R. Vesicarius L. Ispoljava nefroprotektivni učinak protiv oksidativnog stresa izazvanog cisplatinom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Mahmudul Hasan¹, Most. Sayla Tasmin², Ahmed M. El-Shehawi³, Mona M. Elseehy⁴, dr Abu Reza¹i Ariful Haque^2*

Abstract

Pozadina:Cisplatin je izvanredan lijek protiv raka, ali njegova upotreba je značajno smanjena zbog teške nefrotoksičnosti. R. vicarious L. je lisnato povrće koje je evidentno sa antiangiogenim, antiinflamatornim, antiproliferativnim, hepatoprotektivnim i nefroprotektivnim potencijalom. Stoga je ova studija osmišljena da ispita njegov metanolni ekstrakt (RVE) radi mogućeg nefroprotektivnog efekta.

Metode:Prvenstveno, in vitro, antioksidativna aktivnost RVE je potvrđena na osnovu 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) sposobnosti uklanjanja slobodnih radikala. Nakon toga, mužjaci švicarskih albino miševa su tretirani cisplatinom (2,5 mg/kg) 5 uzastopnih dana da bi se izazvala nefrotoksičnost. Oporavak od nefrotoksičnosti je ispitan tretiranjem životinja sa RVE (25, 50 i 100 mg/kg) intraperitonealno (ip) u narednih 5 uzastopnih dana. Nakon završetka tretmana, miševi su žrtvovani i bubrezi su sakupljeni. Dio je homogeniziran u natrijum fosfatnom puferu za procjenu nivoa malondialdehida (MDA), drugi dio je korišten za procjenu ekspresije gena (NQO1, p53 i Bcl-2). Štaviše, sposobnost neutralizacije vodonik peroksida (H2O2) RVE je procijenjena u HK-2 ćelijama in vitro. Konačno, bioaktivne fitokemikalije u RVE su određene pomoću gasne hromatografije-masene spektrometrije (GC-MS).

Rezultati:RVE je pokazao in vitro antioksidativnu aktivnost u zavisnosti od doze sa 37,39 ± 1,89 ug/mL IC50 vrijednosti.

Tretman RVE je značajno (p < {{0}}.05)="" smanjio="" sadržaj="" mda="" u="" tkivu="" bubrega.="" osim="" toga,="" ekspresija="" gena="" nqo,="" p53="" i="" bcl-2="" je="" značajno="" smanjena="" (p="">< 0,05)="" na="" dozno="" zavisan="" način="" zbog="" primjene="" rve.="" rve="" je="" značajno="" (p="">< 0,05)="" preokrenuo="" nivo="" h2o2="" u="" hk-2="" ćelijama="" na="" skoro="" normalan.="" iz="" gc-ms,="" deset="" jedinjenja="" uključujući="" tri="" poznata="" antioksidansa="" "4h-piran-4-jedan,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil-"="" detektovani="" su="" "heksadekanska="" kiselina"="" i="" "skvalen".="" ekstrakt="" je="" bio="" bogat="" alkaloidom="">

zaključak:Sve u svemu, RVE ima zaštitni efekat protiv oštećenja bubrega izazvanog cisplatinom.

Ključne riječi:Cisplatin, R. vicarious, Miševi, Bubrezi, HK-2 ćelije, Oksidativni stres, NQO1 gen

Cistanche deserticola sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Uvod

Oksidativni stres je rezultat disproporcije između formiranja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) i regularnih antioksidativnih odbrambenih mehanizama [1]. Redovne biohemijske reakcije, česta izloženost nepovoljnom okruženju i povećan unos ksenobiotika dovode do proizvodnje ROS [1]. ROS stupa u interakciju sa cisteinskim ostacima signalnih molekula osjetljivih na redoks, uključujući transkripcione faktore, proteinske tirozin fosfataze i protein kinaze; posljedično, oksidacija tiolnih grupa na ovim ostacima vodi do promjena ciljanih proteina, bioloških djelovanja, signalnih kapaciteta, imuniteta i dodatnih paradigmi živih/mrtvih stanica [2]. Hemijske vrste koje sadrže kisik i imaju reaktivna svojstva poznate su kao ROS, što uključuje slobodne radikale i neradikalne molekule kao što su superoksid i H2O2, respektivno [3]. Oksidativni stres izazvan ROS-om povezan je s etiologijom brojnih bolesti uključujući rak. Akutna mijeloična leukemija (AML) je kancerozni rast krvnih stanica unutar koštane srži. Ćelijski i molekularni događaji u osnovi AML-a uključuju oštećenje DNK, klonsko razmnožavanje, povećanu ćelijsku smrt i dalju genetsku nestabilnost, koji su rezultat oksidativnog stresa izazvanog ROS [4]. Ljudska fiziologija je obdarena brojnim mehanizmima koji mogu generirati antioksidante za zaštitu od oksidativnog stresa, što dovodi do zaštite stanica od toksičnih učinaka i služi prevenciji bolesti [5]. Međutim, ćelije razvijaju endogene mehanizme za suprotstavljanje oksidativnom stresu i očuvanje potrebnih ROS [6].

