AKT aktiviran predkondicioniranjem kontroliše neuronsku toleranciju na ishemiju putem MDM2–p53 putaⅡ

3. Diskusija

Naši rezultati otkrivaju da IPC posredovana aktivacija PI3K/AKT signalnog puta pokreće neuronski IT kontroliranjem MDM2-p53 kompleksa u primarnim kortikalnim neuronima. Prvo smo potvrdili efikasnost predkondicioniranja u smislu neuroprotekcije [33,39–41] koristeći validirani IPC eksperimentalni model.

Click to cistanche tubulosa nuspojave za Neuron

Otkrili smo da je eksperimentalni IPC izazvan kratkom (20 min) deprivacijom kisika i glukoze (OGD) praćenom 2 h reoksigenacije rezultirao neuroprotekcijom, što je pokazano prevencijom i neuronske apoptoze i aktivacije kaspaze{2}} izazvane produženim OGD (90 min) nakon čega slijedi 4 h reoksigenacije (OGD/R). Pokazali smo da IPC smanjuje aktivaciju kaspaze-3 u kortikalnim neuronima, što je u korelaciji sa manjom apoptozom nakon naknadnog i težeg ishemijskog inzulta.

Ravnoteža između pro- i antiapoptotičkih signala je fundamentalna da bi se osiguralo preživljavanje neurona nakon ishemije [3,33,38,42–44]. Iako je relevantnost ovakvih događaja prikazana i u modelima hemoragijskog i ishemijskog in vivo moždanog udara [43,45], mehanizmi koji reguliraju ove signalne puteve još uvijek nisu u potpunosti shvaćeni u kontekstu ishemijske tolerancije. Uloga antiapoptotičkog AKT-a i njegovih srodnih puteva opsežno je proučavana u ćelijama raka [46,47] i moždanom tkivu [38,48]; međutim, do sada, uloga AKT/MDM2–p53 signalnog puta u IPC-posredovanoj neuronskoj toleranciji protiv ishemijske povrede ostaje neuhvatljiva.

Ovdje smo otkrili da aktivacija PI3K/AKT signalnog puta uzrokovanog IPC potiče fosforilaciju MDM2 na Ser166, što pokreće njegovu nuklearnu translokaciju i stabilizaciju proteina, sprječavajući p53-indukovanu apoptozu putem kaspaze-3 aktivacije nakon ishemije. Aktivacija AKT putem fosforilacije pospješuje preživljavanje neurona [24,49] i može doprinijeti indukciji IT [25,50]. Naši rezultati pokazuju da je relativna količina AKT proteina nepromijenjena pod ishemijskim ili predkondicioniranim stimulansima. Zanimljivo je da smo otkrili da rana fosforilacija AKT-a na Ser473 posredovana PI3K sprečava stabilizaciju p53 izazvanu ishemijom u prethodno kondicioniranim neuronima.

Efekat nije nastao zbog modifikacija nivoa p53 mRNA [33,34,44] već zbog smanjenih nivoa proteina p53 zbog IPC-a prije OGD/R. Budući da je MDM2 glavni regulator stabilizacije p53 i također je direktna meta AKT-a, naši rezultati ukazuju na ulogu AKT/MDM2–p53 signalnog puta u neuronskoj toleranciji na ishemiju. MDM2 mRNA se brzo povećava nakon OGD [34], ali aktivnost MDM2 se uglavnom kontroliše posttranslacijskim modifikacijama, posebno fosforilacijom [51]. U dobrom slaganju s ovim, otkrili smo da jednom aktiviran fosforilacijom nakon IPC-a, AKT, zauzvrat, fosforilira MDM2 na ostatku Ser166, koji se nalazi u blizini signala nuklearne lokalizacije [52], a ovaj učinak se održava nakon OGD/R ozljede.

Naši rezultati pokazuju da je fosforilacija MDM2 na Ser166 dovoljna za ispoljavanje IPC-posredovanog neuroprotektivnog efekta putem destabilizacije p53. Dakle, ovdje smo identificirali vremenski ovisnu aktivaciju AKT/MDM2-p53 puta nakon ishemijske ozljede i, zaista, pokazali smo da je IPC aktiviran AKT pokrenuo nuklearnu translokaciju ektopičnog MDM2, kao i stabilizaciju endogenog proteina.

