultraljubičasto zračenje sa izlaznom zračenjem od 8 mW/cm².

2.2 Priprema rastvora uzorka

Osnovni rastvori PhGs i glabridina su pripremljeni u pH 6,8 PBS puferu ili 50 % (v/v) rastvaraču etanol-voda, serijski razblaženim do radnih koncentracija: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L, 0,1 g/L, g/L, 1,6 g/L, 2,0 g/L. Devet kompozitnih grupa je konfigurisano na fiksnu ukupnu koncentraciju mase od 0,4 g/L sa različitim masenim proporcijama m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20/, dizajnom od 1:40 G (1:40) PhGs/Gla (1:40).

Za testove ćelijskog eksperimenta, uzorci praha su rastvoreni u DMEM medijumu bez seruma da bi se pripremio niz rastvora radne koncentracije.

2.3 Biohemijski testovi in-vitro

2.3.1 Test inhibicije tirozinaze

50 μL rastvora uzorka, 50 μL pH 6,8 PBS i 50 μL rastvora supstrata od 1 g/LL-tirozina su uzastopno dodavani u svaku jažicu na mikroploči sa 96 jažica. Prethodna inkubacija je nastavljena u vodenom kupatilu na 37 stepeni tokom 10 minuta. Zatim je dodato 50 μL 0,4 g/L rastvora tirozinaze pečuraka (200 U/mL) i inkubacija je nastavljena na 37 stepeni tokom 10 minuta. Arbutin je funkcionisao kao pozitivna kontrolna supstanca, slepa kontrola je usvojila pH 6,8 PBS pufer. Vrijednost apsorpcije mjerena je pod talasnom dužinom od 490 nm na čitaču mikroploče. Formula za izračunavanje stope inhibicije tirozinaze:

Stopa inhibicije tirozinaze (%)={1 − [(A_reakcija − A_reakcija‑kontrola) / (A_blank − A_blank‑kontrola)]} × 100 %

Gdje: A_reakcija: apsorbancija koja sadrži uzorak, supstrat, PBS i tirozinazu; A_reaction-control: apsorbancija uzorka, supstrata i PBS-a bez enzima; A_blank: apsorpcija supstrata, PBS i tirozinaze; A_blank‑kontrola: apsorpcija samo za supstrat i PBS pufer.

2.3.2 Određivanje uklanjanja slobodnih radikala DPPH

DPPH prah je otopljen u bezvodnom etanolu da se dobije 0,2 mmol/L DPPH radne tečnosti. PhG, glabridin i referentna supstanca vitamina C otopljeni su u 50% rastvaraču etanol-voda da bi se formirale osnovne otopine s gradijentom koncentracije. Uzorci binarne mješavine sa devet masenih omjera ravnomjerno su pomiješani. Svaki bunar primio je 100 μL tečnosti uzorka plus 100 μL DPPH radne otopine. Nakon temeljitog miješanja, mikroploča je držana dalje od svjetlosti na sobnoj temperaturi 30 minuta. Očitavanje apsorpcije je zabilježeno na λ = 517 nm. Vitamin C je djelovao kao pozitivna kontrola, svaka eksperimentalna grupa je ponovljena u 3 biološka ponavljanja. Formula DPPH-brzine čišćenja:

Stopa uklanjanja DPPH (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: apsorpcija uzorka + DPPH radni fluid; A₂: apsorpcija 50 % etanola + DPPH radni fluid; A₃: apsorbancija rastvora uzorka pomešanog sa 50% rastvaračem etanola.