NAD(P)H: kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1) je flavoenzim [7] koji može katalizirati redukciju dva ili četiri elektrona i koristi ovo svojstvo za detoksikaciju kinina [8]. Može zaštititi stanice od oksidativnog oštećenja zadržavanjem redoks ciklusa po strani i smanjenjem proizvodnje slobodnih radikala [8]. Osim ksenobiotske detoksikacije, NQO1 je također uključen u neutralizaciju superoksida, modulaciju proteazomske degradacije p53 [9], inhibiciju Bcl-2 [10] i povećanu osjetljivost na ozljede stanica [11].

Cisplatin je prvi lijek protiv raka na bazi platine koji je odobrila Uprava za hranu i lijekove (FDA) [12]. Cisplatin vrši apoptozu indukcijom oksidativnog stresa i prekomjernom ekspresijom tumor supresorskog gena p53 [12]. Nekoliko štetnih efekata uključujući nefrotoksičnost, hepatotoksičnost, gastrotoksičnost, ototoksičnost, mijelosupresiju i neurotoksičnost rezultat su oksidativnog stresa izazvanog cisplatinom [12]. Ove nuspojave su značajno smanjile upotrebu cisplatina iako ima izvanredno djelovanje protiv raka. Poznato je da cisplatin indukuje oksidativni stres i potiskuje gen NQO1 u bubrezima miševa [13]. Stoga traženje i validacija efikasnih prirodnih izvora antioksidanata postaje područje svijesti. Unošenje dijetetskih antioksidansa biljnog porijekla kao što su flavonoidi, karotenoidi i fenolna jedinjenja može dovesti do zaštite od kardiovaskularnih bolesti, katarakte i raka [14].

R. vicarious (Polygonaceae) je poznat kao "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" na bengalskom [15]. Raste u pustinjskim i polupustinjskim područjima Azije, Australije i Sjeverne Afrike [16]. To je malo proučavana ugrožena biljka u Bangladešu. U Bangladešu ljudi konzumiraju cijelu biljku kao povrće nakon kuhanja sa solju, različitim začinima i uljem. Ponekad ljudi koriste samo svježe listove u miješanoj salati kao alternativu zelenoj salati. Sirovi list je blago kiselkast, ali nakon kuvanja postaje jako kisel. Štaviše, mali broj listova se obično meša u riblja jela tokom kuvanja da bi imali blago kiselkast ukus.

Ova biljka se koristi kao povrće i ljekovito bilje širom svijeta [17]. Listovi i sjemenke se koriste kao protuotrov za otrov zmije i škorpiona [17]. U narodnom liječenju, R. vicarious se od davnina koristi u liječenju bolesti jetre, loše probave, zatvora, hematoma, povraćanja, nadimanja, srčanih tegoba, bolova, poremećaja slezine, dispepsije, zubobolje, bronhitisa, astme, šuge, leukoderme i kao laksativ, želudac, predjelo, tonik, diuretik i analgetik [18]. Ova biljka sadrži brojne biološki važne spojeve uključujući flavonoide, antrakinone, karotenoide, vitamine, lipide i organske kiseline, koji su dobro poznati kao antioksidansi, antimikrobni i antikancerogeni agensi [19]. Svaki dio ove biljke sadrži kvercetin (flavonoide) u povišenoj količini [15]. Ova biljka sadrži 0,25 mg vitamina A, 1,33 mg vitamina C, 2,37 mg vitamina E [15], 3,38 mg flavonoida i 5,66 mg polifenola [20] na 100 g suhe težine.

Shahat i kolege [21] su pokazali anti-angiogene i antiproliferativne efekte metanolnog (80 posto) ekstrakta nadzemnog dijela R. vicarious protiv hepatocelularnog karcinoma na modelu štakora. Druga studija je pokazala in vitro antiangiogeni potencijal ekstrakta R. vicarious [22]. Ekstrakt metanola cijele R. vicarious štiti od hepatotoksičnosti izazvane tetrakloridom ugljika in vivo [23]. Protuupalni učinak kod kunića je evidentan metanolnim ekstraktom lista R. vicarious [24]. Nedavna studija [25] prijavila je in vivo nefroprotektivni efekat frakcionisanog etanolnog ekstrakta R. vicarious protiv toksičnosti gentamicina i kalijum dihromata.

Imajući u vidu gornje informacije, imali smo za cilj da ispitamo efekat ekstrakta R. vicarious (RVE) u smislu oporavka od nefrotoksičnosti izazvane cisplatinom kroz održavanje ekspresije gena NQO1 u životinjskom modelu.

cistanche zdravstvene prednosti: liječenje bolesti bubrega

materijali i metode

Hemikalije i reagensi

Cisplatin i 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) su kupljeni od SIGMA-ALDRICH (SAD).