Štaviše, AKT ostaje aktivan unutar jezgra, gdje bi PI3K također mogao migrirati kao odgovor na oksidativni stres i zatim uzeti u obzir fosforilaciju AKT-a [53]. Inhibicija PI3K posredovane fosforilacije AKT ili AKT knockdown promoviše zadržavanje MDM2 proteina u citoplazmi, i sprečava Ser166 fosforilaciju MDM2, kao i IPC posredovanu neuroprotekciju protiv ishemijom izazvane neuronske apoptoze. Naprotiv, pokazali smo da se aktivni AKT vezuje za nuklearni MDM2 protein.

Kao posljedica toga, aktivni AKT promovira fosforilaciju MDM2 i njegovu nuklearnu stabilizaciju, što doprinosi IPC-posredovanoj neuroprotekciji. Naši rezultati otkrivaju da je neuroprotekcija koju je promovirala IPC ovisila o PI3K posredovanoj AKT aktivaciji, koja je fosforilirala MDM2 na Ser166, promovišući nuklearnu akumulaciju MDM2 nakon ishemijskog inzulta.

U skladu s tim, inhibicija PI3K/AKT vortmaninom ili smanjenje AKT-a pomoću siRNA ukinula je neuroprotekciju koju promovira IPC, što je dovelo do stabilizacije p53 i naknadne neuronske apoptoze nakon ishemije. Stoga, naši rezultati pomažu da se razjasni suštinska uloga IPC-zavisne aktivacije AKT-MDM2 puta u preživljavanju neurona protiv ishemijske povrede.

Protein p53 je uključen u kontrolu neuronske smrti/preživljenja koja određuje prognozu kod pacijenata sa moždanim udarom [34,42,54], kao i kod pacijenata sa TIA [3]. P53 stabilizacija kompromituje neuroprotekciju posredovanu predkondicioniranjem do ishemijske/reperfuzijske ozljede [33]. Interakcija MDM2-p53 će, stoga, biti kritična za preživljavanje neurona u ovom kontekstu [34] i za IPC posredovanu toleranciju na ishemijske povrede [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G u MDM2 promotoru određuje ekspresiju MDM2 i, zauzvrat, modulira oporavak pacijenata koji pate od moždanog udara [34].

Osim toga, primijetili smo da Tp53 gen SNP (rs1042522) modulira stabilizaciju mitohondrija p53 i neuronsku toleranciju na ishemiju, dok predviđa funkcionalni oporavak pacijenata koji pate od TIA prije moždanog udara [3]. Stoga će kontrola apoptotičkih puteva p53 biti od suštinskog značaja za osiguranje neuroprotektivnog efekta IPC.

Ovi rezultati pružaju translacijski pristup studiji koji bi se mogao implementirati u budućnosti za dobrobit pacijenata, a signalni put PI3K/AKT–MDM2–p53 postavljaju kao bitnu metu za IT strategije koje se promoviraju predkondicioniranjem kod ishemijskog moždanog udara. Ukratko, pokazujemo da IPC-pojačani PI3K/AKT signalni put promovira fosforilaciju MDM2 na Ser166, što dovodi do MDM2 nuklearne translokacije i njegove stabilizacije, što pokreće neuronsku IT promocijom destabilizacije p53 i naknadnom inaktivacijom apoptotske smrti izazvane ishemijom.

Naši rezultati ističu potencijalne prednosti rane aktivacije AKT-a u IPC-posredovanoj neuronskoj toleranciji, koja reguliše MDM2-p53 apoptotski put pod ishemijskom ozljedom. Ovi nalazi naglašavaju priliku da se razumiju mehanizmi koji reguliraju neuronski signalni put AKT–MDM2–p53 za razvoj novih neuroprotektivnih strategija za poremećaje povezane s IT.

