Brzo simultano određivanje šest efikasnih komponenti u Cistanche Tubulosa pomoću bliske infracrvene spektroskopije

1. Uvod

Cistanche (Hoffmg. Et Link) je višegodišnji fanerogamski rod iz porodice biljaka Orobanchaceae. Većina vrsta koje pripadaju rodu Cistanche korišćene su kao lekovita biljka milenijumima u Kini; imati reputaciju vrhunskog tonika; i poznati su kao "Ginseng of the Deserts". Cistanche tubulosa je obavezan parazit korijena višegodišnje biljke Tamarix chinensis. Dokumentiran je u kineskoj farmakopeji kao autentični izvorCistanches Herba(kinesko ime: Roucongrong) iz izdanja iz 2005. Moderna farmakološka istraživanja vrste Cistanche pokrenuta su 1980-ih. Farmakološka istraživanja su pokazala da ekstrakti biljke Cistanche poseduju širok spektar delovanja, kao što su lečenje nedostatka bubrega i senilne konstipacije, unapređenje sposobnosti učenja i pamćenja, protiv Alchajmerove bolesti, jačanje imuniteta, protiv starenja, protiv umora itd. U poslednje tri decenije, sveobuhvatna i sistematska farmakološka istraživanja kombinovana su sa fitokemijskim istraživanjima kako bi se osvetlila materijalna osnova blagotvornog dejstva korena biljaka Cistanche. Ova istraživanja pokazuju da su feniletanoidni glikozidi (PhG) bile glavne efikasne komponente u biljkama Cistanchea koje igraju ključnu ulogu u liječenju nedostatka bubrega, impotencije, protiv starenja i Alchajmerove bolesti. Sadržaj dvaju PhG (ehinakozida i verbaskozida) bio je potreban u kineskoj farmakopeji. U međuvremenu, ugljikohidrati kao što su manitol, saharoza, glukoza i fruktoza u biljkama Cistanche posjeduju laksativnu funkciju i klastere ugljikohidrataCistanche biljkekorišteni su za liječenje zatvora.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POVEĆANJE TESTOSTERONA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Divlji resursi C. tubulosa uglavnom su rasprostranjeni u području oko pustinje Taklamakan u južnoj autonomnoj regiji Xinjiang u Kini. Slično mnogim drugim vrstama koje se koriste kao tradicionalni kineski lijekovi (TCM), C. tubulosa ima veliku ekonomsku vrijednost i gotovo je izumrla u svom divljem staništu zbog prekomjernog sakupljanja. Uzgoj C. tubulosa počeo je 1990-ih u Kini kako bi se osigurala opskrba sirovinama za Cistanches Herba, kao i zaštitili resursi divljih biljaka. Od 2017. godine u prefekturi Hotan u Xinjiangu postoji skoro 13 hiljada ha kultivisane vrste C. tubulosa. Napredak u tehnologiji sadnje je potreban za proširenje uzgoja, kao i za poboljšanje kvaliteta C. tubulosa.

Primarna svrha uzgoja C. tubulosa je proizvodnja Cistanches Herba, koja je bogata tim efikasnim komponentama. Međutim, sadržaj efektivnih komponenti uCistanches Herba, kao što su PhG i oligosaharidi, mogu biti pod značajnim uticajem mnogih faktora tokom proizvodnje. Trebalo bi istražiti sistem detekcije kvaliteta C. tubulosa u realnom vremenu. Stoga je potrebno razviti metodu visoke propusnosti kako bi se ispunio zahtjev analize velikog broja uzoraka u kratkom periodu. Tradicionalno, određivanje tih primarnih efikasnih komponenti, kao što su PhGs i ugljikohidrati, u C. tubulosa se obično postizalo pomoću tečne hromatografije visokih performansi (HPLC). Iako je precizan i pouzdan, dugotrajan je i naporan za prikupljanje i obradu podataka. Osim toga, potrebno je mnogo vremena i truda za pripremu uzoraka koja obično uključuje usitnjavanje, ekstrakciju i filtraciju HPLC testova. Stoga su za dobijanje relativno velike količine podataka potrebni jasan princip i alat koji se lako koristi. Srećom, bliska infracrvena spektroskopija (NIRS) se intenzivno koristi za procjenu poljoprivrednih proizvoda, hrane, medicinskih uzoraka i farmaceutskih proizvoda jer je brza i nedestruktivna. Prema tome, NIRS bi mogao u potpunosti odgovarati zahtjevima za efikasna mjerenja TCM-a, i, nije iznenađujuće, NIRS je primijenjen za kvalitativnu identifikaciju i kvantifikaciju jedinjenja u TCM-ima.