Komplet za kolorimetrijsku analizu kreatinina (ID proizvoda – 700,460) kupljen je od Cayman Chemical (SAD). Dulbeccov modificirani orlov medij (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS) i antibiotik (10,000 U/mL penicilina i 10,000 ug/mL streptomicina) kupljeni su od Gibco-a (Gibco Laboratories, SAD). ROS-Glo™ H2O2 komplet za analizu i GoTaq® qPCR Master Mix nabavljeni su od Promega (SAD). Komplet za reverznu transkripciju TIAN-Script M-MLV je kupljen od TIANGEN-a (Kina), a prajmeri od IDT-a (Integrated DNA Technologies, Malezija). Sve ostale hemikalije i reagensi korišćeni u ovom eksperimentu bili su analitičke čistoće.

Sakupljanje biljnih uzoraka i priprema ekstrakta

Svježe biljke R. vicarious kupljene su na lokalnom tržištu u Sonadighi, Rajshahi, Bangladeš. Biljni primjerak je identificirao i potvrdio Dr. Ahmad Humayan Kabir, Odsjek za botaniku, Univerzitet Rajshahi, Bangladeš. Primjerak pod vaučerom br. 00095 je pohranjen u herbarijumu Odsjeka za botaniku Univerziteta Rajshahi. Nadzemni dijelovi biljke su očišćeni, sušeni na 37 stepeni, mljeveni u krupni prah pomoću elektronske sušare i pohranjeni u zatvorenoj posudi na 4 stepena. Fini prah (10 g) je otopljen u metanolu (500 mL). Sadržaj je sonikiran (Soni-prep 150, Kina) na 20 kHz tokom 10 minuta. Filtracija ekstrakta je izvršena korištenjem filter papira od staklenih vlakana (Macherey NAGEL, GmBH, njemački) sa DURAN Filtering Apparatus (njemački). Konačno, filtrat je koncentriran upotrebom sušača smrzavanjem (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, SAD). Ekstrakt je konačno dobio naziv RVE.

In vitro test antioksidativne aktivnosti

In-vitro antioksidativni kapacitet RVE izveden je na osnovu uklanjanja DPPH kao što je prethodno opisano [26] uz male modifikacije. Sposobnost RVE uklanjanja radikala DPPH procijenjena je na osnovu pretvaranja ljubičaste boje DPPH u žutu boju. Reakciona smjesa u svakoj mikrocentrifugalnoj epruveti (2 mL) sastojala se od 950 μL metanolnog rastvora DPPH radikala (0,1 mM) i 50 μL RVE iz pet različitih koncentracija (200, 500, 1000, 2000 i 4000 ug /mL metanola) za postizanje konačnih koncentracija od 10, 25, 50, 100 i 200 ug/mL. Druga epruveta sa 50 μL metanola i 950 μL metanolnog rastvora DPPH je zadržana kao kontrola. Epruvete su ostavljene 30 minuta na tamnom mjestu. Apsorbancija smeša je uzeta na 517 nm korišćenjem GENESYS 10S UV-VIS spektrofotometra (Thermo SCIENTIFIC, SAD). Konačno, postotak aktivnosti uklanjanja radikala (RSA) izračunat je na osnovu promjene boje DPPH koristeći sljedeću formulu procenat RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADDPH] × 100 gdje je ADPPH apsorbancija otopine DPPH (kontrola) i ARVE je apsorpcija otopine RVE. Koncentracija pri kojoj je RVE rezultirala sa 50 posto RSA nazvana je IC50 vrijednošću i izračunata je korištenjem grafikona postavljanja postotaka RSA u odnosu na različite korištene koncentracije RVE.

Eksperimentalne životinje i eksperimentalni dizajn

Mužjaci švicarskih albino miševa starosti 42 dana (30-32 g tjelesne težine) aklimatizirani su 1 sedmicu prije početka eksperimenta u prostoriji (temperatura od oko 25 ± 2 stepena i ~ 50 posto vlažnosti, 12 h ciklus tamno/svjetlo). Voda za piće i hrana su davani ad libitum.

Miševi su nasumično podijeljeni u osam grupa (n {{0}}). Prva (kontrolna) grupa je tretirana sa 0.2 mL 0,9 posto NaCl. Sljedeće četiri grupe su tretirane cisplatinom u dozi od 2,5 mg/kg tokom 5 dana u intervalu od 24 h. Nakon davanja cisplatina, jedna grupa (druga grupa) je ostavljena bez daljeg tretmana i dodijeljena je kao kontrolna grupa pod stresom. Treća, četvrta i peta grupa su dalje tretirane RVE u dozama od 25, 50 i 100 mg/kg tokom 5 dana. Dalje tri grupe su tretirane RVE samo u dozama od 25, 50 i 100 mg/kg, respektivno, tokom 5 dana. Cisplatin i RVE su rastvoreni u destilovanoj vodi. Svi tretmani su davani intraperitonealno. Nakon 24 h posljednjeg tretmana, životinje su eutanazirane nakon cervikalne dislokacije [25]. Zatim je peritoneum otvoren makazama, krv je uzeta nakon punkcije srca, a bubrezi su uzeti pincetom. Krv je podvrgnuta provjeri nivoa kreatinina u serumu. Bubrezi su podvrgnuti procjeni nivoa malondialdehida i ekspresije gena.

