Uloga bubrežnog androgenog receptora u spolnim razlikama u metabolizmu amonijaka

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Autumn N. Harris et al

Abstract

Postoje spolne razlike u metabolizmu i strukturi bubrežnog amonijaka, od kojih su mnoge posredovanetestosteron. Cilj ove studije bio je utvrditi ulogu bubrežne ekspresijetestosteronakanonski receptor, androgeni receptor (AR), u ovim seksualnim dimorfizmima. Proučavali smo miševe sabubreg-specifično AR brisanje [KS-AR-nokaut (KO)] generirano korištenjem Cre/loxP tehnika; Kontrolni miševi su bili Cre-negativni parovi u leglu (divlji tip). Kod mužjaka, ali ne i ženki miševa, KS-AR-KO je povećao izlučivanje amonijaka, što je eliminiralo spolne razlike. Iako strukturna veličina bubrega tipično odgovara izlučivanju amonijaka, KS-AR-KO se smanjiobubregveličina, zapreminska gustina kortikalnih proksimalnih tubula i visina ćelija kortikalnih proksimalnih tubula kod muškaraca – nijedna nije promenjena kod ženki, a gustina zapremine sabirnog kanala je bila nepromenjena kod oba pola. Analiza ključnog proteina uključenog u rukovanje amonijakom pokazala je kod mužjaka miševa da KS-AR-KO povećava i fosfoenolpiruvat karboksikinazu (PEPCK) i Na þ -K þ -2Cl kotransporter (NKCC2) ekspresiju i smanjuje Na þ/H þ izmjenjivač izoforma 3 (NHE3) i elektrogeni Na þ -bikarbonatni kotransporter 1 (NBCe1)-A ekspresija. Kod ženki miševa, KS-AR-KO nije promijenio ove parametre. Ovi efekti su se javili iako KS-AR-KO nije promijenio plazmutestosteron, unos hrane ili serum Na þ, K þ ili HCO3 značajno kod oba spola. Zaključno, AR-ovisni signalni putevi kod muškaraca, ali ne i kod žena,bubreziregulišu ekspresiju PEPCK i NKCC2 i dovode do seksualnih razlika u izlučivanju amonijaka. Suprotstavljeni efekti na NHE3 i NBCe1-Izraz vjerovatno ograničava veličinu promjena izlučivanja amonijaka. Kako AR nije prisutan u debelom uzlaznom ekstremitetu, efekat KS-AR-KO na ekspresiju NKCC2 je indirektan. Konačno, AR posreduje u većembubregveličina i zapreminska gustina proksimalnog tubula kod mužjaka u poređenju sa ženkama miševa.

NOVO I VAŽNOSeksualni dimorfizmi u metabolizmu amonijaka uključuju signalne puteve zavisne od androgenih receptora (AR) kod muškaraca, ali ne i kod žena,bubrezikoji dovode do izmijenjenog proksimalnog tubula (PT), fosfoenolpiruvat karboksikinaze i debelog uzlaznog ekstremiteta Na þ -K þ -2Cl kotransporter ekspresije. Adaptivni odgovori u Na þ/H þ izmjenjivaču 3 i elektrogenom Na þ -bikarbonatnom kotransporteru 1-Izraz ograničava veličinu efekta na izlučivanje amonijaka. Konačno, veća veličina bubrega i gustina PT volumena kod mužjaka miševa rezultat je PT androgenog signaliziranja putem AR.

ključne riječi: acidobazna; amonijak; androgeni receptor; spolne razlike;testosteron

cistanche povećava testosteron

UVOD

The presence of sex differences in many aspects of mammalian biology has been well established with sexual dimorphisms in structure and/or function have been identified in nearly every organ, including the kidney (1–3). Sex affects many aspects of kidney function and disease. Sex differences in blood pressure are widely recognized and thought to be related to sex-specific variations in nitric oxide, the renin-angiotensin-aldosterone system, and inflammation (4, 5). There are also differences in the expression of many renal epithelial cells Naþ transporters (6, 7). Understanding these differences can identify new disease mechanisms and/or new and improved therapeutic opportunities. The kidney regulates acid-base homeostasis, which is critical for normal health (8, 9). Renal ammonia Fn1 1 metabolism has a major role in acid-base homeostasis; ammonia excretion is the predominant component of basal net acid excretion, and changes in ammonia metabolism account for >80 posto odgovora na egzogene stimuluse (10–16). Disregulacija acidobazne homeostaze direktno utiče na svaki glavni organski sistem, ubrzava napredovanje hronične bolesti bubrega i korelira sa povećanom smrtnošću (17-19).

Naše studije su pokazale da postoje važni seksualni efekti i na metabolizam amonijaka i na strukturu bubrega. Muški bubreg izlučuje manje amonijaka nego ženski bubreg i to uprkos tome što je muški bubreg veći i ima veći kortikalni volumen od ženskog bubrega (20). Ova razlika u izlučivanju amonijaka korelira s varijacijama u višestrukim bubrežnim aspektima, uključujući nekoliko enzima uključenih u stvaranje i recikliranje amonijaka, u veličini proksimalnih tubula, u debelom uzlaznom dijelu petlje Henle (TAL) Naþ -Kþ ​​- 2Cl - ekspresija kotransportera (NKCC2), te u sabirnom kanalu interkalirana veličina ćelije i ekspresija Rhesus (Rh) glikoproteina (20). Konačno, postoje polne razlike u odgovoru na opterećenje kiselinom (21). Mnoge od ovih spolnih razlika su poništene orhiektomijom kroz mehanizam koji je ukinut fiziološkimtestosteronzamjenu, sugerirajući da oni uključujutestosteron-ovisni signalni putevi (22).

Kanonski put kroz kojitestosteronposreduje biološke efekte uključuje vezivanje za androgeni receptor (AR) (23, 24). Ekspresija AR proteina i mRNA uočena je iu muškim i u ženskim bubrezima decenijama (25-28). Nedavno smo pokazali da je AR protein eksprimiran specifično u proksimalnom tubulu i da se ekspresija nije mogla detektirati ni u TAL ni u sabirnom kanalu (22), gdje su poznate polne razlike u proteinima uključenim u rukovanje amonijakom. Naše studije su dalje pokazale da je ekspresija AR proksimalnih tubula bila prisutna i u muškim i u ženskim bubrezima, pri čemu je ekspresija bila otprilike dvostruko veća u muškom bubrezu nego u ženskom bubrezima (22). Ova zapažanja sugeriraju da AR može posredovati u nekim, ali ne u svim, efektima seksa na strukturu bubrega i na stvaranje i transport amonijaka. Oni također postavljaju pitanje o ulozi AR u ženskom bubregu.