U ovoj studiji, sadržaj šest efektivnih komponenti, uključujućiehinakozid, verbaskozid, manitol, saharoza, glukoza i fruktozau 116 serija uzoraka C. tubulosa koji su sakupljeni iz prefekture Hotan u Xinjiangu 2013–2015. prvo su određeni HPLC. Nakon toga, kalibracijski modeli ovih šest komponenti su uspostavljeni metodom parcijalne regresije najmanjih kvadrata (PLSR). Ovi modeli su zatim validirani sa koeficijentima korelacije i greškama predviđanja u kalibracionim setovima. Rezultati su pokazali da se razvijena metoda može koristiti kao pouzdana metoda za kvantitativnu analizu C. tubulosa.

2. Rezultati

2.1. HPLC analiza

Sadržaj odehinakozid i verbaskozidOdređeni su dobro definisanom HPLC-UV metodom u literaturi, a četiri ugljikohidrata (manitol, saharoza, glukoza i fruktoza) su određena dobro definiranom HPLC-ELSD metodom u literaturi za svih 116 uzoraka. Priprema uzoraka i metode određivanja opisane su u odjeljcima 3.1 i 3.3. Slika 1 prikazuje karakteristične hromatograme miješanih standarda. Može se vidjeti da je svih šest efektivnih komponenti bilo odvojeno od osnovne linije i stoga se moglo kvantifikovati. HPLC metoda je validirana prije testiranja uzorka. Glavni rezultati HPLC metode su navedeni u tabeli 1. Povoljan linearni odnos (r=0.9998) i oporavak (98,5%) metode određivanja ehinakozida prikazani su u rezultatima, isti rezultat kao i svih pet komponente. Stoga se sadržaj šest efektivnih komponenti može precizno odrediti. Svi utvrđeni rasponi sadržaja sumirani su u tabeli 1.

2.2. NIRS analiza

Slika 2 prikazuje NIR spektre (4000–10,000 cm−1) uzoraka C. tubulosa. Značajni apsorpcijski pikovi su se pojavili od 4000 cm−1 do 7500 cm−1 u svim uzorcima, dok su se pojavile blage fluktuacije od 7500 cm−1 do 10 000 cm−1. Pomjeranje osnovne linije NIR spektra je došlo jer je uzorak bio lako pod utjecajem faktora kao što su veličina čestica i boja (slika 2A). Matematički pripremni tretmani spektra su korišćeni da bi se u određenoj meri smanjio uticaj nepotrebnih informacija. Matematički predtretmani uključivali su prvu derivaciju (1. derivaciju), drugu derivaciju (2. derivaciju), standardnu ​​normalnu varijantu (SNV) i multiplikativnu korekciju rasipanja (MSC). Slika 2B prikazuje 2. derivaciju NIR spektra C. tubulosa, a uočene su značajne varijacije koje su se javile iz tri regiona, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 i 7000–7500 cm−1.

2.3. Uspostavljanje kvantitativnih modela kalibracije

Parcijalna regresija najmanjih kvadrata (PLSR) je klasična metoda modeliranja i široko se primjenjuje u kvantitativnim modelima zbog visokog kvaliteta rezultata. Prednosti PLSR-a uključuju njegovu dobru sposobnost predviđanja i relativnu jednostavnost. PLSR se također široko primjenjuje u uspostavljanju kvantitativnih kalibracijskih modela TCM-a [25]. Na osnovu prethodno obrađenih NIR spektra, model kvantitativne NIR analize za šest efektivnih komponenti u C. tubulosa je uspostavljen korišćenjem PLSR metode sa podacima HPLC analize kao pravim vrednostima. 116 uzoraka je nasumično podijeljeno u setove za kalibraciju i validaciju u omjeru 3:1. Najpogodniji uslovi za kalibraciju izabrani su niskim RMSEC i visokim koeficijentom korelacije.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Izbor talasnog opsega za kalibracione modele