Mjerenje kreatinina u serumu

Kreatinin u serumu je mjeren pomoću Creatinine Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, SAD) prema protokolu proizvođača koji je priložen uz komplet.

Mjerenje renalne peroksidacije lipida

Malondialdehid (MDA) je krajnji proizvod peroksidacije lipida u tkivu bubrega i obično se mjeri kao indikator proizvodnje ROS. Međutim, nivo MDA je meren u bubrežnom tkivu prema prethodnoj studiji [27]. U početku je bubrežno tkivo homogenizovano u natrijum-fosfatnom puferu (0.1 M, pH 7,4). Reakciona otopina koja sadrži 0,8 posto tiobarbiturne kiseline (1,5 mL), 8,1 posto SDS (200 μL), 20 posto (pH 3,5) octene kiseline (1,5 mL) i dH2O (600 μL) dodana je u 100 μL homogenizovanog tkiva, a smeša je zatim inkubirana na 95 stepeni 1 h. Nakon hlađenja, smjese su centrifugirane na 10,000 g 10 minuta na 4 stepena, a apsorbancija supernatanta je mjerena na 532 nm sa standardnim 1, 1, 3, 3- tetra metoksi propanom. Količina ukupnog proteina je mjerena korištenjem Bradford Protein Assay kita (BIO-RAD, SAD) i poređenjem sa standardnim goveđim serumskim albuminom (BSA). Intenzitet lipidnih peroksida je izražen kao nanomol (nM) MDA po miligramu (mg) proteina.

Lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (PCR u realnom vremenu)

PCR u realnom vremenu je izveden kao što je prethodno opisano [28, 29]. Ukupna RNK iz bubrežnog tkiva je izolirana korištenjem TRIzol® reagensa (Invitrogen) prema protokolu koji je dostavio proizvođač. Izolovana RNK (1 ug) je zatim pretvorena u cDNK. Prvo je uzeto 2 μL slučajnog heksamera (10 μM), 2 μL dNTPs (10 mM), 1 ug RNA i HO bez nukleaza do 15 μL i inkubirano 5 minuta na 70 stepeni. Smjesa je odmah stavljena na led na 2 min. Zatim je u svaku epruvetu dodano 4 μL pufera za 1. lanac (5x) i 1 μL M-MLV reverzne transkriptaze i inkubirano 10 minuta i 50

min na 25 stepeni i 42 stepena, respektivno. Konačno, enzim M-MLV reverzne transkriptaze je inaktiviran inkubacijom smjese na 95 stepeni u trajanju od 5 minuta. Sintetizirani proizvodi cDNK podvrgnuti su PCR-u u realnom vremenu za kvantifikaciju ekspresije NQO1, p53 i Bcl{9}} gena korištenjem specifičnih prajmera (Tabela 1). Svaka reakcija (10 μL) izvedena je u tri primjerka koja se sastoji od 5 μL GoTaq qPCR Master Mixa (2x) (Promega, SAD), 0,5 μL (10 mM) svakog prajmera, 3 μL vode bez nukleaze i 1 μL cDNK u 48-reakcionim pločama bunara. Termički ciklus je izveden pomoću PCR mašine u realnom vremenu (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, SAD) sa sledećim uslovima ciklusa: 95 stepeni u trajanju od 10 minuta, nakon čega sledi 40 ciklusa od 95 stepeni u trajanju od 30 s, 50 stepeni za 30 s, i 72 stepena za 25 s. Specifičnost PCR reakcija je potvrđena analizom krivulje topljenja na 95 stepeni tokom 15 s, 45 stepeni tokom 15 s i 95 stepeni tokom 15 s. Specifičnost PCR reakcija je potvrđena analizom krivulje topljenja na 95 stepeni tokom 15 s, 45 stepeni tokom 15 s i 95 stepeni tokom 15 s. Relativna kvantifikacija ekspresije gena izvršena je korišćenjem endogenog GAPDH gena kao kontrole na osnovu ΔΔCq metode.

Ćelijska kultura i tretman

Epitelna ćelijska linija ljudskih proksimalnih tubula, HK-2 ćelije, održavane su u DMEM-u dopunjenom 10 posto FBS i antibioticima (50 U/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina) u inkubatoru sa 5 posto CO2 i 95 procenat vlažnosti na 37 stepeni.