Stoga je svrha ove studije bila utvrditi ulogu renalnog AR u posredovanju ovih identificiranih polnih dimorfizama u metabolizmu amonijaka u bubrežnom tijelu i strukturi bubrega. Budući da AR aktivacija ima brojne biološke efekte, koji mogu indirektno promijeniti acido-baznu homeostazu, a time i rukovanje amonijakom, tumačenje studija korištenjem farmakološke AR inhibicije i/ili globalnog brisanja AR je komplikovano. Stoga je ova studija koristila miševe sa delecijom AR specifičnom za bubrege [KS-AR-knockout (KO)] generiranom korištenjem Cre-loxP tehnika. Uporedili smo Cre-pozitivne miševe sa njihovim Cre-negativnim leglima kako bismo odredili učinak KS-AR-KO. I mužjaci i ženke miševa su evaluirani kako bi se omogućilo razumijevanje uloge AR kod oba spola.

korijena cistanche tubulosa

METODE

Životinje

Koristili smo miševe sa loxP mjestima koja flankiraju ekson 2 AR gena (ARflfl/flfl), koji su prethodno opisani (29-31). Inducirali smo deleciju AR cijelog bubrega uzgojem miševa koji su eksprimirali Cre-rekombinazu pod kontrolom Pax-8 promotora (Pax8Cre; 32). KS-AR-KO miševi su bili ARflfl/flfl, Pax8-Cre þ; kontrolni miševi su bili ARflfl/flfl, Pax8-Cre. Svi miševi su bili na pozadinskom soju C57/Bl6. Genotipizirali smo sve miševe koristeći DNK ekstrahiranu iz uzoraka repnih isječaka. Miševi korišteni u ovim eksperimentima bili su odrasli mužjaci i ženke miševa starosti -4 mj. Miševi su držani na standardnoj ishrani glodara (18 posto proteina, Harlan Teklad, Madison, WI) sa slobodnim pristupom vodi. Institucionalni odbori za brigu o životinjama i korištenje institucionalnih odbora za zaštitu i korištenje životinja na Univerzitetu Floride i Sjevernoj Floridi/Južnoj Georgiji odobrili su sve protokole za životinje. Uzgoj životinja je obavljen na Univerzitetu Florida College of Medicine Cancer and Genetics Transgenic Animal Core Facility od strane obučenog osoblja.

Eksperimenti sa metaboličkim kavezom

Miševi su smješteni u metaboličke kaveze na 3 dana i hranjeni normalnom ishranom u prahu (18 posto proteina, Harlan Teklad) pomiješanom 1:1 s vodom. Mjerena je dnevna potrošnja hrane, a uzimani su dnevni uzorci urina od 24-h. Uzorci urina su sakupljeni u epruvete koje sadrže mineralno ulje uravnoteženo vodom kako bi se spriječilo isparavanje i gubitak molekula plina. Zabilježen je dnevni volumen urina i pH. Uzorci urina su pohranjeni na - 20 stepeni do dalje analize.

Analiza krvi

Krv je dobijena kanulacijom abdominalne aorte kod miševa anesteziranih izofluranom, uvučena u heparinizirani špric i odmah analizirana na koncentracije Naþ, K þ i bikarbonata koristeći Siemens Microanalytic Blood Gas Analyzer (RAPIDLab 348 Munich Analyzer, Njemačka). ). Testosteron u serumu je mjeren u Centru za istraživanje i analizu liganda na Univerzitetu Virginia na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Virginiji (IBL America testosteron testosteron ELISA, Minneapolis, MN)

Analiza urina

Amonijak u urinu je mjeren upotrebom modifikacije komercijalno dostupnog kompleta (A7553, Pointe Scientific, Canton, MI), kao što je prethodno opisano (20, 33). pH urina je mjeren mikro-pH elektrodom (ROSS semi-micro pH, Orion 8103BN, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ekskrecija kiseline koja se može titrati određivana je korištenjem prethodno opisanih standardnih tehnika (20, 33).

Antitijela

Tabela 1 prikazuje antitela korišćena u ovoj studiji, njihove dobavljače i njihove kataloške/identifikacione brojeve.

Ekstrakt cistanche tubulosa povećava testosteron i povećava seksualnu sposobnost

Priprema proteina

Životinje su anestezirane inhalacijskim izofluranom, a bubrezi su isprani in vivo srčanom perfuzijom sa PBS (pH 7,4) koji sadrži 6,000 U/L Na-heparina i 120 mg/L lidokaina. Desni bubreg je brzo uklonjen, a korteks, vanjska i unutrašnja medula izolovani su na hladnom stupnju pod mikroskopom za seciranje. Uzorci su brzo zamrznuti u tečnom azotu i pohranjeni zamrznuti na - 80 stepeni do upotrebe. Tkiva su homogenizovana u reagensu za ekstrakciju proteina tkiva T-PER (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) pomoću tučaka za mikroepruvete (USA Scientific, Ocala, FL), a protein je ekstrahovan prema preporukama proizvođača. Alikvot je korišten za kvantifikaciju ukupnog proteina korištenjem bicinhoninske kiseline (BCA), a ostatak je čuvan zamrznut na 80 stepeni do upotrebe.

Imunoblot procedure Deset mikrograma renalnog proteina je podvrgnuto elektroforezi na 10 posto PAGE ReadyGel-a (Bio-Rad, Hercules, CA). Gelovi su elektroforetski prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani sa 5 g/dL nemasnog suhog mlijeka razrijeđenog u Blotto puferu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA i 0,05 posto Tween 20, pH 4 Ccuba preko noći na 7,6) sa primarnim antitelom u nemasnom suvom mleku. Ekvivalentnost punjenja i prenosa je procenjena Ponceau S bojenjem i procenom ekspresije kućnog proteina b-aktina. Nakon ispiranja, membrane su bile izložene sekundarnim antitijelima (kozji anti-zečji IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugiranim sa peroksidazom hrena u razrjeđenju 1:5,000. Lokacije reakcije antitijelo-antigen vizualizirane su korištenjem poboljšane hemiluminiscencije (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) i Kodak Image Station 440CF digitalnog sistema za snimanje. U odabranim eksperimentima, mrlje su skinute. Gustoća traka je normalizirana tako da je srednja gustoća u regiji (korteks ili vanjska medula) u muškom tkivu divljeg tipa (WT) bila 100. Oba spola (muškarac i ženka) i oba genotipa (WT i KO) bili su napunjeni na isto gel za ove eksperimente. Odsustvo zasićenja potvrđeno je ispitivanjem distribucije intenziteta piksela u svim imunoblotovima.

