Sidt2 je ključni protein u putu autofagije-lizosomske degradacije i neophodan je za održavanje strukture bubrega i funkcije filtriranja Ⅱ
Nov 07, 2023
DISKUSIJA
Veliki broj studija je pokazao da su LMP uključeni u funkciju bubrega ili strukturnu homeostazu [21–25]. Naša prethodna studija je otkrila da LMP Sidt2 utječe na upalni signalni put i uzrokuje oštećenje glomerularnih mezangijalnih stanica miša [28]. U ovoj studiji po prvi put smo istraživali efekte na strukturu i funkciju mišjih bubrega uzrokovanih LMP Sidt2. Utvrđeno je da je delecija Sidt2 dovela do fuzije bubrežnih procesa miša, zadebljanja bazalne membrane, edema bubrežnih tubularnih epitelnih ćelija, oštećenja mikroresica i povećane proteinurije nakon 24 h, što ukazuje da gubitak Sidt2 dovodi do poremećene funkcije filtracije. i strukturu mišjeg bubrega, ali njegov detaljan mehanizam nije jasan.
Budući da su LMP važne funkcionalne jedinice lizosoma [17] ilizozomska disfunkcijaje jedan od čestih patogenih faktora mnogih hroničnih bubrežnih bolesti (CDK) (ref. [4, 29]), sproveli smo srodna istraživanja na lizosomima nakon delecije Sidt2 i otkrili da se smanjio broj kiselih lizosoma i pH lizozomi povećani in vitro. Međutim, nije bilo očiglednih promjena u broju primarnih lizosoma vezanih za autofagozome i ukupnih lizosoma analizom elektronskom mikroskopom. Katepsini predstavljaju najveću grupu proteolitičkih enzima u lizosomima [30], među kojima je CTSB jedna od najzastupljenijih lizozomskih proteaza [31].
Pošto katepsine treba zakiseliti za sazrevanje (aktivaciju), promena pH će na kraju dovesti do značajnog smanjenja razgradnje proteina [32]. In vivo i in vitro nivoi su pokazali smanjenu aktivnost i sadržaj lizosomalne kisele hidrolaze, dodatno potvrđujući da Sidt2 inhibira lizozomalnu funkciju utječući na sazrijevanje proteaza u lizosomima.
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE BILJNU FORMULACIJU CISTANCHE ZA BUBREGE
U međuvremenu, lizosom djeluje kao centar za reciklažu za razgradnju ćelijskih metabolita i otpadnih proizvoda na kraju autofagije [1]. Normalna funkcija lizozomske degradacije je neophodna za autofagiju, održavanje ćelijske homeostaze i omogućavanje ćelijama da prežive u fiziološkim stanjima [33-36]. Dokazano je da je pojava i razvoj mnogih bolesti bubrega povezana s abnormalnom autofagijom [37–39]. Nedavne studije su otkrile da je Sidt2 lizozomalni DNK/RNA transporter. Nekonvencionalni tipovi autofagije putem RNautofagije i DNautofagije (RDA) važni su za selektivnu degradaciju RNA/DNK [40]. Ranije smo otkrili da delecija Sidt2 oštećuje fuziju autofagosoma i lizosoma, uzrokujući nemogućnost degradacije oštećenih mitohondrija, što dovodi do oštećenja strukture i funkcije skeletnih mišića [41]. Stoga smo u ovoj studiji istraživali autofagiju kada je oštećenje bubrega uzrokovano brisanjem Sidt2. Uočili smo da su se autofagolizozomi akumulirali u bubrezima Sidt2−/− miševa putem elektronske mikroskopije. Autofagija je dinamičan proces, uključujući formiranje autofagosoma i formiranje i degradaciju autofagolizosoma. Formiranje ranih autofagosoma kontroliše Atg gen, a formiranje LC3-II je znak formiranja autofagosoma [42]. Otkrili smo da su se ekspresije proteina povezanih s autofagijom Atg i LC3-II povećale nakon delecije Sidt2, što ukazuje da bi aktivnost autofagije mogla biti pojačana. Međutim, akumulacija LC3-II također može biti uzrokovana blokadom autofagolizozomskog puta na kraju autofagije