4. Materijali i metode

4.1. Primarne kulture kortikalnih neurona

Neuronske kulture su pripremljene iz C57Bl/6J ili p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) embriona miša (14.5E). Neuroni su zasejani pri 1,8 × 105 ćelija/cm2 u Neurobasal mediju sa dodatkom 2 procenta B27 i 2 mM glutamina (Invitrogen, Madrid, Španija) i inkubirani na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO{18}} [ 55].

4.2. Modeli deprivacije kisika i glukoze i predkondicioniranja

Nakon 9–1{{1{19}}}} dana in vitro (DIV), neuroni su izloženi deprivaciji kiseonika i glukoze (OGD) inkubacijom ćelija na 37 ◦C tokom 90 min u inkubatoru opremljen zračnom komorom i kontinuirano gasi sa 95 posto N2/5 posto CO2. Inkubacijski medij (puferirani Hanksov rastvor bez glukoze: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2, 2 mM CaCl2, 5 mM CaCl2, 5 posto HES2, prethodno je dodat pH 9 posto. N2 /5 posto CO2 tokom 30 min. Pod ovim uslovima, koncentracije kiseonika u medijumu za inkubaciju bile su 6,7 ± 0,5 µM mereno sa Clark elektrodom za kiseonik [56,57].

Kada je indicirano, neuroni su bili izloženi ishemijskom predkondicioniranju (IPC; kratki OGD 20 minuta nakon čega slijedi 2 h reoksigenacije) prije naknadne produžene ishemije (OGD, 90 min) i 4 h reoksigenacije (IPC plus OGD/R) (Slika S1B ). Paralelno, neuroni su inkubirani u normoksiji (Nx) na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi od 95 posto zraka/5 posto CO2 ili ishemijskog predkondicioniranja (IPC). Kada je indicirano, neuroni su inkubirani 30 minuta prije IPC u puferiranom Hanksovom rastvoru (pH 7,4), u odsustvu ili prisustvu vortmanina (100 nmol/L), kao što je prethodno opisano [19].

4.3. Cell Transfections

Neuroni (8 DIV) ili HEK-293T ćelije su transficirane plazmidnim vektorom koji eksprimira YFP-označeni Mdm2 iz MDM2 humanog promotora. MDM2p/Mdm2-YFP je poklon od Urija Alona i Galita Lahava (Addgene plazmid # 53962, Watertown, MA, SAD) [58]. Po potrebi, prazan vektor (pYFP) je korišten kao kontrola u istim uslovima. Transfekcija plazmida je izvedena korišćenjem Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), prema uputstvima proizvođača. Ćelije su transficirane sa 1,5 µg/µL plazmidnih vektora i korištene nakon 24 h.

Nokdaun AKT u 6 DIV neurona je postignut transfekcijom sa malim interferirajućim dvolančanim ribonukleotidima (siRNA). Ciljane sekvence su bile sljedeće: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (miš, s62216, odgovara nukleotidima 1006–1025, pristupni broj GenBank) [{59}} NM]. Kao negativnu kontrolu koristili smo Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Sve siRNA su kupljene od kompanija Ambion®, Invitrogen® i Thermo Fischer Scientific (Ofenbach, Njemačka). Prema stepenu uništenja proteina, efikasnost transfekcije siRNA je procijenjena na 70-80 posto 3 dana nakon transfekcije. Za eksperimente utišavanja, neuroni su transficirani sa siRNA (10 nM) koristeći Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), slijedeći upute proizvođača. Neuroni su dalje inkubirani u Neurobasal mediju 72 h prije upotrebe.

4.4. Protočna citometrijska detekcija apoptotske smrti ćelije

Neuroni su pažljivo odvojeni od ploča upotrebom 1 mM EDTA tetranatrijumove soli u PBS (pH 7,4) i obojeni aneksinom V/APC i 7-AAD, izvedeno tačno kako je prethodno opisano [55].