Imunoblot procedure

Deset mikrograma bubrežnog proteina je podvrgnuto elektroforezi na 10 posto PAGE ReadyGel (BioRad, Hercules, CA). Gelovi su elektroforetski prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani sa 5 g/dL nemasnog suhog mlijeka razrijeđenog u Blotto puferu (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Na2EDTA i 0,05 posto Tween 20, pH 4 cuba na 7,6) i uC preko noći sa primarnim antitelom u nemasnom suvom mleku. Ekvivalentnost punjenja i prenosa je procenjena Ponceau S bojenjem i procenom ekspresije kućnog proteina b-aktina. Nakon ispiranja, membrane su bile izložene sekundarnim antitijelima (kozji anti-zečji IgG, Cell Signaling Technology, Beverly, MA) konjugiranim sa peroksidazom hrena u razrjeđenju 1:5,000. Lokacije reakcije antitijelo-antigen vizualizirane su korištenjem poboljšane hemiluminiscencije (SuperSignal West Pico Substrate, Pierce) i Kodak Image Station 440CF digitalnog sistema za snimanje. U odabranim eksperimentima, mrlje su skinute. Gustoća traka je normalizirana tako da je srednja gustoća u regiji (korteks ili vanjska medula) u muškom tkivu divljeg tipa (WT) bila 100. Oba spola (muškarac i ženka) i oba genotipa (WT i KO) bili su napunjeni na isto gel za ove eksperimente. Odsustvo zasićenja potvrđeno je ispitivanjem distribucije intenziteta piksela u svim imunoblotovima.

Priprema tkiva za imunohistohemiju

Miševi su anestezirani inhalacijskim izofluranom. Bubrezi su očuvani in vivo srčanom perfuzijom sa PBS (pH 7,4) koji sadrži 6,000 U/L Na-heparina i 120 mg/L lidokaina nakon čega slijedi periodat-lizin-2 posto paraformaldehida, izrežite poprečno na nekoliko kriški debljine od 2- do 3- mm, a zatim uronite 24-30 h na 4 stepena u isti fiksativ. Uzorci bubrega svake životinje ugrađeni su u poliesterski vosak napravljen od polietilen glikol 400 distearata (Polysciences, Warrington, PA) sa 10 posto 1-heksadekanola, a 2- mm debljine sekcije su izrezane i postavljene na želatinom obložene slajdova.

korist cistanche tubulosa: povećanje seksualne sposobnosti

Imunohistohemija

Imunolokalizacija za Rh familije B glikoproteina (Rhbg), Rh familije C glikoproteina (Rhcg), Naþ /Hþ izmjenjivača izoforme 3 (NHE3), glutamin sintetaze (GS), NKCC2 i AR obavljena je korištenjem prethodno opisanih postupaka imunoperoksidaze22,20, 34–37). Ukratko, sekcije su deparatizovane u etanolu, rehidrirane, zagrejane u Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) na 88 C tokom 30 minuta, a zatim na 96 stepeni tokom 30 minuta, ohlađene 30 minuta i isprane u PBS. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana inkubacijom sekcija u 3% H2O2 u destilovanoj vodi tokom 45 minuta. Sekcije su blokirane 15 minuta proteinskim blokom bez seruma (Dako Cytomation) i zatim inkubirane preko noći na 4 C sa primarnim antitijelom. Sekcije su isprane u PBS-u, inkubirane 30 minuta sa konjugiranim anti-zečjim IgG konjem povezanim s peroksidazom (ImmPRESS, Vector Laboratories, Burlingame, CA), ponovo isprani PBS-om, a zatim izloženi diaminobenzidinu 5 minuta. Sekcije su isprane destilovanom vodom, dehidrirane ksilenom, montirane i posmatrane svetlosnom mikroskopom. Napravljena su poređenja označavanja između sekcija iz istog imunohistohemijskog eksperimenta. Sekcije su pregledane na Zeiss Axio Imager A2 mikroskopu opremljenom DIC optikom i fotografisane pomoću Axiocam 305 digitalnog fotoaparata u boji i softvera Zen 2.3 (Zeiss).

Imunolokalizacija za fosfoenolpiruvat karboksikinazu (PEPCK) je postignuta primjenom modificiranih imunoperoksidaznih procedura kao što je prethodno opisano (20, 22, 38– 40). Ukratko, sekcije su deparatirane u etanolu, rehidrirane, zagrijane u Trilogy (Cell Marque, Rocklin, CA) na 96 C tokom 60 min, ohlađene 30 min i isprane u PBS. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana inkubacijom sekcija u 3% H2O2 u metanolu tokom 45 minuta. Sekcije su tretirane sa 0.5 posto Triton X-100 u PBS-u 15 minuta. Sekcije su zatim podvrgnute nekoliko ispiranja u PBS-u koji sadrži 1 posto BSA, 0.05 posto saponina i 0.2 posto želatine, nakon čega je uslijedilo blokiranje u trajanju od 15 minuta proteinskim blokom bez seruma (DAKO Cytomation) i zatim inkubirano preko noći na 4 C sa primarnim antitelom. Sekcije su isprane u PBS-u koji je sadržavao 0,1 posto BSA, 0,05 posto saponina i 0,2 posto želatine, nakon čega je slijedio PBS i inkubirani 60 minuta sa kozjim anti-zečjim IgG kozjim IgG povezanim s peroksidazom (MACH2, Biocare Medical, Concord, CA), ponovo ispran u PBS-u, a zatim izložen diamino-benzidinu 5 min.

Negative Control

Svaki imunohistohemijski eksperiment uključivao je dio koji je bio izložen postupcima imunoobilježavanja bez primarnih antitijela kako bi se osiguralo da je oznaka posljedica samo primarnog vezivanja antitijela.

Morfometrijska analiza

Gustoća volumena proksimalnog tubula u korteksu i vanjskoj traci vanjske moždine, kao i sabirnog kanala u korteksu i unutrašnjoj traci vanjske moždine određena je korištenjem standardnih tehnika brojanja bodova kao što je prethodno opisano (20-22, 41 ).

Kvantitativna imunohistohemija

Kvantitativna imunohistohemija je urađena kako smo prethodno opisali i potvrdili (20, 22, 33, 37, 42). Proksimalni segmenti tubula proučavani su u sekcijama označenim pod identičnim uslovima u istom eksperimentu imunoobilježavanja od strane posmatrača koji nije vidio tretiranu grupu. Izmjereni specifični segmenti proksimalnog tubula bili su početni proksimalni zavijeni tubul (PCT), definirani kao PCT segmenti koji su kontinuirani s Bowmanovom kapsulom, proksimalni ravni tubul (PST) u medularnoj zraki i PST u vanjskoj traci vanjske moždine. Koristili smo digitalne mikrofotografije visoke rezolucije snimljene nasumično odabranih polja korteksa bubrega i vanjske trake vanjske moždine pomoću mikroskopa Zeiss Axio Imager A2 opremljenog digitalnom kamerom u boji Axiocam 305 i softverom Zen 2.3 (Zeiss) bez tehnika poboljšanja slike. . Koristeći softver ImageJ (v, 1.34j, National Institutes of Health, Bethesda, MD), izmjerili smo intenzitet piksela preko prave linije povučene od lumena tubula kroz pojedinačnu ćeliju. Ovi podaci su zatim analizirani pomoću prilagođenog softvera koji je izveden u programu Microsoft Excel 2016. Neto intenzitet na svakom pikselu na liniji je zatim određen kao razlika između apsolutnog intenziteta i srednjeg intenziteta pozadinskog piksela izmjerenog izvan ćelije. Ukupna ćelijska ekspresija određena je integracijom neto intenziteta piksela u cijeloj ćeliji. Visina ćelije određena je kao udaljenost u pikselima između apikalnih i bazolateralnih rubova ćelija i pretvorena u apsolutnu dužinu korištenjem kalibriranog određivanja veličine pojedinačnih piksela. Analizirano je najmanje 15 pojedinačnih ćelija sa najmanje četiri mikrofotografije iz svakog bubrega. Podaci iz svih ispitivanih ćelija određenog tipa segmenta proksimalnog tubula su usrednjeni da bi se dobila jedna tačka podataka po životinji za statističku analizu.