2.3.3 ABTS⁺ Analiza uklanjanja radikala kationa

7,4 mmol/L ABTS osnovnog rastvora i 2,6 mmol/L rastvora kalijum persulfata su pomešani podjednako, inkubirani u tamnom okruženju 12 h da bi se dobio stabilan ABTS⁺ radni reagens. Otopine za uzorke su konfigurisane prema protokolima opisanim u odjeljku 2.3.2. 40 µL otopine uzorka i 160 µL ABTS⁺ radne tekućine su pipetirane u jažice mikroploče. Nakon inkubacije zaštićene svjetlošću od 6 minuta na sobnoj temperaturi, mjerena je apsorpcija na 734 nm. ABTS⁺ formula za brzinu uklanjanja radikala:

ABTS⁺ stopa čišćenja (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: apsorbancija rastvora uzorka plus ABTS⁺ radni rastvor; A₂: apsorpcija dejonizovane vode pomešane sa ABTS⁺ radnim reagensom; A₃: vrijednost apsorpcije za otopinu uzorka pomiješanu s čistim rastvaračem dejonizirane vode.

2.4 Postupci kulture ćelija

B16F10 ćelije melanoma i HaCaT keratinociti uzgajani su u DMEM mediju sa visokim sadržajem glukoze i dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma i 1% penicilin-streptomicina. Parametri inkubatora: 37 stepeni, 5 % zapreminski udio CO₂, relativna vlažnost 70 %. Pasiranje ćelija i osvježavanje medija izvedeni su prema gustini ćelijskog rasta promatranom pod invertiranim optičkim mikroskopom. Ćelije u fazi logaritamskog rasta sakupljene su za naknadno zasijavanje na ploče za kulturu sa 96 jažica.

2.5 Uspostavljanje tri ćelijska funkcionalna modela

2.5.1 Model pigmentacije B16F10 izazvan UVB-om

Nakon 1 h prethodnog tretmana sa odgovarajućim uzorkom medijuma, površina ćelijskog sloja je prekrivena PBS puferom. Intenzitet UVB zračenja postavljen je na 8 mW/cm², udaljenost zračenja 3 cm, trajanje zračenja 110 s. Normalna grupa je dobila identičnu podlogu bez intervencije UVB zračenja. Model kontrolne grupe je dobila PBS prettretman nakon čega je uslijedilo izlaganje jednakim dozama UVB bez dodavanja uzorka.

2.5.2 Model inflamatorne aktivacije HaCaT posredovan LPS-om

HaCaT ćelije su prethodno inkubirane sa DMEM medijumom za testiranje uzorka tokom 24 h. Nakon toga je dodavan rastvor lipopolisaharida LPS da bi se postigla konačna koncentracija od 20 ug/mL, a kokultura je trajala još 24 h. Ćelije modelske grupe su bile izazvane LPS-om bez prethodnog tretmana uzorka. Normalna grupa je održavala običnu potpunu-srednju kultivaciju.

2.5.3 AAPH-pokrenut HaCaT model oksidativnog stresa

Ćelije su primile predinkubaciju uzorka od 24 sata. AAPH reagens je dodan u medijum za kulturu, konačna koncentracija 25 mmol/L, uz nastavak inkubacije od 24 sata. Model-kontrolna grupa je stimulirana AAPH bez intervencije uzorka. Normalna kontrolna grupa je rasla u normalnim srednjim uslovima.

Sve grupe ćelijskih modela sadržavale su tri tehničke replikacije.

2.6 Test citotoksičnosti (CCK-8 metoda)

Suspenzija ćelija je podešena na gustinu 1 × 10⁴ ćelija/mL i inokulisana na mikroploče sa 96 jažica. Nakon adherencije ćelija, dat je medij uzorka sa gradijentom koncentracije, a inkubacija je nastavljena 24 h, 48 h, 72 h. Reagens za detekciju CCK-8 pomešan sa svežim DMEM medijumom (volumenski udeo 10 %) zamenio je stari medij, inkubacija je trajala 60 min. Čitač mikroploče je izmjerio apsorbanciju na talasnoj dužini od 450 nm. Formula za izračunavanje za relativni procenat vitalnosti ćelija:

Vijabilnost ćelije (%)=[(A_uzorak − A_prazno) / (A_0 − A_prazno)] × 100 %

A_uzorak: apsorpcija ćelija koje sadrže bunar, CCK‑8 reagens i medij za uzorkovanje; A_blank: apsorpcija za medijum kulture plus CCK-8 bez zasijanih ćelija; A_0: apsorpcija ćelija i CCK‑8 reagensa uzgojenog na slijepom mediju (bez uzoraka za testiranje).

