Sklop de Novo transkriptoma zasnovan na RNA-Seq i otkriće gena mesnate stabljike Cistanche Deserticola-Ⅰ

Pozadine

Cistanche deserticola je potpuno nefotosintetska parazitska biljka velike medicinske vrijednosti i uglavnom je rasprostranjena u pustinji sjeverozapadne Kine. Njegova osušena mesnata stabljika je ključni toniktradicionalne kineske medicines ulogama uglavnom poboljšanja muške seksualne funkcije i jačanja imuniteta, ali je nekoliko mehaničkih studija provedeno dijelom zbog nedostatka genomskih i transkriptomskih resursa.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA KINESKA TRADICIONALNA MEDICINA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

U ovoj studiji, izvršili smo duboko sekvenciranje transkriptoma u mesnatom stabljici C. deserticola, i oko 80 miliona čitanja je generirano korištenjem Illumina par-end sekvenciranja na HiSeq2000 platformi. Koristeći trinity asembler, dobili smo 95.787 sekvenci transkripta sa dužinama transkripta u rasponu od 200bp do 15.698bp, sa prosečnom dužinom od 950 baza i dužinom N50 od 1.519 baza. 63.957 transkripata je identifikovano kao aktivno izraženo sa FPKM većim ili jednakim 0,5, u kojima je 30.098 transkripata označeno opisima gena ili terminima ontologije gena analizom sličnosti sekvenci u nekoliko javnih baza podataka (Uniprot, NR i Nt na NCBI i KEGG) . Nadalje, identificirali smo ključne enzimske gene uključene u biosintezu lignina i feniletanoidnih glikozida (PhG) za koje se zna da su primarni aktivni sastojci. Četiri gena fenilalanin amonijak-lijaze (PAL), prvi ključni enzim u biosintezi lignina i PhG, identifikovana su na osnovu poređenja sekvenci i filogenetskih analiza. Po prvi put su također predložena dva puta biosinteze PhG.

Zaključci

Sve u svemu, završili smo globalnu analizu transkriptoma mesnate stabljike C. deserticola koristeći RNA-seq tehnologiju. Kolekcija enzimskih gena vezanih za biosintezu lignina i feniletanoidnih glikozida identifikovana je iz sastavljenih i anotiranih transkripata, a takođe je predviđena i porodica gena PAL-a. Podaci o sekvenci iz ove studije pružit će vrijedan resurs za provođenje budućih istraživanja biosinteze feniletanoidnih glikozida i funkcionalnih genomskih studija u ovoj važnoj ljekovitoj biljci.

Uvod

C. deserticola je svjetski rod višegodišnjih pustinjskih biljaka iz porodice Orobanchaceae i potpuno je nefotosintetička vrsta i obično raste podzemna holoparazitska biljka. Parazitira na korijenu psamofita Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), koji uglavnom nastanjuje pustinje i polupustinje zbog svoje visoke tolerancije na sušu i slanost. C. deserticola pokazuje snažnu otpornost na oštre uslove životne sredine i uglavnom je rasprostranjena u severozapadnoj Kini, posebno u Unutrašnjoj Mongoliji, Gansuu i Xinjiangu. Posljednjih godina se smatra ugroženom divljom vrstom zbog povećane konzumacije od strane ljudi. C. deserticola, koji se često naziva pustinjski ginseng, obično je poznat kao pustinjska repa, a osušena mesnata stabljika se već dugi niz godina uveliko koristi kao tradicionalno važan tonik u Kini i Japanu. Prvobitno je zabilježen u Shen Nong Ben Cao Jing (Rječnik kineske Materia Medica, 1977.) prije otprilike 1800 godina i smatran je jednim od glavnih izvoraKineska ljekovita biljka Cistanche.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ekstrakti C. deserticola poseduju širok spektar lekovitih funkcija, posebno za upotrebu u poboljšanju seksualne funkcije, toniziranju bubrega, zaštiti jetre, aperientnoj aktivnosti, poboljšanju pamćenja, imunomodulatornom, antioksidativnom delovanju, antiinflamatornom, antivirusnom delovanju itd. glavne bioaktivne komponente C. deserticola su feniletanoidni glikozidi (PheGs, PhGs). Do danas je više od 20 feniletanoidnih glikozida izolovano iz sočne stabljike C.deserticola. Među njima,akteozid i ehinakozidsu dvije glavne komponente sa značajnim farmakološkim aktivnostima i dokumentirane su kao standardi kvaliteta C. deserticola u kineskoj farmakopeji (izdanja iz 2005. i 2010.). Tri hemijske komponente PhG su organska kiselina, saharid i feniletanoid, međutim, detalji koji se tiču ​​biosintetskih puteva feniletanoida ostaju slabo shvaćeni kod C.deserticola.