Odredili smo da interkalirana veličina ćelije tipa A i ekspresija proteina specifična za ćeliju kao što je prethodno opisano (20, 22). Ukratko, dobili smo digitalne mikrofotografije velike snage unutrašnje trake vanjske moždine dijelova tkiva koji su bili podvrgnuti imunohistohemiji za interkalirani ćelijski specifični marker Rhbg ili Rhcg. Pojedinačne interkalirane ćelije su opisane korišćenjem softvera ImageJ (v. 1.34j, Nacionalni instituti za zdravlje). Veličina ćelije određena je kao broj piksela unutar zacrtanih regija i pretvorena u površinu korištenjem kalibriranog mjerenja piksela po mikrometru. Intenzitet imunooznake na svakom pikselu određen je kao razlika između apsolutnog intenziteta piksela i srednjeg intenziteta pozadine, a intenzitet imunooznake za jednu ćeliju određen je integracijom neto intenziteta piksela unutar ćelije koristeći prilagođeni softver koji se izvodi u Microsoft Excel 2016.

cistanche liječe bolesti bubrega kako bi povećali seksualnu sposobnost

REZULTATI

Verifikacija brisanja AR specifičnog za bubrege

Farmakološka blokada AR ili globalna delecija indukuje širok spektar fenotipskih promjena (43), koje bi mogle indirektno promijeniti bubrežne strukturne i reakcije amonijaka. Da bismo izbjegli ove probleme, generirali smo KS-AR-KO miševe koristeći Cre loxP tehnike. Potvrdili smo efikasnost renalne AR delecije pomoću imunohistohemije (slika 1). Kod WT miševa, imunohistohemija je pokazala nuklearnu AR imunooznaku ograničenu na proksimalni tubul; ovo je bilo slično našim nalazima kod normalnog mišjeg bubrega (22). U KO bubregu nije bilo detektabilne imunooznake AR ni kod jednog spola (slika 1). Ovi nalazi pokazuju generaciju miševa s renalnom AR delecijom.

statistička analiza pomoću softvera SPSS (26.2) i Microsoft Excel 2016.

Budući da testosteron ima brojne vanbubrežne efekte, koji bi indirektno mogli promijeniti bubrežne acido-bazne mehanizme, razmotrili smo mogućnost da KS-AR-KO može promijeniti nivoe testosterona ili estradiola u plazmi. Međutim, koncentracije testosterona i estradiola u plazmi nisu se značajno razlikovale između WT i KO miševa oba spola (Tablica 2).

Fiziološka karakterizacija brisanja AR specifične za bubrege. Tjelesna težina bila je veća kod WT mužjaka nego kod WT ženki miševa uprkos tome što nema polne razlike u unosu hrane, kao što je ranije objavljeno (22), što je u skladu s poznatim ekstrarenalnim efektima spola na tjelesnu težinu. Međutim, KS-AR-KO nije promijenio dnevni unos hrane ili tjelesnu težinu ni kod jednog spola (Tabela 2).

Težina bubrega bila je značajno veća kod mužjaka WT miševa nego kod ženki WT miševa (slika 2), slično onome što smo ranije prijavili kod normalnih miševa (22). KS-AR-KO je značajno smanjio težinu bubrega kod mužjaka KS-AR-KO miševa, do te mjere da se težina bubrega mužjaka KS-AR-KO nije značajno razlikovala od težine bubrega WT ili KS-AR-KO kod ženke (slika 2) . Kod ženki miševa, KS-AR-KO nije značajno promijenio težinu bubrega. Dakle, efekat seksa na težinu bubrega zahtijeva ekspresiju AR u muškom bubregu.

Ni koncentracije Naþ, K þ, ni koncentracije bikarbonata u plazmi nisu se značajno razlikovale između miševa WT i KS-AR-KO za oba spola (Tabela 2). Klirens uree, korišten kao marker brzine glomerularne filtracije, nije se značajno razlikovao između WT i KS-AR-KO miševa oba spola (Tabela 2).

Neto izlučivanje kiseline

Neto izlučivanje kiseline uključuje dva procesa: izlučivanje amonijaka (NH4þ ) i izlučivanje kiseline koja se može titrirati. Kod mužjaka miševa, KS-AR-KO je značajno povećao izlučivanje amonijaka, što je eliminisalo spolnu razliku u izlučivanju amonijaka (slika 2). KS-AR-KO nije značajno promijenio izlučivanje amonijaka kod ženki miševa. KS-AR-KO nije značajno promijenio izlučivanje kiseline za titraciju ni kod jednog spola (Tabela 2). pH urina je značajno smanjen KS-AR-KO kod mužjaka miševa, ali ne i kod ženki miševa (Tabela 2); međutim, efekat KS-AR-KO na izlučivanje amonijaka je opstao nakon statističkog razmatranja pH urina (P < 0.001="" prema="" anova).="" dakle,="" proksimalni="" tubul="" ar="" posreduje="" spolne="" razlike="" u="" izlučivanju="" amonijaka="" kod="" mužjaka="" miševa,="" ali="" njegovo="" brisanje="" nije="" imalo="" značajan="" utjecaj="" na="" izlučivanje="" amonijaka="" kod="" ženki="">

Efekat brisanja AR specifične za bubrege na strukturu proksimalnih tubula

Proksimalni tubuli čine veći udio kortikalnog volumena u muškom bubregu nego u ženskom bubregu, a to zavisi od testosterona (20, 22). Tako smo utvrdili efekte delecije KS-AR kod mužjaka i ženki miševa na strukturu proksimalnih tubula. Koristeći PEPCK imunooznaku kao marker specifičnog za proksimalne tubule, imunohistohemija je kvalitativno pokazala da KS-AR-KO smanjuje udio korteksa koji je bio proksimalni tubul (slika 3A). Kvantitativna analiza, koristeći formalne tehnike brojanja tačaka (41), pokazala je da KS-AR-KO značajno smanjuje gustinu volumena proksimalnih tubula u korteksu muškaraca, što je paralelno sa promjenom težine bubrega (slika 3B). Nasuprot tome, u vanjskoj traci vanjske moždine, KS-AR-KO nije značajno promijenio gustinu volumena proksimalnih tubula kod mužjaka miševa (slika 3B). Kod ženki miševa, KS-AR-KO nije kvalitativno promijenio udio korteksa koji je bio proksimalni tubul (slika 3A) i kvantitativno nije promijenio gustinu volumena proksimalnog tubula ni u korteksu ni u vanjskoj meduli (slika 3B). Polna razlika u zapreminskoj gustini kortikalnih proksimalnih tubula prisutna kod WT miševa nije bila prisutna kod KS-AR-KO miševa. Dakle, u muškom bubregu, AR posreduje u polnim razlikama u zapreminskoj gustini proksimalnih tubula u korteksu. U vanjskoj meduli, izgleda da ekspresija AR ne utječe na gustinu volumena proksimalnih tubula ni kod jednog spola.