2.7 Kvantifikacija unutarćelijske aktivnosti tirozinaze

Nakon 48 h obrade uspostavljanja modela, ćelijski supernatant je odbačen. Ćelijski monosloj je dva puta ispran sa pH 7,4 PBS. 50 μL 1% rastvora Triton X-100 za lizu je dodan po jažici. Mikroploča je zamrznuta na -80 stepeni u frižideru 30 minuta, a zatim odmrznuta na sobnoj temperaturi za punu rupturu ćelijske membrane. Tretman pre zagrijavanja na 37 stepeni trajao je 5 min. L-DOPA supstrat (10 mmol/L, 10 μL) je dopunjen. Mikroploča je inkubirana 1 h unutar CO₂ inkubatora. Apsorpcija je detektirana na 475 nm za izračunavanje relativne intracelularne aktivnosti tirozinaze.

2.8 Intracelularno mjerenje sadržaja melanina

Metoda cijepanja NaOH je usvojena za detekciju sadržaja melanina. Nakon intervencije modela nakon 72‑h, supernatant kulture je uklonjen, ćelije su dva puta isprane korištenjem PBS pufera. 100 μL 1 mol/L vodenog rastvora NaOH koji sadrži 10% DMSO je dodan. Mikroploča je inkubirana u pećnici na 90 stepeni tokom 60 minuta za potpuno rastvaranje melanina. Apsorpcija je očitana na 490 nm da bi se izračunao relativni procenat sadržaja melanina.

2.9 Detekcija indikatora faktora upale i enzima antioksidansa

Nakon 48-časovne obrade modela, HaCaT ćelije su ostrugane i sakupljene, centrifugirane da bi se sakupio ćelijski supernatant. Komercijalni ELISA kompleti korišteni su za kvantitativno određivanje koncentracija IL-6 i TNF-pro-inflamatornih citokina. Za testiranje antioksidativnih enzima, ćelijske pelete su podvrgnute ponovljenim ciklusima zamrzavanja-odmrzavanja kako bi se postigla fragmentacija ćelija. Uslovi centrifugiranja: 12 000 r/min, 4 stepena, 10 min. Frakcija supernatanta je sakupljena za analizu vitalnosti SOD i sadržaja CAT enzima prema operativnim specifikacijama kita.

2.10 Analiza kombinovanog indeksa (CI).

Chou-Talalay kombinacija-indeks (CI) algoritam je implementiran kako bi se ocijenila sinergistička/aditivna/antagonistička interakcija između PhGs i glabridina u okviru inhibicije tirozinaze i antioksidativnih testova:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 predstavlja antagonističku interakciju; CI ≈ 1 znači aditivni efekat; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistička analiza

Eksperimentalni rezultati mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (srednja vrijednost ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 softver je izvršio statističko izračunavanje. Jednosmjerna analiza varijanse (ANOVA) korištena je za poređenje u više grupa. P-vrijednost< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Rezultati i diskusija

3.1 In-vitro učinak inhibicije tirozinaze u uzorcima PhGs, Glabridina i binarnih mješavina

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

Pri ukupnoj koncentraciji od 0,4 g/L za rastvor jedinjenja PBS, PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) isporučuju stopu inhibicije tirozinaze od 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. I omjeri 5:1 i 1:1 nadmašili su efikasnost inhibicije jednokomponentnih PhG (36,92 %) i jednokomponentnog glabridina (92,71 %) u skladu s ukupnom koncentracijom mase. Grupa 1:1 postigla je magnitudu inhibicije uporedivu sa pozitivnom kontrolom arbutina. Prema rezultatima izračunavanja CI-vrijednosti: m(PhGs):m(Gla) u rasponu od 40:1 do 1:1 generirani CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, manifestirajući antagonističku interakciju.