Uprkos komercijalnom i medicinskom značaju C.deserticola, genomski i transkriptomski podaci ove vrste su veoma ograničeni. Nema dostupnih EST u bazi podataka NCBI i potpune informacije o genomu za ovu vrstu ostaju nedostupne osim za sekvencu genoma hloroplasta. Ograničeni transkriptomski podaci ometaju proučavanje biosintetskih mehanizama PhG. RNA-seq tehnologija može generirati sekvence eksprimiranih dijelova ciljanog genoma i identificirati gene [18] koristeći NGS tehnološke platforme (kao što su Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq i Roche 454). Postaje sve popularniji u sastavljanju transkriptoma de novo, budući da je to isplativ i moćan pristup sa visokom rezolucijom i širokim dinamičkim rasponom, posebno zato što ima prednost da istražuje transkripte male količine. Zbog različitih prednosti, RNA-seq je posebno privlačan za nemodelne organizme s ograničenim genetskim resursima. Međutim, ne postoji detaljna istraživanja transkriptoma C. deserticola pomoću RNA-seq.

U ovoj studiji smo globalno sekvencirali transkriptom stabljike za C. deserticola koristeći Illumina Hiseq2000 platformu i dobili 7,9G neobrađenih podataka. Sastavljanjem i anotacijom smo iskopali gene uključene u biosintezu PhG i gene odgovorne za cjelokupnu biosintezu lignina. Naša RNA-seq analiza proizvela je prvi konsenzusni transkriptom C. deserticola i pružila nove uvide u sveobuhvatno razumijevanje medicinske vrijednosti C. deserticola. Osim toga, ovdje opisana metoda može se široko primijeniti na profiliranje transkriptoma kako bi se olakšalo otkrivanje gena uključenih u puteve biosinteze specifičnih medicinskih komponenti u drugoj ljekovitoj biljci s vrlo ograničenim genomskim resursima.

Materijali i metode

Sakupljanje biljnog materijala

Svježa sočna stabljika C. deserticola u fazi iskopavanja sakupljena je iz baze biljaka u BayanHot City of Alxa League u Unutrašnjoj Mongoliji u sjeverozapadnoj Kini. Dozvola za sakupljanje dobijena je od vlasnika (HongKui CongRong Group) baze postrojenja. Uzorak vaučera deponovan je u jezgru genomske ustanove na Pekinškom institutu za genomiku Kineske akademije nauka. Nakon čišćenja, sočna tkiva stabljike su izrezana na male komade i odmah zamrznuta u tečnom azotu, a zatim pohranjena na -80 stepeni do dalje obrade.

Ekstrakcija RNK, konstrukcija biblioteke cDNK i Illumina sekvenciranje

Ukupna RNK je ekstrahirana iz sukulentne stabljike korištenjem TRIzol reagensa (Invitrogen Inc., Kalifornija, SAD) prema uputama proizvođača. Dobijeni uzorci su tretirani sa DNazom I kako bi se uklonila bilo kakva genomska DNK. Ekstrahovane RNK su kvantificirane pomoću Agilent 2100 bioanalizera (Agilent Technologies) i provjerene na integritet upotrebom denaturirajuće agarozne gel elektroforeze sa bojenjem etidij bromidom. U narednim analizama korišteni su uzorci RNK sa omjerima A260/A280 između 1,9 i 2,1, omjerima RNA 28S:18S višim od 1,0 i brojevima integriteta RNK (RIN) -8.5.