Čini se da ove promjene u strukturi proksimalnih tubula kod mužjaka KS AR-KO miševa uključuju promjene u veličini ćelije. Kod mužjaka miševa, KS-AR-KO je značajno smanjio visinu ćelije proksimalnog tubula iu PCT iu kortikalnom PST, tj. u celom korteksu (slika 3C). Visina ćelije u PST u spoljašnjoj meduli nije značajno promenjena (slika 3C). Ovi rezultati su paralelni nalazima zapreminske gustine. Brisanje AR specifične za bubrege kod ženki miševa nije promijenilo visinu stanica proksimalnih tubula ni u PCT-u, ni u kortikalnom PST-u, ni u PST-u u vanjskoj meduli, što je paralelno s nedostatkom efekta na gustoću volumena i ukupnu veličinu bubrega u ženskom bubregu (Sl. 2B).

Težina bubrega, zapreminska gustina kortikalnih proksimalnih tubula i visina ćelije u PCT i kortikalnom PST-u bili su veći u WT muškom bubregu nego u WT ženskom bubregu, što je paralelno s našim prethodnim zapažanjima (20, 22). Kod mužjaka KS-AR-KO miševa ova spolna razlika više nije postojala, a svaki od ovih parametara se nije značajno razlikovao od onog uočenog ni kod WT ni KS-AR-KO ženki miševa. Dakle, polne razlike u težini bubrega, gustoći volumena kortikalnih proksimalnih tubula i visini ćelije u PCT i kortikalnom PST zavise od AR ekspresije.

Efekat brisanja AR specifičnog za bubrege na strukturu sabirnog kanala

Postoje važne polne razlike u sabirnom kanalu, pri čemu je zapreminska gustina sabirnog kanala veća u odnosu na proporciju korteksa ili spoljašnje moždine koja je bila sabirni kanal kod mužjaka ili ženki miševa (slika 4A). Kvantitativna morfometrijska analiza je pokazala da KS-AR-KO nije značajno promijenio zapreminsku gustinu sabirnih kanala ni u korteksu ni u vanjskoj meduli ni kod jednog spola (slika 4B). Dakle, renalni AR ne posreduje u seksualnom dimorfizmu u zapreminskoj gustini sabirnih kanala.

Ekspresija amonijačnog enzima Rezultati u neto izlučivanju kiseline pokazuju da delecija AR-a specifična za bubrege povećava izlučivanje amonijaka kod mužjaka miševa iako smanjuje gustinu volumena proksimalnih tubula i visinu ćelija u korteksu. Ovo ukazuje da se efekti na izlučivanje amonijaka ne mogu pripisati jednostavno hipertrofiji proksimalnih tubula koja dovodi do povećane geneze amonijaka, već su rezultat odvojenih i specifičnih efekata na genezu amonijaka i/ili transport amonijaka. Stoga smo zatim ispitali ključne proteine ​​uključene u nastanak amonijaka i transport amonijaka.

PEPCK je ključni enzim proksimalnih tubula potreban za nastanak amonijaka i nalazi se isključivo u proksimalnim tubulima u bubregu (16, 44). Kod mužjaka miševa, KS-AR-KO je značajno povećao ekspresiju kortikalne PEPCK; nije bilo efekta KS-AR-KO kod ženki miševa (slika 5A). Povećanje ekspresije PEPCK kod mužjaka KS-AR-KO miševa eliminiralo je polnu razliku kod WT miševa (slika 5A). Ispitivanje ekspresije PEPCK imunooznake pokazalo je da mužjaci KS-AR-KO miševa imaju veći intenzitet PEPCK imunooznake u PCT i kortikalnom PST od WT miševa (slika 5B). U vanjskoj traci vanjske moždine, nije bilo vidljive razlike u intenzitetu PEPCK imunooznake (slika 5B). Kvantitativna imunohistohemija mužjaka miševa pokazala je da KS-AR-KO značajno povećava intenzitet PEPCK imunooznake u PCT i kortikalnom PST, ali ne i u vanjskoj traci vanjske moždine (slika 5C). Prema tome, kod mužjaka miševa, ali ne i kod ženki, ekspresija AR proksimalnog tubula smanjuje ekspresiju PEPCK u segmentima kortikalnih proksimalnih tubula, ali ne i u PST u vanjskoj meduli.

Proksimalni tubul ima sposobnost recikliranja amonijaka uključujući GS (37, 42, 45, 46). Ni kod mužjaka ni kod ženki miševa KS-AR-KO nije značajno promijenio GS ekspresiju (slika 5D). Stoga se čini da bubrežni AR ne modulira ekspresiju GS.

Efekat brisanja AR specifične za bubrege na ekspresiju NBCe1

NBCe1 je protein integralne membrane proksimalnog tubula s glavnom ulogom u reapsorpciji filtriranog bikarbonata koji također reguliše metabolizam amonijaka (47-49). Dvije varijante spajanja NBCe1, NBCe1-A i NBCe1-B, prisutne su u bubrezima miša (50, 51). Koristeći pan-NBCe1 antitijelo, koje prepoznaje obje varijante NBCe1, otkrili smo da KS-AR-KO značajno smanjuje ekspresiju NBCe1 u kortikalnom tkivu u muškom, ali ne i ženskom bubregu (slika 6A).

Efekat delecije AR specifične za bubrege na transportere amonijaka Bubrežno izlučivanje amonijaka uključuje koordinirani transport NH3/NH4þ specifičnim membranskim proteinima (10, 16, 52). Ovo uključuje transportere u proksimalnom tubulu (NHE3), TAL Henleove petlje (NKCC2), a imunooznaka sabirnog kanala nije bila detektirana u segmentima vanjskih medularnih proksimalnih tubula (slika 6C), kao što je ranije objavljeno (48). Zatim smo koristili kvantitativnu imunohistohemijsku analizu da kvantificiramo promjene specifične za segment u ekspresiji NBCe1-A. Ovo je pokazalo da KS-AR KO kod mužjaka miševa smanjuje ekspresiju NBCe1-A u PCT-u i kortikalnom PST-u, tj. u cijelom korteksu (slika 6D). Dakle, AR ekspresija reguliše kortikalni proksimalni tubul NBCe1-ekspresija u muškom bubregu, ali ne i u ženskom bubregu.