4.5. Analiza aktivnosti kaspaze{2}}

Aktivnost kaspaze-3 procijenjena je u ćelijskim lizatima [33] i prema uputstvima proizvođača korištenjem Fluorimetric Assay kita CASP3F od SIGMA i očitana pri emisiji na talasnoj dužini od 405 nm. Metoda se zasniva na oslobađanju fluorescentnog 7-amino4-metil kumarina (AMC) ostatka. Koncentracija AMC se izračunava korištenjem AMC standarda.

4.6. Imunoblotovi i ko-imunoprecipitacijski test

Neuroni su lizirani u puferu koji sadrži 1 posto SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 i 1 posto Triton X-100 (NP40: 1 posto NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM i 10 posto glicerola) sa dodatkom inhibitora fosfataze (1 mM Na3VO4 i 50 mM NaF) i inhibitora proteaze (100 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 50 µg/mL anti-pap µn 50 µg/mL fluorida µg/mL amastatina, 50 µg/mL leupeptina, 50 µg/mL bestatina i 50 µg/mL inhibitora sojinog tripsina), čuvaju na ledu 30 minuta i kuhaju 5 minuta. Alikvoti liziranih ekstrakata podvrgnuti su SDS poliakrilamidnom gelu (MiniProtean®, Bio-Rad) i blotirani antitelima preko noći na 4 ◦C. Korištena su antitijela anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-cijepana kaspaza-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, SAD), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; također otkriva YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Njemačka) i antiGAPDH (Ambion, Cambridge, UK) preko noći na 4 ◦C. Nakon inkubacije s kozjim anti-zečjim IgG (Pierce, Thermo Scientific) ili kozjim antimišjim IgG (Bio-Rad), konjugiranim peroksidazom hrena, membrane su odmah inkubirane uz pojačanu kemiluminiscenciju SuperSignal West Dura (Pierce) 5 minuta prije izlaganja Kodaku XAR{62}} film u trajanju od 1 do 5 minuta, a autoradiogrami su skenirani. Intenzitet traka je kvantifikovan korišćenjem softvera ImageJ 1.48v, kao što je prethodno opisano [60].

Za test ko-imunoprecipitacije, neuroni su lizirani u ledeno hladnom puferu koji sadrži 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 posto NP-40) ​​sa dodatkom inhibitora fosfataze opisanih gore. Nakon čišćenja ostataka centrifugiranjem, neuronski lizati (100 mg) su inkubirani sa 1 mg antitijela 24 sata na 4 ◦C, nakon čega je dodato 10 mL proteina A-agaroze (GE Healthcare Life Sciences) 2 h u 4 ◦C. Imunoprecipitati su opsežno isprani puferom za lizu i razdvojeni pomoću SDS-PAGE i imunoblotirani sa naznačenim antitelima [61]. Relativna zastupljenost proteina prikazana je na slici S1. Pune mrlje i gel skeniranja uključeni su na slici S3.

4.7. Imunocitohemija i analiza slike

Neuroni su uzgajani na staklenim poklopcima i fiksirani sa 4 procenta (w/v, u PBS) paraformaldehida 30 minuta i imuno obojeni zečjim anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, SAD), mišjim anti-MDM2 (2A10, ab-16895), miš anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) [55], miš anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, Kalifornija, SAD) i anti-GFP (1:1000; ab290; također potvrđen za otkrivanje YFP). Imunoobilježavanje je otkriveno korištenjem sekundarnih antitijela anti-zečji IgG-Cy3 ili anti-mišji IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Jezgra su obojena sa 40,6-diamidino-2 fenilindolom (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Poklopci su oprani, postavljeni u SlowFade light antifade reagens (Invitrogen) na staklena stakla i pregledani pomoću mikroskopa (Nikon invertirani mikroskop Eclipse Ti-E, (NY, SAD) opremljen sa 40× objektivom, predcentriranim svjetlosnim iluminatorom Nikon Intensilight C-HGFI, i crno-bijeli digitalni fotoaparat sa spojenim punjenjem Hamamatsu ORCAER ili skenirajući laserski konfokalni mikroskop ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokio, Japan) sa tri lasera 405, 491 i 561 nm, opremljen sa 40×, 63× i 100× PL Apo objektivom za uranjanje u ulje za snimanje slike visoke rezolucije i digitalni fotoaparat uređaja Evolve Photometrics.