Test mjerenja H2O2

Nivo H2O2 u ćelijama HK-2 procijenjen je korištenjem kompleta za analizu ROS-Glo™ H2O2 (Promega, SAD) prema protokolu koji je obezbijedio proizvođač kompleta. HK-2 ćelije (1000 ćelija) u 70 μL DMEM stavljene su u jažice mikrotitarske ploče 96-jažice. Nakon što je omogućeno pričvršćivanje ćelija na površinu zida, 10 μL DMEM iz jažica mikrotitarske ploče zamijenjeno je sa 10 μL cisplatina (25 μM u DMEM) i držano u inkubatoru 12 h. Zatim je dodano 10 μL RVE da bi se dobile konačne koncentracije 125, 250 i 500 ug/mL u DMEM i inkubirano narednih 12 sati. Nakon toga, 20 μL H2O2 rastvora supstrata i 100 μL ROS-Glo™ rastvora za detekciju je dodato u svaku jažicu. Reakcija je inkubirana na sobnoj temperaturi 20 min. Konačno, luminiscencija je mjerena korištenjem GloMax luminometra (Promega, SAD).

GC-MS analiza

GC-MS analiza RVE (otopljenog u metanolu) izvedena je kao što je prethodno opisano [30] korištenjem GCMS-QP2020 (SHIMADZU) koji se sastoji od automatskog uzorkovača (AOC{ {5}}s), auto-injektor (AOC-20i) i plinski hromatograf (GC-2010 Plus) povezani sa masenim spektrometrom opremljenim SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Sil MS kapilarna kolona (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Gas nosač helijum je održavan pri konstantnoj brzini protoka od 1,72 mL/min, a zapremina injekcije od 5 μL je bila podvrgnuta omjeru podjele 10:1. Temperatura injektora je održavana na 220 stepeni, temperatura izvora jona je bila 280 stepeni, temperatura pećnice je programirana od 80 stepeni (držati 2 min), uz povećanje od 5 stepeni/min do 150 stepeni (vreme držanja 5.0 min), zatim 5 stepeni/min do 280 stepeni, završavajući sa izotermnim od 8 minuta na 280 stepeni. Maseni spektri su uzeti na 1,5 kV sa intervalom skeniranja od 0,5 s, a uzorak je rađen u rasponu od 45–350 m/z. Kašnjenje rastvarača je bilo od 0 do 3 min, a ukupno vreme rada GC-MS je 55 min. Relativna koncentracija detektovanih jedinjenja merena je poređenjem prosečne površine vrha sa ukupnom površinom. Interpretacija masenog spektra u GC-MS izvršena je korištenjem baza podataka Nacionalnog instituta za standard i tehnologiju (NIST), uključujući NIST08, NIST08s i NIST14.

Statistička analiza

Statističke analize su obavljene ANOVA-om nakon Dunnettovog T3 testa korištenjem IBM SPPS (verzija 20) softvera. Podaci su artikulirani kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Značajno poređenje je razmatrano na str<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">

Rezultati

In vitro test antioksidativne aktivnosti

Iako je ranije prijavljeno da RVE ima antioksidativnu aktivnost, ponovo smo provjerili antioksidativnu aktivnost našeg ekstrakta koristeći kapacitet uklanjanja slobodnih radikala DPPH. RVE neutralizira DPPH ovisno o dozi (slika 1). RVE je pokazao značajnu in vitro antioksidativnu aktivnost i izračunata IC50 vrijednost RVE je bila 37,39 ± 1,89 ug/mL.

Mjerenje kreatinina u serumu

Nivo kreatinina u serumu kod miševa je značajno povećan (p < {{0}}}.05)="" nakon="" primjene="" cisplatina="" (tabela="" 2).="" tretman="" sa="" rve="" značajno="" je="" (p="">< 0,05)="" poboljšao="" nivo="" kreatinina="" u="" zavisnosti="" od="" doze="" (tabela="">

Mjerenje renalne peroksidacije lipida

U poređenju sa kontrolom, cisplatin je značajno (p < {{0}}}.05)="" povećao="" sadržaj="" mda="" u="" bubrežnom="" tkivu="" miševa="" (tabela="" 3).="" nasuprot="" tome,="" tretman="" rve="" značajno="" je="" (p="">< 0,05)="" vratio="" mda="" na="" gotovo="" normalan="" način="" na="" način="" koji="" ovisi="" o="" dozi="" (tablica="">