(Rhbg i Rhcg). Polne razlike u izlučivanju amonijaka koreliraju sa razlikama u ekspresiji svakog od njih (6, 20), a testosteron reguliše ekspresiju i NHE3 i NKCC2 (22). NKCC2 posreduje u reapsorpciji TAL amonijaka (10, 16, 52). Kod mužjaka miševa, KS-AR-KO je značajno povećao ekspresiju NKCC2 proteina upotrebom imunoblot analize; kod ženki miševa nije bilo značajnih promena (slika 8). Ova promjena u ekspresiji kod mužjaka miševa vjerovatno doprinosi izmijenjenom medularnom ranžiranju amonijaka i na taj način olakšava učinak KS-AR-KO na povećanje izlučivanja amonijaka kod mužjaka miševa.

Rh glikoproteini Rhbg i Rhcg su primarni proteini koji posreduju u izlučivanju amonijaka u sabirnim kanalima, a njihova ekspresija općenito je paralelna promjenama u izlučivanju amonijaka (10, 16, 52). Međutim, KS-AR-KO nije značajno promijenio ekspresiju Rhbg proteina ni kod mužjaka ni kod ženki KS-AR-KO miševa ni u korteksu ni u unutrašnjoj traci vanjske moždine (slika 9). Efekti na ekspresiju Rhcg bili su slični. Rhcg imunohistohemija, procijenjena kvalitativno i korištenjem kvantitativne imunohistohemije, nije pokazala značajne promjene u intenzitetu Rhcg imunooznake u interkaliranim ćelijama vanjske trake vanjske moždine u oba spola (Slika 10). Stoga se čini da bubrežni AR ne modulira ni Rhbg ni Rhcg ekspresiju.

DISKUSIJA

Ova studija pruža važne nove informacije o mehanizmu kako AR modulira seksualne dimorfizme u bubrezima. Budući da AR ima brojne vanbubrežne uloge, što bi moglo otežati razumijevanje njegove uloge u bubrezima, kreirali smo prvog KS-AR-KO miša. KS-AR-KO kod mužjaka miševa povećao je izlučivanje amonijaka, ali je ipak smanjio ukupnu veličinu bubrega, gustinu volumena proksimalnih tubula i visinu ćelije proksimalnog tubula, eliminirajući prethodno identificirane spolne razlike. Ekspresija višestrukih ključnih proteina (PEPCK i NKCC2) uključenih u rukovanje amonijakom povećana je KS-AR-KO, što je vjerovatno doprinijelo povećanom izlučivanju amonijaka. Istovremeno, smanjena je ekspresija ostalih proteina (NHE3 i NBCe1-A), što će imati tendenciju da umanji promjene u izlučivanju amonijaka. KS-AR-KO nije imao uočljiv učinak kod ženki miševa ili u sabirnim kanalima oba spola. Tabela 3 pokazuje ove efekte. Ovi nalazi sugeriraju da rukovanje bubrežnim amonijakom i struktura proksimalnih tubula uključuju bubrežne AR-zavisne signalne puteve u korteksu muškog bubrega, ali ne i ženskog bubrega i ne u vanjskoj moždini oba spola.

Prvi veliki nalaz u ovoj studiji je da ekspresija AR posreduje spolne razlike u veličini bubrega. Prethodne studije na ljudima, pacovima i miševima su pokazale da je muški bubreg veći od ženskog (3, 56, 57). Prvi dokaz da je ovo uključivalo signalni put ovisan o testosteronu bilo je zapažanje da prekomjerna primjena androgena kvalitativno povećava veličinu proksimalnih tubula štakora (57). Daljnji dokazi kod odraslih muškaraca sugeriraju da postoji povećanje volumena bubrega ovisno o dozi, s procijenjenim povećanjem od 4.04-cm3 na 100 mg sedmične suplementacije testosteronom (58). Nedavno smo pokazali da mužjaci miševa imaju veću veličinu bubrega i proksimalnih tubula od ženki miševa (20, 22) i da su ove razlike zavisne od testosterona (22). U skladu s ovim prethodnim nalazima, ova studija pokazuje da kod mužjaka miševa, bubrežna AR ekspresija regulira i cijeli bubreg i veličinu proksimalnih tubula. Štaviše, KS-AR-KO dovodi do toga da je veličina bubrega kod muškaraca ista kao kod žena sa intaktnom ekspresijom AR. Prema tome, kod mužjaka miševa, testosteron koji djeluje preko bubrežnih AR-ovisnih signalnih puteva može u potpunosti objasniti seksualni dimorfizam u bubrezima i veličini proksimalnih tubula.

Drugi glavni nalaz je da su spolno zasnovane razlike u izlučivanju amonijaka posredovane putem AR-ovisnih puteva kod mužjaka miševa. Naše prethodne studije pokazale su da ženke miševa izlučuju otprilike dvostruko više amonijaka u urinu nego mužjaci miševa (20-22), koriste različite puteve odgovora kako bi odgovorili na opterećenje kiselinom (21) i da razlika u bazalnom izlučivanju amonijaka uključuje ovisnost o testosteronu. mehanizam (22). Ova studija proširuje ove nalaze pokazujući da KS-AR-KO eliminira seksualni dimorfizam u izlučivanju amonijaka. Promjene u ishrani fiksnih kiselinskih opterećenja mogu promijeniti izlučivanje amonijaka, ali promjene u izlučivanju amonijaka kod miševa s brisanjem AR ne mogu se pripisati ovom mehanizmu jer KS-AR-KO nije promijenio unos hrane. Većina promjena koje se javljaju u metabolizmu amonijaka, poput metaboličke acidoze ili hipokalemije, rezultiraju promjenama u veličini bubrega i proksimalnih tubula koje su paralelne s izlučivanjem amonijaka (59–61). Međutim, mužjaci miševa s bubrežnom AR delecijom imaju povećano izlučivanje amonijaka, ali smanjenu ukupnu veličinu bubrega i proksimalnih tubula, što ukazuje da učinak na izlučivanje amonijaka nije nespecifičan odgovor na promjene u bubrežnoj masi. Ova nekongruentna veličina bubrega i odgovor amonijaka kao odgovor na bubrežnu AR deleciju paralelni su nalazima u našim prethodnim studijama koristeći model gonadektomije koji je procjenjivao učinak testosterona (22). Dakle, kod mužjaka miševa, testosteron koji djeluje kroz bubrežni AR kod mužjaka regulira izlučivanje amonijaka putem puteva koji nisu povezani s efektima na veličinu bubrega, veličinu proksimalnih tubula i endogeno opterećenje kiselinama povezano s unosom hrane.

Većina stvaranja amonijaka događa se u proksimalnom tubulu. Naš prethodni rad je identifikovao seksualne dimorfizme u stvaranju amonijaka u proksimalnim tubulima koji su zavisni od testosterona dobijenog iz testisa (22). Rezultati ove studije dodatno proširuju ove nalaze pokazujući da bubrežni AR kod mužjaka miševa reguliše ekspresiju enzima koji stvara amonijak PEPCK, ali ne i enzima koji reciklira amonijak GS. Ovaj efekat na ekspresiju PEPCK nije nespecifičan efekat koji se odnosi na promene u veličini proksimalnih tubula, budući da su efekti renalne delecije AR na veličinu proksimalnih tubula suprotni od njegovih efekata na ekspresiju PEPCK. Štaviše, nalaz da renalna AR delecija ne mijenja ekspresiju GS ukazuje da je GS reguliran kroz mehanizme koji se razlikuju od onih koji se koriste za PEPCK.