Da bi se dalje istražio učinak Sidt2 na stanje autofagije bubrega, izmjerena je ekspresija i formiranje kargo proteina P62, a istraženi su i efekti lijekova koji ciljaju autofagiju (CQ i RAPA). P62 treba kombinovati sa LC3B i zatim razgraditi u lizozomu. Povećanje nivoa proteina P62 često predstavlja blokadu toka autofagije [43]. Kako bismo eliminisali uzrok povećanja proizvodnje P62, izmjerili smo nivo mRNA P62 i ustanovili da je proizvodnja P62 smanjena, tako da je akumulacija LC3-II vjerovatno uzrokovana otežanom degradacijom. Da bismo dalje istražili proces autofagije, izveli smo eksperiment okretanja hlorokina. Klorokin može neutralizirati kiselu sredinu lizosoma, a potom i uništiti funkciju lizosoma i inhibirati autofagiju [44]. Povećanje LC3-II proteina prije i nakon tretmana CQ odražava broj autofagosoma degradiranih lizosomima, što može odražavati aktivnost autofagije. Isti CQ flip test se takođe može koristiti za određivanje količine razgradnje P62 kroz put autofagolizosoma. U skladu s našim rezultatima, brisanje Sidt2 dovelo je do smanjenja toka autofagije zbog blokiranog kraja autofagije. Istovremeno, u RAPA eksperimentu, nivoi proteina LC3-II i P62 značajno su porasli u grupi Sidt2−/−, što može dodatno podržati da nedostatak Sidt2 narušava završnu fazu autofagije.
Završna faza autofagije uključuje formiranje i degradaciju autofagolizosoma. Koristili smo eksperimente kolokalizacije imunofluorescencije LAMP1 i LC3B za detekciju fuzije autofagosoma i lizosoma [45, 46], a rezultati su pokazali da je fuzija autofagosoma i lizosoma blokirana nakon delecije Sidt2. Ad-mCherry-GFP-LC3B eksperiment dvostrukog označavanja otkriva formiranje i degradaciju autofagolizosoma [27]. Nadalje je potvrđeno da je blokada formiranja i degradacije autofagolizosoma glavni razlog oštećenja strukture i funkcije bubrega nakon delecije Sidt2.
Iz navedenih rezultata možemo zaključiti da odsustvo Sidt2 uzrokuje smanjenje broja kiselih lizosoma i da disfunkcija acidifikacije lizosoma utiče na sazrijevanje hidroliziranih enzima. Ovo može biti najvažniji uzrok oštećenja puta degradacije autofagije-lizosoma pored poremećaja fuzije autofagosoma i lizosoma. U međuvremenu, poremećeni proces autofagije može biti usko povezan sa oštećenom strukturom bubrega i funkcijom filtera nakon delecije Sidt2 (slika 8). Naša studija se bavi samo dijelom efekata Sidt2 na strukturu i funkciju bubrega, ali ono što je zanimljivo je da su akumulacija ključnih proteina autofagije i oštećenje strukture i funkcije bubrega uzrokovano brisanjem Sidt2 slični promjenama ključnih proteina autofagije i značajno povećana proteinurija uočena kod dijabetičke nefropatije [37, 47]. Popravak funkcije lizosoma može biti potencijalna nova strategija za liječenje dijabetičke nefropatije [37]. Očekujemo da će Sidt2 pružiti način za istraživanje patogeneze i liječenja bolesti bubrega u budućnosti.