Fenolne hidroksilne grupe čine jezgro funkcionalnog dijela za kapacitet inhibicije tirozinaze. PhG sadrže orto-dihidroksifenil strukturne fragmente sposobne da keliraju ione bakra unutar katalitički aktivnog džepa tirozinaze, kompetitivno ometajući vezivanje supstrata za enzim. Glabridin izoflavan skelet nosi 2‑OH i 4‑OH grupe na svom B-prstenu, strukturno analogan L-tirozin / L-DOPA aromatičnom hidroksil-supstituisanom prstenu, omogućavajući kompetitivno zauzimanje domena aktivnog enzima. Nakon miješanja jedinjenja, kumulativna količina fenol-hidroksila raste; u međuvremenu, dva molekula se mogu vezati za različita mjesta vezivanja proteina tirozinaze, zajedno pojačavajući inhibitornu efikasnost.

3.2 Antioksidativna aktivnost testnih uzoraka za čišćenje radikala

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridin. PhG-ovi su bogati dijelovima kofeoil grupe i 3,4-dihidroksifeniletanola, sa konjugiranim sistemima dvostruke veze koji jačaju učinak neutralizacije slobodnih radikala. Glabridin flavonoidni okvir takođe daje hidroksilne grupe i proširenu arhitekturu konjugovanog prstena za stabilizaciju nesparenih elektrona iz reaktivnih vrsta kiseonika.

Tri obećavajuće grupe jedinjenja PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) pokazale su odlične performanse uklanjanja DPPH‑ i ABTS⁺‑. Stopa uklanjanja ABTS⁺-a je skoro dostigla 100%, što ukazuje na skoro potpunu eliminaciju slobodnih radikala kationa. Različiti omjeri mase proizvode različita stanja molekularne interakcije između dva molekula, što dovodi do dispariteta u statusu izloženosti hidroksilnih grupa i rezultira divergencijom sinergističke veličine antioksidansa.

3.3 Procjena citotoksičnosti PhGs, Glabridina i miješanih preparata

Ispitivanje citotoksičnosti CCK-8 pokazalo je da PhG u opsegu koncentracije 62,5 ~ 500 ug/mL i glabridin 6,25 ~ 25 ug/mL nisu izazvali očigledno smanjenje vitalnosti za B16F10 i HaCaT ćelijske linije. U uslovima ukupne masene koncentracije od 25 ug/mL, tri grupe u omjeru jedinjenja PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) održale su visoku vijabilnost ćelija, ne pokazujući citotoksični efekat na oba ćelijska soja. Shodno tome, 25 ug/mL je odabrano kao sigurna radna koncentracija za naknadnu procjenu ćelijske funkcije. Za grupe sa jednim agensom, niske/srednje/visoke doze PhGs definisane su kao 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL; glabridin niska/srednja/visoka doza: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/mL, 25 ug/mL.

3.4 Utjecaj na aktivnost intracelularne tirozinaze i sadržaj melanina u B16F10 ćelijama stimuliranim UVB zrakama

Nakon tretmana UVB zračenjem, model-grupa B16F10 pokazala je statistički značajno povećanje aktivnosti intracelularne tirozinaze i akumulacije melanina (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Pri jedinstvenoj ukupnoj koncentraciji od 25 ug/mL, grupe jedinjenja pokazale su superiorne biološke rezultate u odnosu na jednokomponentne grupe. Među tri omjera, PhGs/Gla (1:1) je dao optimalan efekat: rezidualna intracelularna aktivnost tirozinaze samo 23,80 %, relativni sadržaj melanina je pao na 30,90 %. Statističko poređenje je pokazalo značajnu razliku u poređenju sa grupama spojeva 5:1 i 10:1. Proporcija 1:1 pokazala je istaknuto sinergističko pojačanje za ograničavanje biosinteze melanina unutar ćelija melanocita.

UVB zračenje provocira intrinzičnu melanogenu signalnu kaskadu melanocita, regulišući ekspresiju MITF transkripcionog faktora i dalje indukujući prekomernu ekspresiju proteina tirozinaze. Naši rezultati ćelijskog eksperimenta potvrdili su da PhG u kombinaciji sa glabridinom mogu efikasno preokrenuti UVB-indukovanu aktivaciju tirozinaze i smanjiti stvaranje melanina.