Amonijak proizveden u proksimalnom tubulu prvenstveno se izlučuje u luminalnu tekućinu putem apikalnog mehanizma ovisnog o NHE3-u (54, 55). Prethodne studije su pokazale da gubitak testosterona smanjuje ekspresiju NHE3 (22, 62). Nalazi ove studije dalje proširuju ove nalaze pokazujući da renalna AR delecija kod mužjaka miševa smanjuje ekspresiju NHE3. Stoga se čini da testosteron koji djeluje kroz AR aktivaciju povećava ekspresiju NHE3 kortikalnih proksimalnih tubula. Međutim, važno je prepoznati da ovi efekti ne idu paralelno s izlučivanjem amonijaka i umjesto toga bi se predviđalo da minimiziraju uočene promjene u izlučivanju amonijaka. Umjesto toga, budući da je NHE3 također kritičan za filtrirani NaCl i reapsorpciju vode, ovi efekti mogu doprinijeti većoj reapsorpciji NaCl u proksimalnim tubulima prisutnoj kod muškaraca (6, 7).

Reapsorpcija amonijaka u TAL-u uspostavlja intersticijski gradijent amonijaka neophodan za sakupljanje lučenja amonijaka iz kanala (63, 64). Prethodne studije naše grupe su pokazale da je ekspresija NKCC2 veća kod ženki miševa nego kod mužjaka miševa (20-22), da postoji seksualni dimorfizam u odgovoru NKCC2 na opterećenje kiselinom (21) i da je razlika u bazalnoj ekspresiji NKCC2 uključuje mehanizam ovisan o testosteronu (22). Ova studija pokazuje da gubitak bubrežnog AR kod mužjaka miševa povećava ekspresiju NKCC2. Veličina ovog efekta bila je gotovo identična razlici koju smo identificirali između mužjaka i ženki miševa (20, 21) iu trenutnoj studiji eliminirao je seksualni dimorfizam ekspresije NKCC2. Nadalje, identificirana razlika između mužjaka miševa s intaktnom bubrežnom AR i delecijom AR paralelna je s našim prethodno identificiranim razlikama između mužjaka miševa s orhiektomijom u poređenju sa intaktnim i lažno operiranim kontrolama (24). Stoga se čini da testosteron koji djeluje kroz AR posreduje u seksualnom dimorfizmu u ekspresiji NKCC2. Međutim, čini se da je ova regulacija indirektna, jer nije bilo detektabilne ekspresije AR u TAL-u ni u našem prethodnom izvještaju (22) niti u ovoj studiji. Jedan od mogućih indirektnih mehanizama koji objašnjava ovo zapažanje je da kod muškaraca delecija AR dovodi do smanjene veličine proksimalnog tubula što u kombinaciji sa smanjenom ekspresijom NHE3 proksimalnog tubula povećava povećanu isporuku otopljene tvari u TAL, što stimulira ekspresiju NKCC2.

Sekrecija amonijaka u sabirnim kanalima je glavna determinanta izlučivanja amonijaka u urinu, a Rh glikoproteini Rhbg i Rhcg su primarni transporteri amonijaka u sabirnim kanalima (16, 65–68). Ranije smo pokazali seksualne dimorfizme u zapreminskoj gustini sabirnih kanala i ekspresiji Rh glikoproteina, pri čemu su ženke miševa imale veću zapreminsku gustinu sabirnih kanala, interkaliranu veličinu ćelije i ekspresiju Rhbg i Rhcg (20). Ova studija nije pronašla vidljive promjene u zapreminskoj gustini sabirnih kanala ili ekspresiji Rhbg i Rhcg kao odgovor na KS-AR-KO kod mužjaka ili ženki miševa. Ovo je paralelno sa nedostatkom efekta nedostatka testosterona, izazvanog orhiektomijom, na zapreminsku gustinu sabirnih kanala, interkalisanu veličinu ćelija i ekspresiju Rhbg i Rhcg (22). Zaključujemo da se polni dimorfizam u sabirnom kanalu javlja kroz mehanizme koji ne uključuju testosteron i signalne puteve zavisne od AR.

Čini se da vanjska moždina reagira drugačije na seks, testosteron i AR nego korteks. Za razliku od bubrežnog korteksa, u vanjskoj meduli ne postoji seksualni dimorfizam u gustini volumena proksimalnog tubula ili visini proksimalnog tubula (20), nema efekta nedostatka testosterona izazvanog orhiektomijom na ove parametre (22) i nema efekta bubrežne funkcije. AR delecija (sadašnja studija). Ovaj nedostatak efekta spola, testosterona i ekspresije AR nije posljedica odsustva ekspresije AR, jer smo pokazali ekspresiju AR kroz cijeli proksimalni tubul, uključujući i vanjsku medulu (22). Razumijevanje mehanizama koji leže u osnovi ove aksijalne razlike u odgovoru proksimalnih tubula na seks, testosteron i AR bit će važan put za buduća istraživanja.

Konačno zapažanje je da brisanje AR nije imalo vidljive efekte na ženski bubreg. AR je prisutan u cijelom proksimalnom tubulu kod oba spola, i iako je izražen na nižim nivoima kod žena, apsolutna razlika u ekspresiji iznosila je samo - 50 posto (22). Djelomično, nedostatak efekta brisanja AR može ukazivati ​​na smanjenu aktivaciju AR cirkulirajućim testosteronom, koji je, kako je prikazano u ovoj studiji, znatno manji kod žena nego kod muškaraca. Međutim, imunohistohemija ukazuje na značajnu nuklearnu lokalizaciju AR u ženskom bubregu (Ref. 22 i ova studija), što tipično ukazuje na aktivaciju AR-ovisnih signalnih procesa. Ova zapažanja sugeriraju mogućnost da druge spolno zavisne razlike narušavaju AR zavisne signalne mehanizme u ženskim proksimalnim tubulima.