PCR u realnom vremenu

Cisplatin je značajno (p < {{0}}.05)="" smanjio="" ekspresiju="" nqo1="" mrna="" za="" 0.15-put="" i="" povećao="" p53="" i="" bcl-2="" mrna="" izraz="" za="" 24="" i="" 4.2-="" puta,="" respektivno="" (slika="" 2).="" rve="" je="" značajno="" (p="">< 0.05)="" ublažio="" ekspresiju="" nqo1,="" p53="" i="" bcl-2="" mrna="" na="" način="" zavisan="" od="" doze="" (slika="" 2).="" u="" poređenju="" sa="" jedinom="" grupom="" tretiranom="" cisplatinom,="" ekspresija="" nqo1="" mrna="" je="" povećana="" za="" 3,57,="" 6,36="" i="" 9.28-puta="" za="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respektivno="" (slika="" 2a).="" opet,="" ekspresija="" mrna="" p53="" je="" smanjena="" za="" 0.63,="" 0.46="" i="" 0.21-="" puta="" na="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respektivno="" (slika="" 2b).="" ekspresija="" bcl-2="" mrna="" je="" također="" smanjena="" za="" 0,71,="" 0,40="" i="" 0.32-="" puta="" na="" 25,="" 50="" i="" 100="" mg/kg="" rve,="" respektivno="" (slika="" 2c).="" ali,="" nisu="" nađene="" značajne="" (p=""> 0,05) promjene u nivou ekspresije NQO1, p53 i Bcl-2 gena zbog tretmana sa RVE (slika 3).

H₂O₂mjerni test

U testu mjerenja H2O2, H₂O₂nivo se smatra proporcionalnim luminiscenciji. Primjena cisplatina značajno (p < {{0}}.05)="" je="" povećala="" nivo="" h2o2="" za="" 2.2-="" puta="" (slika="" 4).="" tretman="" rve="" je="" značajno="" smanjio="" (p="">< 0.05)="" nivo="" h2o2="" za="" 0,25,="" 0,38="" i="" 0.49-put="" na="" 125,="" 250="" i="" 500="" ug/ml,="">

GC-MS analiza

Ukupno 10 jedinjenja (Tabela 4 i Slika 5) uključujući "Izoborneol, pentametildisilanil etar (seskviterpenski alkohol)", "Timin (pirimidin nukleobaza)", "4H-Piran-4-jedan, 2,{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil- (saponin)", "Heksadekanska kiselina, metil ester (metil ester masnih kiselina)", "9,12- Oktadekadienska kiselina, metil ester (metil ester masne kiseline)", "9- Oktadecenska kiselina (Z)-, metil ester (metil ester masne kiseline)", "Metil stearat (metil ester masne kiseline)", "Diizooktil ftalat (ester)", "13-Docosenamid, (Z)- (alkaloid)" i "Squalene (tri-terpene)" su otkriveni u RVE.

prednosti cistanche tubolosa: snižavanje lipida u krvi

Diskusija

Prirodni i sintetički antioksidansi su sveobuhvatno proučavani i otkriveno je da su funkcionalni za prevenciju ili ublažavanje toksičnosti u fiziologiji životinja [31]. Antioksidativni suplementi su komponenta razvijena ili hemijskom sintezom ili ekstrakcijom iz prirodne hrane, ali oni po sastavu nisu identični kao antioksidansi dostupni u hrani [5]. Stoga su mišljenja s vremenom razdvojena da li sintetički antioksidansi daju slične zdravstvene prednosti kao prirodni antioksidansi [32]. Pojavljuje se poriv da se smanji upotreba sintetičkih antioksidansa i traže alternativni, jeftini, obnovljivi, prirodni i možda sigurniji izvori efikasnih prirodnih antioksidansa.

Jedan od najvažnijih mehanizama je put povezan s nuklearnim faktorom eritroid-2 faktorom-2 (Nrf2) koji općenito štiti stanice od oksidativnog stresa izazvanog egzogenim ili endogenim stresorima [27]. Efikasni antioksidansi indukuju ekspresiju Nrf2, koji se dalje kreće u jezgro i vezuje se za element antioksidativnog odgovora (ARE) koji provocira ekspresiju faze II detoksikacije i antioksidativnog gena NQO1 [33, 34]. NQO1 je široko i različito izražen na tkivno specifičan način. NQO1 je citosolni antioksidativni flavoprotein koji katalizuje 2- redukciju elektrona kinona u hidrokinone, što rezultira detoksikacijom elektrofila i predviđanjem redoks ciklusa [35]. Prema prethodnoj studiji [36], -lapachone aktivira NQO1, koji dalje povećava intracelularni NAD plus nivo i štiti bubreg od akutne povrede izazvane cisplatinom.

Poznato je da cisplatin izaziva oštećenje membrane glomerularne filtracije kroz oksidativni stres, upalu i apoptozu, što sve zajedno dovodi do smanjene brzine glomerularne filtracije i gubitka normalne propusnosti membrane [37]. Zbog toga je povećan nivo serumskog kreatinina. Serumski kreatinin je jedan od potencijalnih markera bubrežne funkcije. Liječenje cisplatinom povećalo je sadržaj MDA u tkivu bubrega koji je sekundarni proizvod peroksidacije lipida i ovaj izvještaj je konstantan s prethodnim studijama [27, 35, 37, 38]. Tretman RVE značajno je smanjio sadržaj MDA u tkivu bubrega. Istovremeno, nivo kreatinina je takođe smanjen, što ukazuje na meliorativni efekat RVE.