Odabir odgovarajućeg talasnog opsega bio je važan korak za izgradnju kalibracionog modela. U ovoj studiji, upoređeni su spektri NIR intervala od 4000–7500 cm−1 (preporučeno od strane TQ analyst software) i 4000–10,000 cm−1. Uočeno je da je ovaj raspon neprikladan za kalibraciju na intervalu između 4000 cm−1 i 7500 cm−1 iz Tabele 2. Stoga su u trenutnoj studiji spektralni intervali za šest hemijskih sastojaka odabrani iz intervala od 4000 do 10 000 cm−1 poređenjem performansi RMSEC i koeficijenta korelacije.

2.3.2. Izbor optimalnog broja faktora za kalibracione modele

PLSR objašnjava maksimalnu količinu varijabilnosti u podacima smanjenjem dimenzionalnosti podataka spektra izračunavanjem faktora. Problem "nedovoljne opremljenosti" pojavio se zbog nedovoljne informacije koja je rezultat ograničenog broja faktora; međutim, odabir faktora koji su veći od optimalnih vrijednosti uvedenih u model dovešće do problema "preopterećenosti". Ili "nedovoljna opremljenost" ili "preopterećenost" će smanjiti prediktivnu moć uspostavljenih modela [22]. Slika 3 prikazuje odnos između RMSEV i faktora za svih šest jedinjenja. Stoga smo odabrali one faktore koji odgovaraju najnižim vrijednostima RMSCV. Optimalni izbor faktora za kalibracione modele naveden je u tabeli 3.

2.3.3. Izbor spektralnog predtretmana za kalibracione modele

Još jedan kritični uticajni faktor za kalibracione modele je spektralna predtretman koja ima za cilj smanjenje uticaja rasejanja i pomeranja osnovne linije, poboljšanje odnosa signal-šum i uklanjanje nepravilnih varijacija. Korištene su metode multiplikativne korekcije raspršenja (MSC) i standardne normalne varijacije (SNV) kako bi se eliminisao utjecaj rasipanja zračenja. Da bi se riješili efekti pomaka osnovne linije, upoređeni su 1. i 2. spektri derivata i odabrana je 2. derivacija. Za željeni efekat, izgladili smo spektre sa Savitzky-Golay (SG) filter algoritmom prije derivacije kako bismo spriječili povećanje šuma. Tabela 3 prikazuje informacije o spektralnoj prethodnoj obradi i njene rezultate za kalibracijske modele.

2.4. Evaluacija uspostavljenih modela

Dobar NIRS kalibracioni model treba da ima niske vrednosti RMSEC i RMSEP, kao i visok koeficijent korelacije (r) i male razlike između RMSEC i RMSEP. Modeli kalibracije šest odabranih spojeva su uspostavljeni prema gore navedenim procedurama (Tabela 3). Vrijednosti RMSEC i r za kalibracijski set ehinakozida bile su 27,6 i 0.9808, respektivno. Parametri performansi drugih modela hemijskih jedinjenja navedeni su u Tabeli 3, iz koje možemo zaključiti da uspostavljeni modeli daju zadovoljavajuće rezultate predviđanja i da se mogu koristiti za brzu kvantitativnu analizu C. tubulosa. Dijagrami raspršenosti šest hemijskih jedinjenja prikazani su na slici 4 kako bi kalibracioni modeli učinili opisnijim i vizuelno posmatranim. Kao što je prikazano na slici 4, došlo je do manjih razlika između prediktivnih i izmjerenih vrijednosti, jer je većina tačaka raspoređena oko regresivne krive sa jednadžbom kao y=x. Stoga su odlične prediktivne performanse uočene na slici 4.

3. Materijali i metode

3.1. Priprema uzorka

Stotinu šesnaest uzoraka C. tubulosa prikupljeno je iz prefekture Hotan u autonomnoj regiji Xinjiang od 2013. do 2015. godine. Svi uzorci su kultivisani, ali su sakupljeni u različitim fazama rasta. Svježa težina uzoraka bila je od 20 g do 1000 g. Nakon sušenja na suncu, osušeni uzorci su usitnjeni i prosijani kroz 60-mrežasto sito.