Perspektive i značaj

Bolje razumijevanje mehanizma i bioloških implikacija seksa na strukturu bubrega i metabolizam amonijaka ključno je za optimizaciju naše sposobnosti da se brinemo i za muškarce i za žene sa acidobaznim poremećajima. Uprkos nedavnom napretku u našem razumijevanju utjecaja seksa na metabolizam amonijaka i ulogu bubrežne AR, potrebne su dodatne studije. Zasigurno postoje efekti seksa nezavisni od testosterona, čiji mehanizam je trenutno nepotpuno shvaćen. Bilo da ovo uključuje direktne efekte drugih polnih steroidnih hormona, kao što su estrogeni ili progesteron, indirektne efekte aktivacije AR proksimalnih tubula ili efekte polnih hromozoma koji su nezavisni od hormona gonade bit će važna pitanja za buduće studije.

cistanche ublažava probleme s bubrezima i pojačava kfunkcija bubrega

ZAHVALNICA

Zahvaljujemo dr. Sharon W. Matthews i Chao Chen (Univerzitet Florida, Medicinski fakultet, jezgra laboratorije za elektronsku mikroskopiju) na odličnoj obradi tkiva za naše imunohistohemijske eksperimente. Zahvaljujemo Centru Medicinskog fakulteta Univerziteta u Virginiji za istraživanje reprodukcijskog liganda i jezgru za analizu za mjerenje nivoa testosterona u serumu. Zahvaljujemo dr. Gail Prins na nabavci anti-AR antitijela i na njihovoj stručnosti u AR.

OTKRIVANJA

Autori ne izjavljuju nikakav sukob interesa, finansijski ili bilo koji drugi.

DOPRINOSI AUTORA

ANH i IDW su osmislili i osmislili istraživanje; ANH, RAC, H.-WL i JWV su izveli eksperimente; Analizirani podaci ANH, RAC, H.-WL, JWV i IDW; ANH, RAC, JWV i IDW interpretirali su rezultate eksperimenata; ANH je pripremio brojke; ANH je izradio rukopis; ANH, RAC, H.-WL, JWV i IDW su uredili i revidirali rukopis; ANH, RAC, H.-WL, JWV i IDW odobrili su konačnu verziju rukopisa.

REFERENCE

1. Komitet Instituta za medicinu za razumijevanje biologije spola i roda D; Wizemann TM, Pardue ML (urednici). Istraživanje bioloških doprinosa ljudskom zdravlju: da li je seks bitan? Washington, DC: National Academies Press, 2001. doi:10.17226/10028.

2. Karp NA, Mason J, Beaudet AL, Benjamini Y, Bower L, Braun RE, et al. Prevalencija polnog dimorfizma u fenotipskim osobinama sisara. Nat Commun 8: 15475, 2017. doi:10.1038/ncomms15475.

3. Sabolić I, Asif AR, Budach WE, Wanke C, Bahn A, Burckhardt G. Rodne razlike u funkciji bubrega. Pflugers Arch 455: 397–429, b2007. doi:10.1007/s00424-007-0308-1.

4. Ramirez LA, Sullivan JC. Polne razlike kod hipertenzije: gdje smo bili i kuda idemo. Am J Hypertens 31: 1247–1254, 2018. doi:10.1093/ajh/hpy148.

5. Layton AT, Sullivan JC. Nedavni napredak u spolnim razlikama u funkciji bubrega. Am J Physiol Renal Physiol 316: F328–F331, 2019. doi:10.1152/ajprenal.00584.2018.

6. Veritas LC, Girardi ACC, Curry J, Pei L, Ralph DL, Tran A, Castelo-Branco RC, Pastor-Soler N, Arranz CT, Yu ASL, McDonough AA. Seksualni dimorfni obrazac bubrežnih transportera i homeostaze elektrolita. J Am Soc Nephrol 28: 3504–3517, 2017. doi: 10.1681/ASN.

7. Li Q, McDonough AA, Layton HE, Layton AT. Funkcionalne implikacije seksualnog dimorfizma uzoraka transportera zajedno sa proksimalnim tubulom štakora: modeliranje i analiza. Am J Physiol Renal Physiol 315: F692–F700, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00171.2018.

8. Mitch WE. Metaboličke i kliničke posljedice metaboličke acidoze. J Nephrol 19 Suppl 9: S70–S75, 2006.

9. Hamm LL, Nakhoul N, Hering-Smith KS. Acid-bazna homeostaza. Clin J Am Soc Nephrol 10: 2232–2242, 2015. doi:10.2215/CJN.07400715.

10. Weiner ID, Mitch WE, Sands JM. Metabolizam ureje i amonijaka i kontrola bubrežnog izlučivanja dušika. Clin J Am Soc Nephrol 10: 1444–1458, 2015. doi: 10.2215/CJN.10311013.

11. Pogrešno O, Davies HE. Izlučivanje kiseline kod bolesti bubrega. QJ Med 28: 259–313, 1959.

12. Baertl JM, Sancetta SM, Gabuzda GJ. Veza akutnog nedostatka kalija i metabolizma amonija u bubrezima kod pacijenata s cirozom. J Clin Invest 42: 696–706, 1963. doi: 10.1172/JCI104761.

13. Maher T, Schambelan M, Kurtz I, Hunter HN, Jones JW, Sebastian A. Poboljšanje metaboličke acidoze ograničenjem kalijuma u ishrani kod pacijenata sa hiperkalemijom i hroničnom bubrežnom insuficijencijom. J Lab Clin Med 103: 432–445, 1984.

14. Shear L, Gabuzda GJ. Nedostatak kalijuma i endogeno preopterećenje amonijumom iz bubrega. Am J Clin Nutr 23: 614–618, 1970. doi:10.1093/acne/23.5.614. F642 AJP-Renal Physiol doi:10.1152/ajprenal.00260.2021 www.ajprenal.org

15. Tannen RL, McGill J. Utjecaj kalijuma na proizvodnju amonijaka u bubrezima. Am J Physiol 231: 1178–1184, 1976. doi: 10.1152/ajplegacy. 1976.231.4.1178.

16. Weiner ID, Verlander JW. Transporteri amonijaka i njihova uloga u acidobaznoj ravnoteži. Physiol Rev 97: 465–494, 2017. doi:10.1152/ physrev.00011.2016.

17. Kovesdy CP, Anderson JE, Kalantar-Zadeh K. Povezanost nivoa serumskog bikarbonata sa mortalitetom kod pacijenata sa CKD-om koji nije zavisan od dijalize. Nephrol Dial Transplant 24: 1232–1237, 2009. doi:10.1093/ndt/gfn633.

18. Navaneethan SD, Schold JD, Arrigain S, Jolly SE, Wehbe E, Raina R, Simon JF, Srinivas TR, Jain A, Schreiber MJ Jr, Nally JV Jr. Serum bikarbonat i smrtnost u stadijumu 3 i 4 hronične bolesti bubrega . Clin J Am Soc Nephrol 6: 2395–2402, 2011.

19. Raphael KL, Murphy RA, Shlipak MG, Satterfield S, Huston HK, Sebastian A, Sellmeyer DE, Patel KV, Newman AB, Sarnak MJ, Ix JH, Fried LF; Zdravstvena ABC studija. Koncentracija bikarbonata, acidobazni status i smrtnost u studiji zdravlja, starenja i sastava tijela. Clin J Am Soc Nephrol 11: 308–316, 2016.

20. Harris AN, Lee HW, Osis G, Fang L, Webster KL, Verlander JW, Weiner ID. Razlike u bubrežnom metabolizmu amonijaka u muškim i ženskim bubrezima. Am J Physiol Renal Physiol 315: F211–F222, 2018. doi:10.1152/ajprenal.00084.2018.