Osim toga, ekspresija NQO1 je značajno smanjena, a ekspresija p53 i Bcl-2 značajno povećana nakon izlaganja cisplatinu. U smislu ekspresije NQO1 i p53 in vivo, naš rezultat je u skladu sa prethodnom studijom [13]. Nedavna studija [39] je pokazala da cisplatin značajno smanjuje ekspresiju Bcl-2 u bubrezima miševa, ali iznenađujuće smo pronašli povišenu ekspresiju. Ova razlika može biti rezultat razlike u dozi [40] jer su Mohamed i kolege [39] koristili 8 mg/kg tokom 12 dana, dok smo mi koristili 2,5 mg/kg samo 5 dana. Druga studija [41] navodi da cisplatin može povećati ekspresiju Bcl-2 u dozi kada nije citotoksičan. Opet, povećana ekspresija Bcl-2 senzibilizira ćelije prema oksidativnom stresu [40].

Međutim, ekspresija p53 je niska u normalnim fiziološkim uvjetima, ali se očekuje da će se pojačati nakon liječenja cisplatinom jer ovaj hemoterapeutski agens na bazi platine aktivira apoptotički put ovisan o p53. Nakon što smo tretirali miševe cisplatinom, p53 je značajno povećan u bubrezima miševa u odnosu na kontrolu. Drugi proto-onkogen Bcl-2 je takođe povezan sa nivoom ekspresije NQO1. Oponašajući ekspresiju p53, takođe smo otkrili da su nivoi Bcl- 2 povećani tretmanom cisplatinom, ali su ponovo značajno pokriveni nakon tretmana sa RVE. To je moguće, kao odgovor na oksidativni stres, gen p53 se aktivira i rezultira zaustavljanjem ćelijskog ciklusa, starenjem ili apoptozom [6]. Kod detoksikacije se često smatra da je prekomjerna ekspresija NQO1 povezana s apoptozom u stanicama raka [10], iako je osnovni mehanizam apoptoze i prekomjerne ekspresije NQO1 još uvijek kontroverzan. Štaviše, kod hepatocelularnog karcinoma, prekomjerna ekspresija NQO1 smanjuje ekspresiju Bcl-2 [10]. Protoonkogen Bcl- 2 takođe ima p53 kao korelaciju sa ekspresijom NQO1. p53 je faktor transkripcije specifičan za sekvencu koji se aktivira brojnim tipovima ćelijskog stresa [42], dok je prekomjerna ekspresija Bcl-2 djelovala kao stabilizator pora mitohondrija kako bi se olakšalo oslobađanje citokroma-c nakon oksidativnog stresa [12]. U našem slučaju, provjerili smo oba genska odgovora liječenjem cisplatinom u normalnom bubrežnom tkivu i otkrili njihovu povećanu ekspresiju. Liječenje RVE je vratilo ekspresiju p53 i Bcl-2 na skoro normalnu na način koji ovisi o dozi. Ova vrsta ukidanja Bcl-2 izraza je također prikazana korištenjem ROS čistača Trolox [43]. Štaviše, nivo H2O2 je takođe značajno povećan u HK-2 ćelijama zbog tretmana cisplatinom in vitro. Nakon tretmana sa RVE, nivo H2O2 je značajno vraćen na normalu. Ovo je možda zbog efekta RVE tretmana koji je povećao ekspresiju NQO1 [44], koji pruža zaštitu od oksidativnog stresa [6].

GC-MS hromatogram je potvrdio postojanje deset jedinjenja u RVE. Među njima, "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil-", "heksadekanska kiselina" i " Skvalen" su dobro poznati antioksidansi[45–47]. Ova tri jedinjenja zajedno su verovatno imala sinergistički nefroprotektivni efekat. Prethodne studije su takođe izvestile o indukciji ekspresije NQO1 vitaminom A [48], vitaminom C [49], vitaminom E [50], flavonoidima [51] i polifenolima [50]. Stoga, ovaj izvještaj predlaže da se razjasni da li ovaj konkretni ekstrakt sadrži nešto između vitamina A, vitamina C, vitamina E, flavonoida i polifenola ili ne.

Zaključak

Ukupni nalaz sugerira da je RVE fiziološki efikasan u zaštiti bubrega od oštećenja izazvanih cisplatinom. Stoga je ključno razjasniti tačna jedinjenja odgovorna za ublažavanje nefrotoksičnosti izazvane cisplatinom koja može postati korisna za primjenu kod ljudi.

ekstrakt cistanche tubolosa

Priznanja

Autori su zahvalni Bangladeškom vijeću za naučna i industrijska istraživanja (BCSIR), ogranak Rajshahi za pružanje laboratorijske podrške za kvantifikaciju RNK.