RNA-seq biblioteke su generisane korišćenjem kompleta za pripremu uzoraka RNA Truseq Illumina. Poly(A)+ RNA je izolirana iz ukupne RNK korištenjem Dynal ligo(dT)25 kuglica prema uputama proizvođača. Nakon pročišćavanja, dodat je pufer za fragmentaciju da se mRNA razbije na kratke fragmente. Prvi lanac cDNK je sintetiziran korištenjem ovih kratkih fragmenata kao šablona, ​​zajedno sa SuperScript III reverznom transkriptazom i N6 slučajnim heksamernim prajmerom. Drugi lanac cDNK je zatim sintetiziran korištenjem pufera, dNTPs, RNaseH i DNK polimeraze I. Rezultirajuća dvolančana cDNK je podvrgnuta krajnjoj popravci korištenjem T4 DNK polimeraze, DNK polimeraze I Klenow fragmenta i T4 polinukleotid kinaze i vezana za adapteri koji koriste T4 DNK ligazu. Adaptor-ligirani fragmenti su pročišćeni upotrebom QiaQuick PCR ekstrakcionog kompleta i eluirani EB puferom. Nakon analize pomoću elektroforeze u agaroznom gelu, odabrani su odgovarajući fragmenti kao šabloni za PCR amplifikaciju. Sekvenciranje rezultirajuće cDNK biblioteke je izvedeno sa Illumina HiSeq 2000 sistemom.

Transkripti de novo sklapanje i kvantifikacija ekspresije gena

Neobrađena čitanja generirana sekvenciranjem očišćena su uklanjanjem sekvenci adaptera (ATCTCGTATGCCGTC) korištenjem interne metode. Zatim smo izvršili strogi proces filtriranja niske kvalitete. Prvo, baze sa ocenom kvaliteta phred nižim od 20 bi se izrezale od 3' kraja niza, sve dok ne naiđu na jednu bazu sa višim kvalitetom (veća ili jednaka 20). Ako je dužina čitanja bila kraća od 50 bp, bila bi odbačena. Drugo, čitanja će se dalje filtrirati prema kriteriju da 70% baza u jednom čitanju ima visokokvalitetne ocjene (veće ili jednako 20). Treće, za dalje sklapanje korišćeno je samo čitanje uparenih krajeva. De novo sastavljanje transkripta je provedeno korištenjem Trinity izdanja_20130216 [30] koje se sastojalo od tri uzastopna softverska modula: Inchworm, Chrysalis i Butterfly. Parametri montaže su postavljeni na sljedeći način: -seqType fq-JM 300G -min_contig_dužina 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.

Da bi se kvantifikovala brojnost transkripata, sekvencirana čitanja na kraju para su ponovo poravnata sa sastavljenim transkriptima koristeći skriptu u Trinityju. Mapirana očitavanja su korištena za kvantifikaciju pomoću softvera RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). Obilje gena ili izoforme predstavljeno je vrijednošću fragmenta po kilobazi transkripta po milionu fragmenata mapiranog (FPKM), oni transkripti čija je vrijednost FPKM jednaka ili veća od 0.05 definirani su kao izraženi.