Testiranje proteina u urinu kod miševa Nasumično odabrani 12-nedeljni WT miševi i Sidt2−/− muški miševi stavljeni su u metaboličke kaveze i gladni, ali im je davana voda. Sakupljeni su 24-satni uzorci urina, a zatim testirani na protein u urinu (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (pogledajte Dopunske materijale za detaljne metode). Ćelije MPC5 mišjih glomerularnih podocita su kupljene od BeNa Culture Collection i kultivisane sa 10% FBS (Excell Bio, Južna Amerika, FSP500) i DMEM sa niskim sadržajem glukoze (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 mišje glomerularne mezangijalne ćelije kupljene su od tipične banke ćelija odbora za očuvanje kulture Kineske akademije nauka i kultivisane sa 10% FBS (Excell Bio, Južna Amerika, FSP500) i DMEM sa visokim nivoom glukoze (Sigma-Aldrich, 6429) . Koncentracija CO2 u kutiji za ćelijsku kulturu održavana je na 5%, a temperatura je održavana na 37 stepeni. Hlorokin (CQ) i rapamicin (RAPA) kupljeni su od Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ i 25 mg/mL rapamicina su oba rastvoreni u ultra čistoj vodi. CQ je dodan u petrijevu zdjelu tako da je konačna koncentracija bila 50 μM i inkubiran 16 h kao inhibitor autofagije. Rapamicin je dodan u petrijevu posudu u konačnoj koncentraciji od 15 μM i inkubiran 2 h kao aktivator autofagije. CRISPR/Cas9 lentivirusni vektorski sistem za uređivanje gena korišten je za uklanjanje plazmida Sidt2 gena Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) plazmidi, a sgRNA online alat za dizajn (http://crispr.mit.edu/) je korišten za dizajn sgRNA koji cilja na Sidt2.
Prajmerske sekvence su bile sljedeće: F: 5′-ACCACACCGTGACCC CAC-3′, R: 5′-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, sintetizirana od strane biotehnološke kompanije (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Koristeći CRISPR/Cas9 lentivirusni sistem, Lenticrispr-v2 plazmid je lineariziran i povezan sa žarenim sgRNA dupleksom kako bi se konstruirao Lenticrispr-v{{1{180}}}} Sidt2 rekombinantni plazmid. Vigofect (Vigorous Biotechnology, Peking, CHN) transfekcioni reagens je korišten za transfekciju Lenticrispr-v2 plazmida i Lenticrispr-v2-Sidt2 rekombinantnog plazmida kako bi se konstruirao lentivirus. Dobijeni lentivirus je transficiran u ćelije MPC5 i ćelije SV40 MES 13. Nakon 48 h, ćelije su inkubirane sa purinomicinom 72 h do selekcije. Preživjele ćelije bile su grupa Sidt2+/+ i Sidt2−/− grupa koje su uspješno transficirane. Izolacija RNK i PCR test u realnom vremenu Trizol (Invitrogen) je korišten za ekstrakciju RNK iz stanica bubrega miša, a specifična RT-PCR metoda je kao što je prethodno opisano [21]. Sekvence prajmera RT-PCR-a bile su sljedeće: aktin (osjetilo: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (osjetilo: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2(sense: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC{{45}GTCTGGGC{{45}GTCGGGC{{45}GTCGGGC{{45}GTCG' {48}}′). Western blotting Specifična metoda je kao što je već spomenuto [28]. U ovoj studiji, primarna antitijela su uključivala zečji anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), zečji anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), mišji anti- -Actin (1:1000; Sigma Aldrich A5316), zečji anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), zečji anti-Atg5 (1:1000; Tehnologija ćelijske signalizacije 9980S), zečji anti-Atg7 (1:1000; Tehnologija ćelijske signalizacije 8558S) , zečji anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), miš anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), zečji anti-katepsin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Ćelije su inokulirane na Nunc Petrijevim posudama sa staklenim dnom. Nakon rasta do odgovarajuće gustine, dodat je Ad-mCherry-GFP-LC3B (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), što je rezultiralo konačnom koncentracijom od 10 -11 vp/mL. Nakon stimulacije od 48 sati, broj mCherry i GFP fluorescentnih tačaka je direktno posmatran pod laserskim konfokalnim mikroskopom (Leica