Going Micro in Leptospiroza Bubrežna bolest Ⅱ

4. Odgovori imuniteta domaćina na Leptospira spp.

Glavni put Leptospira je direktna penetracija sluzokože ili otvorene kože kroz krv, tkiva, urin ili kontaminiranu vodu, koja se širi kroz sistemsku cirkulaciju i diseminira u nekoliko organa, kao npr.jetra, pluća i proksimalni tubulnefron u bubrezima, gdje se može razmnožavati i preživjeti mjesec dana [51]. U početnoj fazi infekcije,urođeni imuni odgovorigra osnovnu ulogu prve linije odbrane kod leptospiroze, utičući na odgovorreceptori za prepoznavanje obrazaca, fagocitoza makrofaga, indukcija ekstracelularnogakumulacija neutrofila, iintervencija sistema komplementa [52].

Theimuni odgovorkod ljudi igra bitnu ulogu urazvoj kliničkih znakova, kao i faktori virulencije nekih patogenih sojeva. Većina ljudskih leptospiroza je asimptomatska ili blaga, a samo 10% slučajeva razvije teške oblike s multiorganskim zatajenjem i povećanom stopom mortaliteta povezanom scitokinska olujai status imunoparalize. Patogene vrste stimulišu humoralni odgovor u fazi bakteremije, iako naknadno ponašanjeimuni odgovorje nejasno. U studijama pacijenata sa višestrukim kliničkim manifestacijama leptospiroze, težina kliničke slike povezana je sa različitim nivoima serumskih citokina, kao što su TNF-, IL-10 i IL-6 [53], ali ovaj zaključak ostaje kontroverzan [54]. Ova stanja su dovela do povećanog interesa za razumijevanje imunološkog odgovora općenito i bioloških događaja koji se javljaju tokom infekcije.

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi?

4.1. Leptospira i sistem komplementa

Proteolitička aktivnost leptospiralnih proteaza protiv ekstracelularnog matriksa omogućava infekciji da uđe u cirkulatorni tok. Sistem komplementa u cirkulatornom sistemu jedan je od glavnih mehanizama urođenog imunološkog odgovora na patogene Leptospire. Međutim, Leptospira je razvila strategije da izbjegne napad sistema komplementa vezivanjem proteina za molekule komplementa i proizvodnjom proteaza, kao što je termolizin, termostabilni neutralni metaloproteinazni enzim koji utječe na C3 proteinski lanac. Patogeni sojevi vezuju faktor H (FH), protein 1 povezan sa faktorom H (FHR-1), protein sličan faktoru H (FHL-1) i protein koji vezuje C4b (C4BP), sve od kojih su odgovorni za inhibiciju sistema komplementa [55]. Postoje tri glavne strategije za izbjegavanje komplementa kod patogenih Leptospira [55,56] putem interferencije regulatora komplementa domaćina, proteaze domaćina i bakterijske proteaze. Za regulatore komplementa, Leptospira koristi faktor H (FH; regulator alternativnog komplementarnog puta) i C4 vezujući protein (C4BP; regulator klasičnih i lektinskih komplementnih puteva) da ubrza raspad C3 konvertaza i djeluje kao kofaktor za faktor I. za cijepanje C3b i C4b [57,58]. Leptospiralni protein (LcpA), zajedno sa vitronektinom (Vn; terminalni regulator puta) vezuje C9 i inhibira njegovu polimerizaciju [59], čime potencijalno blokira formiranje kompleksa koji aktivira membranu (MAC) [60]. Uz to, patogena Leptospira vezuje nekoliko proteaza domaćina, kao što je aktivator plazminogena tipa urokinaze (uPA), koji induciraju aktivni plazmin [61] (serinska proteaza) za varenje C3b, C4b i C5 na površini Leptospira [62]. Štaviše, metaloproteaze i termolizin, endogena Leptospira proteaza, mogu cijepati i inaktivirati nekoliko proteina komplementa (C2, C3, C4 i faktor B) [60]. Kombinacija regulatora komplementa, iz domaćina i patogene Leptospira, olakšava kolonizaciju bakterija u ciljnim organima domaćina [63].

4.2. Leptospira i Neutrofili

Tokom infekcije, patogene vrste Leptospira izazivaju snažnu aktivaciju neutrofila i proinflamatorni odgovor. Neutrofili su važni za kontrolu mikroorganizama, ali također doprinose oštećenju tkiva u domaćinu. Pokazalo se da niski nivoi ekstracelularne akumulacije neutrofila zbog niske aktivnosti neutrofila u cirkulaciji povećavaju leptospiremiju, što ukazuje da intravaskularno stvaranje novih neutrofila može biti kritično u sprečavanju ranog širenja patogenih Leptospira [64].