Funkcionalna bilješka izraženih transkripata

Ne postoje skupovi genskih oznaka C. deserticola osim genoma hloroplasta [1]. Označili smo izražene transkripte upoređujući ih sa Genbank Nt, Genbank Nr i TAIR10_ pep_20101214_ažuriranim skupovima podataka zasebno koristeći program BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

Gene Ontology i KEGG put napomena Usklađivanjem sličnosti sekvenci sa Uniprot bazom podataka (Oznaka Gene Ontology (GO) svih sastavljenih transkripata je dobijena korištenjem asocijacije preuzete sa (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/) baze podataka/GO/goa/UNIPROT/gene_uniprot.gz klasterisanje eksprimiranih gena je provedeno korištenjem prilagođenih skripti, a mi smo označili gene na četvrtom nivou. CC, BP ​​i MF kategorije odvojeno.

Informacije o KEGG putanji su dodijeljene za sve predviđene sekvence proteina pomoću online alata KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Sekvence u fasta formatu su dostavljene na zahtjev KAAS-a, a rezultirajući fajlovi svih informacija o putevima u vezi sa transkriptomom stabljike C. deserticola su preuzeti. 13 skupova genskih podataka biljnih organizama u KEGG korišteno je za označavanje korištenjem BBH (bi-directional best hit) metode.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EKSTRAKT PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RT-qPCR analiza

Nakon digestije sa DNazom I, približno 5 ug ukupne RNK je pretvoreno u cDNK prvog lanca putem reakcije reverzne transkripcije sa oligo(dT)15 prajmerima i GoScript sistemom reverzne transkripcije (Promega). cDNK proizvodi su zatim razrijeđeni 10- puta sa deioniziranom vodom bez nukleaza prije upotrebe kao šablona u PCR-u u realnom vremenu. Specifične cDNK su amplificirane pomoću GoTaq 2-Step RT-qPCR sistema (Promega) u zapremini od 20 ul. PCR amplifikacija je izvedena na temperaturi žarenja od 60 stepeni sa 7500 Real-Time PCR Detection System (Applied Biosystems) prema uputstvima proizvođača. Relativna zastupljenost transkripata izračunata je metodom uporednog ciklusa praga sa genom "comp10579_c0" kao internim standardom, koristeći softver 7500 Manager.

Parovi prajmera za RT-PCR dizajnirani su na osnovu onlajn softvera (http://primer3.ut.ee/) i navedeni su u S1 skupu podataka.

Rezultati

RNK sekvenciranje i de novo sastavljanje transkriptoma mesnatog stabla C. deserticola

Stabljika C. deserticola se već dugi niz godina uveliko koristi kao tradicionalno važan tonik u Kini i Japanu. Da bismo dobili globalni pregled ekspresije gena u mesnatom stablu C. deserticola, prikupili smo uzorke stabljike C. deserticola iste biljne baze 2013. odnosno 2014. godine. Ukupne RNK su ekstrahovane i poliA+ RNK su pročišćene za konstruisanje biblioteka RNA sekvenci sa uparenim krajevima. 79,433,734 i 86,019,176 čitanja na kraju u paru što odgovara skoro 8 milijardi i 8,6 milijardi baza sekvence dobijeno je korištenjem Illumina HiSeq 2000 sekvenciranja

platforma u uzorcima 2013-godine i 2014-godine (tabela 1). Nakon uklanjanja sekvenci adaptera i filtriranja čitanja niskog kvaliteta (pogledajte detalje u Metodama), 64,831,040 visokokvalitetnih čitanja na kraju para u uzorku 2013-godine korišteno je za de novo sastavljanje transkriptoma. Koristeći Trinity sekvencijski asembler [30], generisano je 51.719 gena i 95.787 transkriptnih sekvenci sa dužinama transkripta u rasponu od 200 bp do 15.698 bp. Prosječna dužina sastavljenih transkripata je 950 osnova, a dužina N50 1.519 osnova. Broj transkripata različitih dužina otkrio je da je 57,32% sakupljenih transkripata bilo oko 500 bp ili duže (slika 1A). Visokokvalitetna čitanja na kraju u paru u uzorku 2014- godine mapirana su u sastavljeni transkriptom. Osim toga, otkrili smo da je broj transkripta za svaki sastavljeni gen varirao i da je 69% gena sa jednom izraženom izoformom, dok je 31% gena eksprimiralo dva ili više transkripata (slika 1B).