3.5 Protuupalni učinak na HaCaT keratinocite izazvane LPS-om

LPS stimulacija je snažno povećala lučenje IL-6 i TNF-pro-inflamatornih-citokina u HaCaT grupi modela (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). Formulacija 1:1 dovela je do maksimalnog smanjenja oslobađanja IL-6 i TNF-a, nadmašujući inhibitorni efekat dobijen odvojenom primjenom PhG-a ili glabridina.

Objašnjenje molekularnog mehanizma: PhGs fenolno-hidroksilni dio uklanja slobodne radikale koji izazivaju upale; štaviše, PhGs mogu ometati NF-κB i MAPK intracelularne signalne kaskade kako bi obuzdali transkripciju proinflamatornog gena. Glabridin inhibira fosforilaciju kinaze JNK i p38 aktivirane stresom, blokirajući nizvodnu transdukciju upalnog signala. Pojedinačna supstanca može samo djelomično potisnuti aktivaciju upalnog signalnog puta. Binarna kombinacija simultano intervenira na više čvorova unutar upalne signalne mreže, postižući sinergistički antiinflamatorni učinak.

Upala kože služi kao kritični uzvodni pokretač za pojavu PIH-a. Upalni citokini koje luče keratinociti djeluju kao parakrini signalni glasnici, stimulirajući susjedne melanocite da ubrzaju proizvodnju melanina i prijenos melanosoma. Učinkovito ublažavanje upale epidermisa ključno je za prevenciju i poboljšanje hiperpigmentacijskih lezija. Stoga, antiinflamatorna prednost jedinjenja PhGs-glabridina daje dodatnu vrijednost za primjenu kozmetičkih materijala protiv pigmentacije.

3.6 Kapacitet regulacije antioksidansa enzima u uslovima oksidativnog stresa izazvanog AAPH

Grupa modela AAPH oksidativnog stresa pokazala je očigledan pad vitalnosti intracelularnog SOD i CAT antioksidativnog enzima (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Koža izložena ultraljubičastom zračenju stvara velike količine reaktivnog kiseonika. Višak ROS ne samo da direktno oksidira biomolekule povezane sa sintezom melanina, već također aktivira višestruke melanogene signalne puteve. Endogeni antioksidans-enzimski sistem (SOD, CAT) predstavlja glavnu odbrambenu barijeru za eliminaciju intracelularnog ROS. Kada oksidativni stres preplavi intrinzični antioksidativni kapacitet, akumulacija ROS-a ubrzava napredovanje pigmentacije. PhGs-glabridin jedinjenje ne samo da direktno uklanja slobodne radikale putem fenol-hidroksil hemijske reakcije, već i popravlja funkciju ćelijskog antioksidativno-enzimskog sistema, ublažavajući oštećenja od oksidativnog stresa iz dvije dimenzije. Različiti omjeri mase mijenjaju obrazac molekularne interakcije između dva prirodna molekula, što dovodi do neslaganja u konačnoj djelotvornosti regulacije antioksidansa.

3.7 Sveobuhvatna diskusija o mehanizmu za sinergističku anti-hiperpigmentaciju

Patološki proces hiperpigmentacije kože formira složenu signalnu mrežu: UVB zračenje djeluje i na melanocite i na okolne keratinocite. Keratinociti oslobađaju ROS i proinflamatorne citokine. Ovi bio-signali dodatno aktiviraju melanocite, pojačavaju aktivnost tirozinaze, pojačavaju biosintezu melanina i olakšavaju transport melanosoma prema epidermalnim keratinocitima, što konačno dovodi do vidljivog taloženja pigmenta na površini kože. U skladu s tim, jednociljna inhibicija tirozinaze ne može u potpunosti poništiti patološku pigmentaciju. Strategija višestruke intervencije treba da integriše inhibiciju melanogeneze, anti-inflamaciju i antioksidativnu zaštitu.