4.3. Leptospira i makrofagi

U početnoj fazi infekcije Leptospira, makrofagi igraju važnu ulogu u eliminaciji spirohete. Ovaj efektorski mehanizam zajedno sa efikasnim odgovorom citokina povezan je sa fagocitnom kontrolom i širenjem infekcije, iako Leptospira spp. pokazalo se da inducira apoptozu u makrofagima putem Fas/FasL-kapaze-8/-3 puta i olakšava njihov opstanak i proliferaciju u domaćinu zbog oslobađanja apoptoze i endonukleaze koji induciraju mitohondrijski faktor kod inficiranih makrofagi [65]. Nedavna istraživanja su sprovedena na mikro-transkriptomu makrofaga inficiranih Leptospirom kako bi se utvrdili epigenetski mehanizmi, kao što je post-transkripciona regulacija pomoću RNK. Makrofagi inficirani Leptospira pokazali su da su mikroRNA (miRNA) regulisane infekcijom spirohetom, pokazujući da je ova regulacija vitalno važna u odgovoru ovih ćelija imunog sistema na infekciju Leptospira [66]. U ljudskim makrofagima, aktivacija upale posredovane reaktivnim vrstama kiseonika i lizosomalnim katepsinom B izazvanom infekcijom Leptospira ima izražene nivoe NLRP3 i IL-18, favorizujući proizvodnju IL-1 i dovodi do visokog mogućnost fagocitoze i brzo modeliranje nekih citokina u korelaciji sa otpornošću na leptospirozu [67].

4.4. Humoralni odgovor na Leptospira

Specifičan humoralni odgovor na Leptospira karakteriše stvaranje IgM i IgG antitela trećeg dana od pojave simptoma. Osim toga, prijavljena je proizvodnja IgA od prvog do devetog mjeseca nakon infekcije; u stvari, povećanje IgM je korišteno kao alternativna mjera u ranoj dijagnozi leptospiroze [68]. Efekat humoralnog odgovora kod ljudi sa leptospirozom omogućava da se serološka dijagnoza postavi nakon prirodne infekcije [69]. Najvažniji aspekt humoralnog odgovora kod infekcije Leptospira može biti stvaranje zaštitnih antitijela. Vakcine koje su trenutno dostupne za leptospirozu sastoje se od kompletnih ćelijskih preparata i imaju ograničenja, kao što su niska efikasnost, višestruke nuspojave, slabo stvaranje imunološke memorije i nedostatak unakrsne zaštite za razlike u serovarima. Stoga je razvoj novih vakcina neophodan za kontrolu bolesti, a trenutno se provode istraživanja za proizvodnju vakcina genetskom imunizacijom [70]. Leptospira OMP se smatra antigenom, sa boljom imunogenošću za B limfocite, koji uključuju strukturne epitope OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ {9}} i LipL41263-282 [71]. Ovi epitopi su obećavajući kandidati za razvoj univerzalne vakcine.

4.5. Prilagodljivi imuni odgovor na Leptospira: T-ćelije i citokini

Patogene vrste Leptospira indukuju imuni odgovor posredovan T i B limfocitima, praćen ekspresijom citokina koji mogu biti povezani sa gravitacionim kartama. Aktivacija T ćelija tokom infekcije Leptospirom pokreće inflamatorni odgovor, uglavnom kroz proizvodnju citokina. Ovo je ključno za ranu eliminaciju infekcije, ali nekontrolirana proizvodnja proupalnih citokina također može rezultirati prekomjernom proizvodnjom citokina praćenom stanjem imuno-paralize, što može dovesti do sepse i zatajenja više organa. T limfociti proizvode IL-1, IL-6, IL-12, interferon (IFN)- i TNF-, koji funkcionišu kao hemo-atraktanti za regrutaciju leukocita na mjestu infekcije. Zanimljivo je da su in ex vivo naivne δ T ćelije proliferirale u kulturama mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) stimuliranih antigenima Leptospira zajedno sa proizvodnjom i IL-17 i IFN [72]. Štaviše, dok su miševi divljeg tipa inficirani leptospirozom pokazali više nivoe obilja citokina, uključujući IL-4, IL-10 i IL-13 u poređenju sa neinficiranim miševima, leptospirom indukovane mišje hronične nefritis (Daf1-/- miševi) pokazao je veću ekspresiju aktina glatkih mišića, IL-10, IL-13, ali bez razlike IL-12 i IL{{21} } nivoi [73]. Kao takvi, Daf1 i IL-17 mogu igrati ključnu zaštitnu ulogu u progresiji CKD kao veza između mišje CKD izazvane Leptospirom i renalnom fibrozom [72,73]. Međutim, hipoteza o odabranom odgovoru citokina u progresiji bolesti za sada je još uvijek neuvjerljiva u ljudskoj leptospirozi. Kod pacijenata sa teškom leptospirozom i plućnom zahvaćenošću, povišeni nivoi IL-6, CXCL8 i IL-10 su dobijeni u poređenju sa pacijentima sa blagom leptospirozom [53]. Ove visoke koncentracije citokina kod pacijenata sa leptospirozom ističu njihovu ključnu ulogu u razvoju teške leptospiroze.