Sve postavke mikroskopa su postavljene da prikupljaju fluorescentne slike ispod zasićenja i održavane su konstantnim za sve slike snimljene u eksperimentu. Slike su analizirane softverom ImageJ 1.48v (Nacionalni institut za zdravlje). Procenat p(Ser473)AKT plus i p53 plus neurona i kvantifikacija maksimalnog intenziteta proteinske fluorescencije p(Ser473)AKT i p53 prikazani su na slici S2A. U MDM2-GFP-transficiranim neuronima, nukleocitoplazmatska distribucija MDM2-GFP-a izračunata je kao omjer srednje nuklearne fluorescencije i srednje citoplazmatske fluorescencije endogenog MDM2, mjereno u 24 neurona (šest neurona po stanje u četiri različite kulture neurona) (Slika S2B) [62].

Da bi se kvantifikovao maksimalni intenzitet nuklearne fluorescencije endogenog MDM2 bojenja i pSer473AKT, izmjereno je 40 neurona (10 neurona po stanju u četiri različite kulture) (slika S2C), kao što je prethodno opisano [44]. U reprezentativnim profilima intenziteta poprečnog presjeka prikazanim na slici 5B, postotak p(Ser473)AKT i MDM2 naznačen ispod svakog stanja kvantificiran je kao nuklearna srednja fluorescencija. U svim slučajevima, jezgra su identifikovana DAPI bojenjem. Maksimalni intenzitet nuklearne MDM2 fluorescencije u neuronima tretiranim wortmaninom ili siAkt prikazan je na slici S2D.

4.8. Statistička analiza

Eksperimentalni rezultati su evaluirani jednosmjernom analizom varijanse, nakon čega je uslijedio Bonferroni post hoc test, korišten za poređenje vrijednosti između više grupa. Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM. Za poređenje između dvije grupe vrijednosti korišten je Studentov t-test. U svim slučajevima, p < 0.05 se smatra značajnim (* p < 0,05 u odnosu na Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Kako Cistanche štiti neurone?

Postoje neki dokazi koji ukazuju na to da Cistanche može zaštititi neurone smanjenjem apoptoze (programirane ćelijske smrti) i promicanjem neuronskog preživljavanja. Apoptoza je prirodni proces koji se događa u tijelu kako bi se uklonile oštećene ili neželjene stanice, ali može biti štetna kada se dogodi pretjerano ili neodgovarajuće. U laboratorijskim studijama je utvrđeno da Cistanche inhibira apoptozu, a ovaj učinak može pomoći u zaštiti neurona od oštećenja.

Osim toga, Cistanche sadrži nekoliko bioaktivnih spojeva za koje se pokazalo da imaju neuroprotektivno djelovanje. Na primjer, sadrži ehinakozid, za koji se pokazalo da štiti neurone od oksidativnog stresa i upale. Sadrži i akteozid, za koji je utvrđeno da ima protuupalna i antioksidativna svojstva.