Doprinosi autora

MMH je izvršio eksperimentalni dizajn, eksperimentisanje, analizu i pripremu podataka, pisanje i uređivanje rukopisa, reviziju i izradu rukopisa; MST & MME uradili eksperimentisanje i analizu podataka; AME & MAR su doprinijeli nadzoru i resursima; AH je bio odgovoran za konceptualizaciju, nadzor, resurse i uređivanje rukopisa. Svi autori

pregledao rukopis. Autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.

Finansiranje

Trenutni rad je finansiran od strane projekta podrške istraživačima Univerziteta Taif (TURSP - 2020/75), Univerzitet Taif, Taif, Saudijska Arabija.

Dostupnost podataka i materijala.

Svi relevantni podaci su dostupni i mogu se dati na zahtjev autoru korespondentu.

Deklaracije

Etičko odobrenje i saglasnost za učešće

Etiku za izvođenje ovog eksperimenta odobrio je Komitet za institucionalnu zaštitu životinja, medicinsku etiku, biosigurnost i biosigurnost (IAMEBBC), Institut bioloških nauka (IBSc), Univerzitet Rajshahi, a dostavljen je pod dopisom broj 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Sve metode su rađene prema smjernicama i propisima koje je dao gore spomenuti etički komitet. Ova studija je provedena u skladu sa smjernicama ARRIVE (Animal Research: Reporting of In vivo Experiments). "Pristanak za učešće" nije primjenjiv za ovu studiju.

Autor pojedinosti

1Laboratorija za molekularnu biologiju i nauku o proteinima, Odsjek za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, Fakultet za život i Zemlju, Univerzitet Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladeš. 2 Laboratorija za molekularnu patologiju, Institut bioloških nauka, Univerzitet Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladeš. 3Odjel za biotehnologiju, Fakultet nauke, Univerzitet Taif, poštanski fah 11099, Taif 21944, Saudijska Arabija. 4Odeljenje za genetiku, Poljoprivredni fakultet, Aleksandrijski univerzitet, Aleksandrija 21545, Egipat.

Reference

1. Bagchi K, Puri S. Slobodni radikali i antioksidansi u zdravlju i bolesti: pregled. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.

2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH, et al. Ferulat, aktivna komponenta pšeničnih klica, poboljšava neravnotežu PTK/PTP izazvane oksidativnim stresom i inaktivaciju PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.

3. Hassan AI, Ibrahim RY. Neki genetski profili u jetri Ehrlichovog ascita kod miševa koji nose tumor pod stresom zračenja. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.

4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, et al. Učešće oksidativnog stresa u relapsu akutne mijeloične leukemije. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.

5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Slobodni radikali, antioksidansi u bolestima i zdravlju. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.

6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Uloga NAD (P) H-kinon oksidoreduktaze 1 (NQO1) na progresiju raka i hemorezistenciju. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.

7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: kinon oksidoreduktaza 1 (NQO1) u osjetljivosti i otpornosti na antitumorske kinone. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.

8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: kinon akceptor oksidoreduktaza 1 (NQO1), multifunkcionalni antioksidativni enzim i izuzetno raznovrsna citoprotekcija. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.

9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, et al. Dikumarol inhibicija NADPH: kinon oksidoreduktaza inducira inhibiciju rasta raka pankreasa putem mehanizma posredovanog superoksidom. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.

10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Prekomjerna ekspresija NAD (P) H: kinon oksidoreduktaza 1 inhibira proliferaciju ćelija hepatocelularnog karcinoma i indukovanu apoptozu aktiviranjem AMPK/PGC-1 puta. DNK Cell Biol. 2017;36(4):256–63.

11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Supresija NAD (P) H-kinon oksidoreduktaze 1 povećala je osjetljivost ćelija holangiokarcinoma na hemoterapeutske agense. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.

12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatin u terapiji raka: molekularni mehanizmi djelovanja. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.

13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allilmerkaptocistein smanjuje nefrotoksičnost izazvanu cisplatinom kroz supresiju apoptoze, oksidativnog stresa i upale. Nutrienti. 2017;9(2):166.

14. Matkowski A. Biljna in vitro kultura za proizvodnju antioksidansa – pregled. Biotechnol Adv. 2008;26(6):548–60.

15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Antioksidativna aktivnost Rumex vicarious L. u vegetativnoj fazi rasta. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.

16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) u Australiji: preispitivanje. Nuytsia. 1984; 5:75–122.

17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Kinon oksidoreduktaza 1 induktor aktivnosti nekih ljekovitih biljaka Saudijske Arabije. Planta Med. 2013;79(06):459–64.

18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil bioaktivnih jedinjenja Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.

19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde- Filho PF, et al. Izvori alfa-, beta-, gama-, delta- i epsilon-karotena: pregled dvadesetog veka. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.

20. Laouini SE, Ouahrani MR. Fitokemijski skrining, in vitro antioksidativna i antibakterijska aktivnost ekstrakta Rumex vicarious L.. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.