Kod pacijenata sa teškom infekcijom nalaze se CD4+ T limfociti sa proinflamatornim profilom i proizvođači IL-2 i IFN- dok su CD4+ CD25 visoki proizvođači IL-10 skoro da ih nema. Čini se da regulacija imunog odgovora posredovanog T limfocitima ne sprječava oštećenje tkiva uzrokovano upalnim odgovorom na Leptospira. U CD4+ T limfocitima ljudi sa teškom leptospirozom, proizvodnja TNF-a i drugih proinflamatornih citokina je veća nego kod onih sa blagim oblikom bolesti, što ukazuje da se ovi citokini mogu koristiti kao markeri ozbiljnosti u imunološkoj fazi infekcije [74]. Proizvodnja IL-10 je povezana sa rizikom od smrti kod ljudi sa leptospirozom; međutim, studija provedena na izloženim i asimptomatskim ljudima povezala je proizvodnju ovog citokina s kontrolom upalnog odgovora i preživljavanja [74]. Tokom infekcije Leptospira, inflamatorni medijatori i djelovanje nekih ćelija leukocita, kao što su T limfociti, brzo se regulišu kod rezistentnih osoba, za razliku od onoga što se dešava kod osoba s teškim oblicima leptospiroze [75].

Ukratko, imunološki odgovor na infekciju Leptospira nije u potpunosti shvaćen zbog kliničkog ponašanja pacijenata sa leptospirozom, koji stupaju u interakciju s različitim faktorima virulencije bakterijskog genoma, što daje Leptospira solidan patogeni kapacitet.

5. Kliničke manifestacije

Kliničke manifestacije leptospiroze su raznolike, u rasponu od blagih, nespecifičnih simptoma, kao što su simptomi slični gripi (groznica, mijalgija i glavobolja), do teških simptoma zajedno s ozljedama organa u završnoj fazi (npr. AKI, akutno zatajenje jetre). i krvarenja dijateza, također poznata kao Weilov sindrom), akutna hemoptiza zbog plućne hemoragije, akutna konfuzija zbog aseptičnog meningoencefalitisa i akutna srčana insuficijencija zbog akutnog ili subakutnog miokarditisa [7]. Shodno tome, tri indikatora sumnje na infekciju leptospirozom sastoje se od (i)akutna febrilna bolest, (ii) žutica, i (iii)akutna povreda bubrega[12]. Prediktori teškog oblika leptospiroze su teška mijalgija na početku, teška sklonost krvarenju i izražena žutica. Zanimljivo, prisustvo bilo koje već postojećehronična bolest bubrega(mala veličina bubrega) ili uvećani, zagušeni bubrezi s anurijom povezani su s najgorim ishodom [12]. Stoga, bolesnike s bubrežnom bolešću povezanom s leptospirozom treba odmah liječiti.

6. Dijagnoza

6.1. Klinička dijagnoza

Dijagnoza leptospiroze zasniva se na anamnezi izloženosti, faktorima rizika i kliničkim manifestacijama. Visok indeks sumnje može zaobići kasnije oštećenje organa. Međutim, simptomi leptospiroze se često pogrešno smatraju drugim uzrocima akutnog febrilnog sindroma, kao što su denga infekcija, malarija, hepatitis i aktivna autoimuna bolest. Nedostatak patognomoničnih znakova leptospiroze znači da se dijagnoza okvirno zasniva na procjeni groznice i mijalgije kod pacijenata iz endemskog područja. Zbog toga je neophodna laboratorijska dijagnoza leptospiroze.