Reference

1. Emberson, J.; Lees, KR; Lyden, P.; Blackwell, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brott, T.; Cohen, G.; Davis, S.; Donnan, G.; et al. Utjecaj odgode liječenja, starosti i težine moždanog udara na efekte intravenske trombolize s alteplazom za akutni ishemijski moždani udar: meta-analiza podataka o pojedinačnim pacijentima iz randomiziranih studija. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Chen, D.-Z.; Zhao, M.; Yang, X.-F.; Gong, D.-R. Prethodni prolazni ishemijski napadi mogu imati neuroprotektivni efekat kod pacijenata sa ishemijskim moždanim udarom. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodriguez, C.; Vecino, R.; Garcia, EC; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, JF; Almeida, A.; et al. Neuronska ishemijska tolerancija je uslovljena polimorfizmom Tp53 Arg72Pro. Transl. Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Iadecola, C.; Anrather, J. Istraživanje moždanog udara na raskrsnici: Pitati mozak za smjer. Nat. Neurosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhao, C.; Jiang, M.; Zhang, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Zhang, M.; Qi, J.; Su, A.; Lou, N.; Xian, X.; et al. Gama receptor aktiviran proliferatorom peroksizoma učestvuje u sticanju ishemijske tolerancije mozga izazvane ishemijskim predkondicioniranjem preko glijalnog glutamatnog transportera 1 in vivo i in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodriguez, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Refokusiranje mozga: Novi pristupi u neuroprotekciji protiv ishemijske ozljede. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzel-Poore, MP; Stevens, SL; Xiong, Z.; Lessov, NS; Harrington, AC; Mori, M.; Meller, R.; Rosenzweig, HL; Tobar, E.; Shaw, ET; et al. Utjecaj ishemijskog predkondicioniranja na genomski odgovor na cerebralnu ishemiju: sličnost neuroprotektivnim strategijama u hibernaciji i stanjima tolerantnim na hipoksiju. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Cerebralno predkondicioniranje i ishemijska tolerancija. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Leak, R.; Gan, Y.; Li, P.; Zhang, F.; Hu, X.; Jing, Z.; Chen, J.; Zigmond, MJ; Gao, Y. Predkondicioniranje pruža neuroprotekciju u modelima CNS bolesti: paradigme i klinički značaj. Prog. Neurobiol. 2014, 114, 58–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Koch, S.; Della Morte, D.; Dave, KR; Sacco, RL; Perez-Pinzon, AM Biomarkeri za ishemijsko predkondicioniranje: Pronalaženje odgovora. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bagetta, G.; Amantea, D. Modulacija regulacijskog faktora unosa kalcija (SARAF) i perifernog oraia1 nakon fokalne cerebralne ishemije i predkondicioniranja kod miševa. Neuroscience 2020, 441, 8–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novi ćelijski mehanizmi za neuroprotekciju u ishemijskom predkondicioniranju: Pogled iz unutrašnjosti organela. Front. Neurol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukan, A.; Tatlisumak, T. Ishemijska tolerancija izazvana predkondicioniranjem: prozor u endogenu opremu za cerebroprotekciju. Exp. Transl. Stroke Med. 2010, 2, 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotički mehanizmi nakon cerebralne ishemije. Stroke 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Zhao, H.; Sapolsky, RM; Steinberg, GK Fosfoinozitid-3-Kinaza/Akt signalni putevi preživljavanja su uključeni u neuronsko preživljavanje nakon moždanog udara. Mol. Neurobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Regulacija apoptoze u penumbri nakon ishemijskog moždanog udara: Ekspresija pro- i antiapoptotičkih proteina. Apoptoza 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt je molekularna meta za terapiju transdukcijom signala kod ishemijskog inzulta mozga. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Uloga Akt (protein kinaze B) i protein kinaze C u ishemijsko-reperfuzijskoj ozljedi. Neurol. Res. 2016, 38, 301–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Esteban, M.; Martín-Zanca, D.; Andres-Martin, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP Inhibicija PTEN peroksinitritom aktivira fosfoinozitid-3-kinazu/Akt neuroprotektivni signalni put. J. Neurochem. 2007, 102, 194–205. [CrossRef]