SP8, Njemačka). Imunofluorescencija Ćelije su inokulirane na Petrijevim posudama sa staklenim dnom i fiksirane paraformaldehidom. Nakon blokiranja, ćelije su inkubirane preko noći sa primarnim antitelom, a zatim inkubirane sa sekundarnim antitelom 90 minuta u mraku. Ćelije su fotografisane pomoću laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa (Leica SP8, Nemačka) nakon bojenja jezgara sa DAPI (1 ug/mL). Primarna antitijela uključuju P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); sekundarna antitijela su uključivala anti-mišje sekundarne anti Cy3-konjugirane Affinipure kozje anti-mišje IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-konjugirane Affinipure koze anti mišji IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- konjugirani Affinipure kozji anti-zečji IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Za LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046), također smo inokulirali ćelije na Petrijeve posude sa staklenim dnom. Nakon rasta do odgovarajuće gustine, ćelijama je dodana tečnost ćelijske kulture koja sadrži LysoTracker konačnu koncentraciju od 75 nM, koje su fotografisane nakon 45 m stimulacije. Koristite ImageJ da prebrojite broj fluorescentnih tačaka i Pearsonov koeficijent korelacije. Posmatranja transmisionim elektronskim mikroskopom Iz svake grupe, 3−5 12-sedmične Sidt2−/− i WT mužjaci miševa su nasumično odabrani za pripremu uzoraka tkiva bubrega za elektronski mikroskop, a specifična metoda je kao što je ranije opisano [48] , nasumično slikajte dijelove pomoću elektronskog mikroskopa, ima više od 10 slika uzetih iz odjeljaka bubrega za svakog miša, nasumično odaberite 3-5 slika uvećanja od 8000x sa slika elektronskog mikroskopa svakog miša, izračunajte broj autofagolizosoma na slici i uporedite Sidt2−/− grupu sa WT grupom. Što se tiče pripreme uzoraka ćelijskog elektronskog mikroskopa, ostružite najmanje 105 ćelija strugačem za ćelije i sakupite ih u EP epruvetu, zatim centrifugirajte na 800 o/min 5 m, bacite supernatant i napunite ga fiksativom za elektronski mikroskop. Nakon skladištenja u frižideru na 4 stepena duže od 1 h, može se predati na pregled. Snimku elektronskim mikroskopom napravila je KingMed Diagnostics (Guangzhou, Kina). LysoSensor Ćelije su inokulirane na 96-pločicu sa jažicom. Nakon uzgoja do odgovarajuće gustine, dodat je prethodno zagrijani (37 stepeni) medij koji sadrži 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Ćelije su inkubirane 5 minuta na 37 stepeni, a zatim je medijum uklonjen i zamenjen nakon tri puta ispiranja ćelija sa PBS. Režim WellScan je korišten za očitavanje ploče u BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, SAD). Fluorescencija je mjerena korištenjem Ex360nm/Em450nm i Ex380nm/Em540nm talasnih dužina ekscitacije/emisije, a pH lizosoma je određen iz omjera Em540 prema Em450. Statistička analiza Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Statističko poređenje između dvije grupe izvršeno je korištenjem nesparenih t-testova. Kada je za statističku analizu korišten softver Graphics 8.0, P < 0,05 se smatralo statistički značajnim. Svaka grupa eksperimenata u ovoj studiji je ponovljena najmanje tri puta nezavisno. DOSTUPNOST PODATAKA Skupovi podataka generisani i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
REFERENCE
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Signali iz lizosoma: kontrolni centar za ćelijski klirens i energetski metabolizam. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lizozom: metaboličko signalno čvorište. Saobraćaj. 2019; 20:27–38.
3. Balabio A. Sjajni lizozom. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, et al. Lizosomska disfunkcija izazvana dijetom s visokim udjelom masti i poremećeni autofagični tok doprinose lipotoksičnosti u bubrezima. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Tubularna ozljeda i regeneracija u bubrezima pacova nakon akutnog izlaganja gentamicinu: studija vremenskog toka. Ren Fail. 1992;14:507–21.
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