6.2. Laboratorijska dijagnostika

Leptospirozu je teško dijagnosticirati u laboratoriji, posebno u akutnoj fazi. Može se izvesti direktnim identificiranjem spiroheta ili njihovih komponenti u tjelesnim tekućinama ili tkivima, izolacijom leptospira u kulturi ili otkrivanjem određenih antitijela u različitim kliničkim fazama. Leptospirozu je teško razlikovati od bolesti, kao što su malarija, denga groznica, rikecija, gripa, hepatitis i žuta groznica zbog njenog nejasnog kliničkog izgleda. Kao rezultat toga, potrebni su laboratorijski testovi za potvrdu dijagnoze. Detekcija antitijela protiv leptospira, samih leptospira ili njihove deoksiribonukleinske kiseline je osnova za ove testove (DNK). Trenutna laboratorijska dijagnoza uključuje i direktnu identifikaciju (detekcija Leptospira spirohete ili DNK u uzorcima ili izolacija organizma iz uzoraka) i indirektnu detekciju (serološka dijagnoza ili serologija za identifikaciju Leptospiralne infekcije, koja se zasniva na detekciji specifičnih antitijela protiv različitih Leptospiralni antigeni) (Tabela 1).

6.2.1. Direktno mikroskopsko ispitivanje, kultura i detekcija antigena

Leptospire su tanke, svijetle, aktivno pokretljive spirale s karakterističnim brzim okretanjem (motilitetom trzanja) pod konvencionalnim mikroskopom tamnog polja (DFM) i potrebno je približno 10 leptospira/mL za detekciju jedne ćelije po polju. Sa nedelju dana dužim tokom trajanja infekcije, oko 10% je umrlih u prinosu DFM (od 100 do 90%). Za povećanje osjetljivosti, nekoliko posebnih metoda bojenja; Warthin– Starry srebrno bojenje [76] i imunobojenje (imunohistohemija, imunofluorescencija, hvatanje imunomagnetnog antigena i bojenje imunoperoksidazom [77]) za koje su potrebna primarna antitijela specifična za serovar (izolovano ili u kombinaciji).

Tabela 1. Laboratorijski testovi za dijagnozu leptospiroze.

LAMP, izotermno pojačanje posredovano petljom; PCR, lančana reakcija polimeraze; NGS, sekvenciranje nove generacije; IHA, indirektna hemaglutinacija; ELISA, enzimski imunosorbentni test; IgM, imunoglobulin M; MAT, makroskopski test aglutinacije; MCAT, test aglutinacije mikrokapsula; DNK, deoksiribonukleinska kiselina; DFM, mikroskopija tamnog polja

Paralelno, kultura Leptospira iz krvi, urina, cerebrospinalne tečnosti i biopsijskog tkiva moguća je tokom prvih nekoliko dana do 10 dana nakon pojave simptoma bolesti (stadijum leptospiroze). Budući da sporo rastu (vrijeme udvostručenja 6-8 sati), izbirljivi i skloni kontaminaciji, uzorci kulture moraju se čuvati najmanje 3-4 mjeseca prije nego što se odbace kao negativni) sa samo 23% osjetljivosti, ali je neophodno za test osetljivosti na lekove [6]. Kao takav, EMJH (Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris) medij (kompleks oleinskog albumina) sastoji se od goveđeg serumskog albumina (frakcija V), Tween 80, amonijum hlorida tiamina, monokalijum fosfata, dinatrijum fosfata i raznih nutrijenata [78] obično se koristi, dok je za neke serovare potreban specijaliziraniji medij T80/40/LH (polisorbat 40, laktalbumin hidrolizat, superoksid dismutaza i zečji serum) [79]. Čini se da je Hornsby–Alt–Nally (HAN) dobar medij za primarnu izolaciju velikog i raznolikog spektra izbirljivih patogenih leptospira [80].