20. Manning, BD; Toker, A. AKT/PKB signalizacija: navigacija mrežom. Cell 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diez, H.; Garrido, JJ; Wandosell, F. Specifične uloge Akt izo formi u apoptozi i regulaciji rasta aksona u neuronima. PLOS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt izoforme su prisutne na različitim subcelularnim lokacijama. Am. J. Physiol. Physiol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharaj, S.; Velayutham, M.; Zweier, JL Rano ishemijsko predkondicioniranje zahtijeva Akt- i PKA posredovanu aktivaciju eNOS-a putem fosforilacije serina1176. Cardiovasc. Res. 2012, 97, 33–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Comb, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Događaji koji promovišu preživljavanje i smrt nakon prolazne cerebralne ishemije: fosforilacija Akt, oslobađanje citokroma C i aktivacija proteaza sličnih kaspazi. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafeez, A.; Noorulla, F.; Geng, X.; Shao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Zhao, H.; Ding, Y.; Ji, X. Predkondicioniranje u neuroprotekciji: od hipoksije do ishemije. Prog. Neurobiol. 2017, 157, 79–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Fosfatidilinozitol 3-kinaza/Akt put promovira translokaciju Mdm2 iz citoplazme u jezgro. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Ashcroft, M.; Ludwig, RL; Woods, DB; Copeland, TD; Weber, HO; Macrae, EJ; Vousden, KH Fosforilacija HDM2 od strane Akt. Oncogene 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Zhou, BP; Liao, J.; Xia, W. HER-2/neu indukuje ubikvitinaciju p53 preko Akt-posredovane MDM2 fosforilacije. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grossman, SR; Perez, M.; Kung, AL; Joseph, M.; Mansur, C.; Xiao, Z.-X.; Kumar, S.; Howley, P.; Livingston, DM p300/MDM2 kompleksi učestvuju u MDM2-posredovanoj degradaciji p53. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Toth, A.; Nickson, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Diferencijalna regulacija preživljavanja i hipertrofije kardiomiocita pomoću MDM2, E3 ubikvitin ligaze. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

32. Hausenloy, DJ; Tsang, A.; Mocanu, MM; Yellon, DM Ishemijsko predkondicioniranje štiti aktiviranjem prosurvival kinaza pri reperfuziji. Am. J. Physiol. Circ. Physiol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocanu, MM; Yellon, DM P53 down-regulation: Novi molekularni mehanizam uključen u ishemijsko predkondicioniranje. FEBS Lett. 2003, 555, 302–306. [CrossRef]

33. Vecino, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Jiménez, V.; Salom, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53 put je uključen u neuronsku toleranciju na ishemiju izazvanu predkondicioniranjem. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G u MDM2 promotoru određuje funkcionalni ishod nakon moždanog udara. Stroke 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Feng, J.; Park, J.; Cron, P.; Hess, D.; Hemmings, BA Identifikacija PKB/Akt hidrofobnog motiva Ser-473 kinaze kao DNK zavisne proteinske kinaze. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Zhang, S.; Wang, YT Ekscitotoksičnost i moždani udar: Identifikacija novih ciljeva za neuroprotekciju. Prog. Neurobiol. 2014, 115, 157–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Constantino, LC; Binder, LB; Vandresen-Filho, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI Uloga puta fosfatidilinozitol-3 kinaze u NMDA predkondicioniranju: različiti mehanizmi napadaja i neuronske degeneracije hipokampusa izazvane kinolinskom kiselinom. Neurotoks. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Xie, R.; Cheng, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapolsky, RM; Zhao, H. Akt izoforme različito štite od ozljede neurona uzrokovanih moždanim udarom regulacijom mTOR aktivnosti. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadia, S.; Hofmann, F.; Hardingham, NR; Bading, H.; Hardingham, GE Predkondicionirajuće doze NMDA promovišu neuroprotekciju povećanjem neuronske ekscitabilnosti. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW Ishemijska tolerancija u kulturi kortikalnih ćelija miša: kritična uloga za NMDA receptore. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Chen, M.; Lu, T.-J.; Chen, X.-J.; Zhou, Y.; Chen, Q.; Feng, X.-Y.; Xu, L.; Duan, W.-H.; Xiong, Z.-Q. Diferencijalne uloge podtipova NMDA receptora u ishemijskoj smrti neuronskih ćelija i ishemijskoj toleranciji. Stroke 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomez-Sanchez, JC; Esteban, MD; Rodriguez-Hernandez, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; GonzalezSarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Ljudski polimorfizam Tp53 Arg72Pro objašnjava različite funkcionalne prognoze u moždanom udaru. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Xu, W.; Gao, L.; Li, T.; Zheng, J.; Shao, A.; Zhang, J. Mesencephalic astrocyte-derived Neurotrophic Factor (MANF) štiti od neuronske apoptoze putem aktivacije Akt/MDM2/p53 signalnog puta u modelu intracerebralnog krvarenja kod pacova. Front. Mol. Neurosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C.; Lapreša, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 promovira preživljavanje neurona i funkcionalni oporavak nakon moždanog udara. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