3.2. NIR spektroskopsko prikupljanje podataka

NIR spektri uzoraka prikupljeni su u intervalu od 8 cm−1 u spektralnom području od 4000–10,000 cm−1 pomoću Antaris MXFT-NIR sistema (Thermo Scientific, Madison, WI, SAD) opremljenog ručni adapter za refleksiju optičkih vlakana. Svaki spektar je dobijen u prosjeku 64 skeniranja. Svi uzorci su ostavljeni da se uravnoteže na sobnoj temperaturi (25 ◦C) prije skeniranja NIR spektra kako bi se osiguralo da su uzorci analizirani na istoj temperaturi. Vlažnost u laboratoriji održavana je na ambijentalnom nivou.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE FUNKCIJE BUBREGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. HPLC prikupljanje podataka

3.3.1. Priprema za ekstrakciju

Jedan gram praha C. tubulosa je ekstrahovan sa 50 mL 50% metanola u konusnoj tikvici uz ultrazvučnu obradu (500 W, 40 KHz) tokom 30 minuta. Ekstrakt je čuvan na 4 ◦C. Supernatant ekstrakta je filtriran da bi se dobio uzorak za HPLC analizu.

3.3.2. Simultano određivanje ehinakozida i verbaskozida pomoću HPLC-UV

Analiza tečnom hromatografijom obavljena je na Shimadzu UHPLC sistemu (Shimadzu, Kjoto, Japan) koji se sastoji od dvije jedinice za isporuku rastvarača LC-20ADXR, LC-20AD pumpe, SIL-20ACXR auto uzorkivač, pećnica CTO-20AC kolona, ​​SPD-M20A DAD detektor, DGU-20A3R degazer i CBM-20A kontroler.

Grace Prevail Carbohydrate ES kolona (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) korištena za hromatografsko razdvajanje održavana je na 35 ◦C. Mobilna faza se sastojala od acetonitrila (A) i 0.1% vodene mravlje kiseline (B) i isporučena je prema programu gradijenta kako slijedi: 0–7 min, linearni gradijent od 10–20% A; 7–15 min, 20% A; i 15–20 min, linearni gradijent od 20–10% A. Brzina protoka mobilne faze bila je 0,4 mL/min. UV monitoring je obavljen na 330 nm.

3.3.3. Istovremeno određivanje manitola, saharoze, glukoze i fruktoze sa HPLC-ELSD

HPLC je izveden na Agilent 1100 seriji LC sistemu (Palo Alto, Kalifornija, SAD) koji se sastoji od G1322A degasera, G1311A kvaternarne pumpe, G1311A autosamplera, G1316A regulatora temperature kolone i G1315B DAD detektora.

Sigma Prevail Carbohidrat ES kolona (4,6 × 250 mm, 5 µm) je korištena za hromatografsko razdvajanje i održavana na temperaturi kolone od 25 ◦C. Mobilna faza je bila sastavljena od acetonitrila i vode (77:23, v/v) i izokratskog saveza dovedena pri brzini protoka od 0,7 mL/min. Efluent je praćen pomoću detektora evaporativnog raspršivanja svjetlosti (ELSD) sa zadanim parametrima.

3.4. Obrada podataka

TQ Analyst (verzija 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, SAD) je korišten za podjelu kalibracijskih i validacijskih setova, matematičku prethodnu obradu spektra, uspostavljanje kalibracijskih modela i druga izračunavanja . Za izradu figura korišteno je porijeklo (verzija 9.1).

4. Zaključak

U ovoj studiji predložili smo brzu i nedestruktivnu metodu za simultanu analizuehinakozid, verbaskozid, manitol, saharoza, glukoza i fruktozainC. tubulosaod NIRS. Analize RMSEC, koeficijenta korelacije, RMSEP i Rp vrijednosti pokazale su da se uspostavljeni kvantitativni NIR modeli mogu koristiti za precizno predviđanje sadržaja šest odabranih efektivnih komponenti uC. tubulosa. U poređenju sa HPLC-om, NIRS metoda prikazana u ovoj studiji može značajno uštedjeti rad i vrijeme, uz održavanje zadovoljavajuće kvantitativne analize. Stoga, ovdje navedena metoda ima potencijal da se koristi u kontroli kvalitetaC. tubulosaa time i usmjeravanje razvoja uzgoja i procesne tehnologije zaC. tubulosa.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%