Naši eksperimentalni rezultati su pokazali da PhG u kombinaciji s glabridinom ostvaruju multimodalnu intervenciju protiv hiperpigmentacije:

Direktno potisnuti katalitičku aktivnost tirozinaze unutar melanocita kako bi se inhibirao izvor biosinteze melanina;

Inhibiraju prekomjerno lučenje proinflamatornih citokina iz keratinocita, odsijecajući signal parakrine inflamatorne stimulacije prema melanocitima;

Eliminišite višak reaktivnih vrsta kiseonika i obnovite aktivnost endogenog SOD/CAT antioksidativnog enzima, ublažavajući pojačanje pigmenta posredovano oksidativnim stresom.

Omjer m(PhGs):m(Gla) = 1:1 pokazao je optimalne sveobuhvatne sinergističke performanse kroz biohemijsku inhibiciju enzima, uklanjanje radikala, pigmentni model melanocita, model inflamacije keratinocita i model oksidativnog stresa. Ovaj omjer je nadmašio grupe od 5:1 i 10:1 u gotovo svim indikatorima testiranja. Sinergija može proizaći iz komplementarnih molekularno-strukturnih karakteristika: PhGs i glabridin posjeduju različite okvire fenolnog skeleta, u interakciji s različitim ciljnim proteinima (tirozinaza, inflamatorne signalne kinaze, putevi povezani sa antioksidativnim enzimima). Nakon miješanja jedinjenja, status izloženosti fenolu i hidroksilu se optimizira kroz međumolekularnu interakciju, povećavajući ukupnu biološku aktivnost.

Za praktičnu perspektivu kozmetičke industrije, sinergijski botanički spojevi sirovine donose dvije velike prednosti. Prvo, sinergistički efekat omogućava smanjenje potrebne doze za svaki pojedinačni aktivni sastojak, smanjujući troškove formulacije; drugo, višestruki funkcionalni profil poklapa se sa složenim patološkim mehanizmom klinički uočene hiperpigmentacije kože kao što su PIH i melazma, nudeći teorijsku osnovu za razvoj visokoefikasnih prirodnih kozmetičkih formula za posvjetljivanje kože.

4. Zaključak

Ovo istraživanje sistematski je evaluiralo sinergističku antihiperpigmentacijsku bioaktivnostCistanche deserticola-izvedenafeniletanoidni glikozidi (PhGs) u kombinaciji sa glabridinom (Gla). Biohemijski in vitro skrining i tri reprezentativna ćelijska modela su korišteni za višedimenzionalnu karakterizaciju efikasnosti. Glavni eksperimentalni zaključci su sažeti na sljedeći način:

Unutar in-vitro biohemijskih testova za inhibiciju tirozinaze i uklanjanje slobodnih radikala, formulacije jedinjenja m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 pokazale su povoljne inhibitorne performanse i sinergističke interakcije. Pod ukupnom koncentracijom od 0,4 g/L u pH 6,8 PBS, stope inhibicije tirozinaze su dostigle 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). Stope uklanjanja DPPH radikala: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. Stope uklanjanja ABTS⁺radikala: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Pri sigurnoj radnoj koncentraciji od 25 ug/mL, PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) otopine DMEM nisu pokazale citotoksičnost protiv B16F10 ćelija melanoma i HaCaT ljudskih keratinocita. Među ovim grupama, PhGs/Gla (1:1) je postigao najbolju integrisanu efikasnost: aktivnost intracelularne tirozinaze smanjena je na 23,80 %, sadržaj melanina smanjen na 30,90 %. Stvorio je najjaču inhibiciju oslobađanja IL-6, TNF-inflamatornih-citokina i maksimalnu obnovu vitalnosti SOD i CAT antioksidans-enzima. Grupa sa omjerom mase 1:1 pokazala je očigledan efekat sinergističkog poboljšanja superiorniji u odnosu na grupe sa jednim agensom i druge grupe s omjerom jedinjenja.