46. ​​Burmistrova, O.; Olias-Arjona, A.; Lapreša, R.; Jimenez-Blasco, D.; Eremeeva, T.; Shishov, D.; Romanov, S.; Zakurdaeva, K.; Almeida, A.; Fedičev, PO; et al. Ciljanje na PFKFB3 ublažava cerebralnu ishemiju-reperfuzijsku ozljedu kod miševa. Sci. Rep. 2019, 9, 1–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kim, E.; Gao, Y.; Rankin, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -galat indukuje apoptozu i zaustavljanje G2 ćelijskog ciklusa putem Akt/MDM2/p53 puta u ćelijama raka jajnika A2780/CP70 otpornim na cisplatin. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Wan, W.; Hou, Y.; Wang, K.; Cheng, Y.; Pu, X.; Ye, X. LXR-623-indukovana duga nekodirajuća RNA LINC01125 potiskuje proliferaciju ćelija raka dojke putem PTEN/AKT/p53 signalnog puta. Cell Death Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duan, Y.; Zhang, N.; Wang, C.; Zhang, F. Puerarin ublažava lokomotorne i kognitivne deficite, kao i povredu neurona hipokampusa putem signalnog puta PI3K/Akt1/GSK-3 u in vivo modelu cerebralne ishemije. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Promjene Akt1 (PKB) i p70S6K u prolaznoj fokalnoj ishemiji. Neurobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Esposito, E.; Sirabella, R.; Cuomo, O.; Vinciguerra, A.; Di Renzo, G.; Annunziato, L. NCX1, i NCX3: Dva nova efektora odloženog predkondicioniranja u ishemiji mozga. Neurobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. Regulacija stabilnosti MDM2 nakon oštećenja DNK. J. Cell. Physiol. 2015, 230, 2318–2327. [CrossRef]

52. Olson, DC; Marechal, V.; Momand, J.; Chen, J.; Romocki, C.; Levine, AJ Identifikacija i karakterizacija višestrukih mdm-2 proteina i mdm-2-p53 proteinskih kompleksa. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Poboljšana fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K)/Akt signalizacija ima pleiotropne mete u neuronima hipokampusa izloženim oksidativnom stresu izazvanom željezom. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sánchez-Morán, I.; Rodríguez, C. Mitohondrijsko-nuklearna trgovina p53 kontroliše osetljivost neurona u moždanom udaru. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Esteban, M.; Garcia-Higuera, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 koordinira neurogenezu i veličinu korteksa tokom razvoja. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC Uloga NMDA receptora u razvoju moždane rezistencije kroz pre- i postkondicioniranje. Aging Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Esteban, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Deprivacija kiseonika i glukoze izaziva mitohondrijalnu disfunkciju i oksidativni stres u neuronima, ali ne i u astrocitima u primarnoj kulturi. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Lahav, G.; Rosenfeld, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorsky, N.; Levine, AJ; Elowitz, MB; Alon, U. Dinamika p53-Mdm2 povratne sprege u pojedinačnim ćelijama. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huang, DC; Siegel, PM; Camirand, A.; Yang, XF; Muller, WJ; Kremer, R. PTHrP pokreće inicijaciju tumora dojke, progresiju i metastaze kod miševa i potencijalna je terapijska meta. J. Clin. Investig. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Esteban, MD; Gomez-Sanchez, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforiliše Cdh1 i modulira stabilnost ciklina B1 u ekscitotoksičnosti. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Esteban, MD; Maestre, C.; Bobo-Jiménez, V.; Jiménez-Blasco, D.; Vecino, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Regulacija interakcije Bcl-xL-ATP sintaze od strane mitohondrijalnog ciklina B1-ciklin-zavisne kinaze-1 određuje neuronsko preživljavanje. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Jiménez, V.; Esteban, MD; Angibaud, J.; Sánchez-Morán, I.; de la Fuente, A.; Yajeya, J.; Nägerl, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2 put kontroliše dendritski integritet i memoriju. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]