Detekcija leptospiralnih antigena imunoperoksidazom, imunofluorescencijom ili imunomagnetnim sistemom za hvatanje antigena razvijena je za uzorke sa niskim bakterijskim opterećenjem ili se mikroskopija u tamnom polju ne može koristiti, ali se ne provodi rutinski zbog ograničenja na primarnom antitelu [77]. Nasuprot tome, prepoznavanje nukleinske kiseline sa novom amplifikacijama DNK; lančana reakcija polimeraze (PCR) (tj. nested-PCR, kvantitativni PCR [qPCR]), izotermalna amplifikacija posredovana petljom (LAMP) i sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) su vrijedne za ranu i tačnu laboratorijsku dijagnozu, posebno kod Izolacija leptospire primenom inokulacije biološke podloge i DNK hibridizacije (DNK sonda) [81,82]. Različiti leptospiralni ciljevi (kao što je 16S ribosomalna RNA) ili DNK mogu se pojačati za dijagnozu [83], a PCR u realnom vremenu (RT-PCR) je osjetljiviji i specifičniji od standardnog PCR-a [84]. Budući da se neki RT-PCR prajmeri mogu vezati za nespecifično mjesto, što dovodi do lažno pozitivnih rezultata, najnoviji multipleks PCR testovi u realnom vremenu razvijeni su korištenjem dva seta prajmera [85]. Nested PCR također pomaže u otkrivanju specifičnijih i osjetljivijih DNK mjesta s dodatnim setovima prajmera [86,87]. Međutim, trenutni trendovi za dijagnozu leptospiroze su upotreba i seroloških i molekularnih tehnika, kao što su PCR i ELISA (lakše od zlatnog standarda serološke MAT), za zemlje sa ograničenim resursima [88,89]. Dodatno, LAMP tehnika [90] za otkrivanje 16S rRNA gena (rrs) je isplativa, brza i visokoprinosna za detekciju patogenih leptospira u urinu. Trenutno je NGS najpreciznije zasnovana metoda neovisna o kulturi na analizi jezgra genoma u tjelesnim tekućinama (krvi i urinu) [91] i budući smjer testova na leptospirozu bi bio da se krene prema molekularnoj klasifikaciji leptospira, koja prevazilazi ograničenje izolacija kulture leptospira iz kliničkih uzoraka. Stoga je vrijednost PCR-a u kliničkoj dijagnozi leptospiroze posebno dobra i pojavljuje se nekoliko modernih tehnika.

6.2.2. Detekcija anti-leptospira antitela

Koristi se nekoliko seroloških dijagnoza; na primjer, testovi specifičnih za rod (indirektna hemaglutinacija [IHA], enzimski imunosorbentni test [ELISA], Lepto Dri Dot [lateks aglutinacija], aglutinacija mikrokapsula [MCAT]) i testovi specifičnih za serovar antitijela (mikroskopski test aglutinacije MAT]) [92,93]. Kao takvi, MAT kriteriji za dijagnozu su (i) četverostruki porast titra u parnim serumima (serokonverzija trenutne infekcije) ili (ii) jedan visoki titar (veći ili jednak 1:400 ili 1:800, veći u epidemiji područja) (seropozitivnost) (antitijela mogu postojati neko vrijeme nakon infekcije ili unakrsne reakcije s drugim bolestima). Dodatno, MAT zahtijeva živi panel svih Leptospira serovara u regiji, sa panelom lokalno standardiziranih serovara [93,94] prema Svjetskoj organizaciji za zdravlje životinja (19 antigena predstavnika 15 serogrupa) [95]. Budući da se antitijela mogu otkriti 5-7 dana nakon infekcije, MAT test može biti negativan (titar < 1:50) tokom prvih nekoliko dana infekcije. Dijagnoza leptospiroze može se izvesti uzorcima urina [96] koristeći i serologiju i molekularnu detekciju (16S rRNA), posebno kod pacijenata sa nedavnom infekcijom (MAT veći ili jednak 1:800 ili ELISA IgM-pozitivan ili oboje) [97] .

Uz ograničene resurse, rezultat kliničkog predviđanja [98] zasnovan na relevantnoj kliničkoj anamnezi i povezanim laboratorijskim testovima sa bodovanjem u sedam aspekata je sljedeći: hipotenzija (3), žutica (2), bol u mišićima (2), AKI (1,5) , predlaže se nizak hemoglobin (3), hipokalemija sa hiponatremijom (3) i neutrofilija (1) (granični sumirani rezultat od 4 ima površinu ispod krive operativne karakteristike prijemnika {{10}}.78 ( 95% CI 0.68–0,89) za dijagnozu leptospiroze [77]). Ovaj rezultat vjerovatnoće tajlandskog leptospiroze mogao bi biti dijagnostički alat za ranu pretpostavljenu dijagnozu leptospiroze kod pacijenata koji imaju ozbiljnu kliničku sumnju na bolest.