Binarna mješavina PhGs i glabridina djeluje protiv hiperpigmentacije kože putem trostrukih puteva: suzbijanje biosinteze melanina, ublažavanje upale epiderma i suzbijanje oštećenja uzrokovanog oksidativnim stresom. Optimalni sinergistički omjer mase m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Ova studija pruža eksperimentalne dokaze i tehničku podršku za razvoj prirodnih multifunkcionalnih kozmetičkih sirovina iz prirodnih biljaka za primjenu za posvjetljivanje kože i protiv pigmentacije.

Priznanja

Ovaj rad je finansijski podržala Nacionalna fondacija za prirodne nauke Kine (grant br.. 82160772). Zahvaljujemo Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Research za podršku eksperimentalne platforme.

Reference

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Menadžment hiperpigmentacije: Trenutni tretmani i terapije u nastajanju [J]. Istraživanje pigmentnih ćelija i melanoma, 2021, 34(6):1000‑1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher D E. Pigmentacija kože i njena kontrola: od ultraljubičastog zračenja do matičnih ćelija[J]. Eksperimentalna dermatologija, 2021, 30(4):560‑571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et al. Tretman melazme: sistematski pregled[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816‑1837.

[4] Hossain M R, Ansary T M, Komine M, et al. Raznovrsni inflamatorni putevi izazvani stimulacijom uzrokuju pigmentaciju kože[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et al. Poređenje inhibitornih sposobnosti epigalokatehin-3-galata i galokatehin galata protiv tirozinaze i njihovih kombinovanih efekata sa kojičnom kiselinom[J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F, et al. Ciljanje tirozinaze kod hiperpigmentacije: Trenutni status, ograničenja i buduća obećanja[J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles‑Marsens F, et al. Egzozomi koje oslobađaju keratinociti moduliraju pigmentaciju melanocita[J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Intrinsic and extrinsic regulation of human skin melanogenesis and pigmentation[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328‑347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et al. Mehanistički pristup za procjenu toksičnosti i rizika od teških metala, hidrokinona i mikroorganizama u kozmetičkim kremama [J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et al. Iritirajuća reakcija kože izazvana hidrohinonom mogla bi se postići aktivacijom mastocita preko receptora X2[J] povezanog s G proteinom. Eksperimentalna dermatologija, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et al. Bibliometrijska analiza efekata ginsenga na kožu[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99‑107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et al. Napredak u biomedicinskim funkcijama prirodnih supstanci za izbjeljivanje u liječenju bolesti pigmentacije kože[J]. Farmaceutika, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J, et al. Sinergistička njega kože polifenola Lonicera japonica i etanolnog ekstrakta Vaccinium vitis‑idaea L.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et al. Primjena kompleksa hlapljivog ulja Salvia miltiorrhize i ekstrakta maslačka u kozmetici[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y, et al. Analiza varijacija aktivnih sastojaka i antioksidativnih aktivnosti Cistanche deserticola iz različitih pasmina i dijelova u provinciji Xinjiang[J]. Nauka i tehnologija prehrambene industrije, 2024, 45(21):227‑233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et al. Tubulozid B, izolovan iz Cistanche tubulosa, obećavajuće sredstvo protiv aktivacije M1 makrofaga putem sinergističkog ciljanja Mob1 i ERK1/2[J]. Biomedicina i farmakoterapija, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Studija o feniletanoidnim glikozidima Herba cistanches transdermalne isporuke i inhibitornim efektima na sintezu melanina kod B-indukovane pigmentacije kod smeđeg zamorca[D]. Urumqi: Medicinski univerzitet Xinjiang, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Sinergističko izbjeljivanje, antioksidativno i antiinflamatorno djelovanje kompleksa glabridina, resveratrola i poldatina[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99‑107,233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Proučavanje i primjena Chou-Talalay metode za kombinaciju antitumorskih lijekova [J]. Kineski časopis moderne primijenjene farmacije, 2013, 30(4):449‑453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Sredstva za izbjeljivanje kože: perspektiva medicinske hemije inhibitora tirozinaze[J]. Časopis za inhibiciju enzima i medicinsku hemiju, 2017, 32(1):403‑425