Kvantifikacija izraza i funkcionalna anotacija sastavljenih transkripata

Obilje gena ili transkripata je kvantificirano korištenjem paketa RSEM, u kojem su sekvencirana očitanja ponovo usklađena sa okupljenim genima ili sekvencama transkripata pomoću Bowtie, a ta mapirana očitanja su korištena za kvantifikaciju. Izračunata je vrijednost FPKM za svaki gen ili transkript i konačno smo identificirali 63,957 i 52,857 aktivno eksprimiranih transkripata (FPKM vrijednost veća ili jednaka 0.5) u uzorcima mesnatih stabljika C. deserticola u 2{{17} }13. odnosno 2014. godine. 44.776 transkripata (70,01% u 2013-godišnjem uzorku, 84,71% u 2014-godišnjem uzorku) je uobičajeno izraženo u dvije replike, a korelacija (Pearsonov koeficijent korelacije: 0,91979) njihovih podataka o ekspresiji je bila prikazano na S1 slici. Neobrađeni podaci sekvenciranja su učitani u NCBI SRA bazu podataka (pristupni brojevi: SRX857402 i SRX858938). Koristili smo eksprimirane gene identificirane u 2013-godišnjem uzorku za dalju analizu. Funkcionalne napomene za sve izražene transkripte dobivene su korištenjem dvije metode. Prvo, svi eksprimirani transkripti su odvojeno usklađeni sa poznatim bazama podataka nukleotida (GenBank nt) i peptidnih sekvenci (GenBank nr i Arabidopsis peptid) pomoću BLAST algoritma. Od 63.957 dostavljenih transkripata,

29.220 (45,7%) je označeno i pokazalo homologiju sa sekvencama u bilo kojoj od tri subjektne baze podataka sa graničnom vrijednošću E 1e-20. U međuvremenu, regioni kandidati za kodiranje za sve eksprimirane transkriptne sekvence su predviđeni pomoću TransDecoder softvera, a najduži ORF-ovi za svaki transkript su korišteni za pretragu Pfam domena. Kao rezultat toga, 21.358 (33,4%) transkripata je označeno na osnovu Pfam baze podataka. Sve u svemu, 30.098 (47,1%) transkripata je značajno usklađeno sa poznatim genima u javnim bazama podataka kombinacijom dvije gore navedene metode. Kompletna lista ekspresnih transkripata sa napomenom funkcije prikazana je u dopunskim podacima (S2 Dataset).

Ispitali smo 20 najizraženijih transkripata (Tabela 2) koji odgovaraju 18,99% svih očitavanja sekvenciranja i otkrili da su većina njih geni koji reaguju na abiotičke

stresni stimulans. Dehidrin (DHNs), klasa hidrofilnih i termostabilnih stresnih proteina sa velikim brojem nabijenih aminokiselina koje pripadaju grupi II Late Embryogenesis Abundant (LEA) familiji, je gen sa najviše ekspresije. Tri različita transkripta Dehyrina (comp28713_c0_seq1/2/4) su otkrivena kao visoko eksprimirana u mesnatim stabljikama koje mogu biti uključene u zaštitu ćelija od oštećenja uzrokovanih stresom od suše. Ostali geni povezani sa stresom, kao što su protein toplotnog šoka, protein povezan sa patogenom, i metalotionein, takođe su pronađeni visoko eksprimirani, što može biti povezano sa teškim okruženjem za preživljavanje. Dodatno, neki konstitutivni geni uključujući 26S ribosomalnu RNK gen (comp22329_c2_seq1), protein potisnut auksinom/uspavanost (comp20999_c0_seq1), ADP-ribozilacijski faktor (comp20499_ c0_seq1) je također visoko transkribovan.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE IMUNITETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%