Potencijalna terapeutska korist niske doze Cistanche kod sindroma kroničnog umora

Sindrom hroničnog umora(ME/CFS) je iscrpljujuća multisistemskahronično stanje nepoznate etiološke klasefified kao imunološka disfunkcijasindrom i neurološki poremećaj. Otkriće široko izraženog TransientaReceptorski potencijal melastatina 3 (TRPM3) kao nociceptorski kanal koji je značajno ciljanodređenim opioidnim receptorima, i njihove implikacije na kalcijum (Ca2 plus)-zavisni prirodni ubica(NK) ćelijske imunološke funkcije povećale su mogućnost da TRPM3 može bitifarmakološki ciljano za liječenje karakterističnih simptoma ME/CFS. Naltreksonhidrohlorid (NTX) djeluje kao antagonist mu (m)-opioidni receptor na taj način negiranjegova inhibitorna funkcija na TRPM3. Na osnovu pogodnostiprijavili su pacijenti na svojimsimptomi, mala doza NTX (LDN, 3.0–Čini se da tretman od 50 mg/dan) nudi neke potencijalne koristisugerirajući da bi njegov učinak mogao biti usmjeren na patomehanizam ME/CFS. Kako ne postoji literatura koja to potvrđujeefikasnostLDN za pacijente sa ME/CFSin vitro, ova studija istražuje potencijalni terapeutski efekat LDN kod pacijenata sa ME/CFS. TRPM3Aktivnost jonskih kanala izmjerena je nakon modulacije s pregnenolon sulfatom (PregS) i nijedna uNK ćelije na 9 pacijenata sa ME/CFS koji su uzimali LDN i 9 pacijenata koji odgovaraju dobi i poluzdrave kontrole koje koriste tehniku ​​patch-clamp na cijeloj ćeliji. Izvještavamo da pacijenti sa ME/CFSuzimanje LDN-a obnovilo je TRPM3-poput jonskih struja u NK ćelijama. Male jonske struje sa atipičan TRPM3-poput vanjskog ispravljanjamjerene su nakon primjene PregS-a, aTRPM{0}}agonist, u NK ćelijama pacijenata koji uzimaju LDN. Dodatno, ionski izazvani PregSstruje kroz TRPM3 su bile značajnemoduliran ničim u, TRPM3-antagonist,u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN. Ovi podaci potvrđuju hipotezu daLDN može imati potencijal kao tretman za ME/CFS karakterizacijom osnovnog regulatorni mehanizmi LDN tretmana koji uključuju TRPM3 i opioidne receptore u NKćelije. Konačno, ova studija može poslužiti za ponovno korištenje lijekova koji se prodaju, kao i za podrškuodobrenje prospektivnih randomiziranih kliničkih studija o ulozi i dozi NTX uliječenje pacijenata sa ME/CFS.

Ključne riječi:niske doze cistanche, prolazni receptorski potencijal melastatin 3, kalcijum, opioidni receptor, mijalgičniencefalomijelitis/sindrom hroničnog umora, prirodne ćelije ubice, elektrofiziologija cele ćelije patch-clamp

UVOD

mijalgični encefalomijelitis/Sindrom hroničnog umora(ME/CFS) je teško multisistemsko stanje koje karakterišeuporni iscrpljujući umor praćen nizomonesposobljavajući simptomi uključujući malaksalost nakon napora, sandisfunkcija, rašireni bol, kao i neuro-kognitivni,autonomni, kardiovaskularni, neuroendokrini i imunološkimanifestacije (1, 2). Postoji različita težina ME/CFS(blage do veoma teške) (3), gdje je značajnoi dosljedanimunološka disfunkcija i abnormalnosti kod prirodnog ubice (NK)ćelijske funkcije su prijavljene na osnovu ozbiljnosti (4). Bezklinički utvrđen dijagnostički test, dijagnoza je složena ineprecizan. Dijagnoza se trenutno zasniva na različitim simptomimadefinicije padeža, poznat kao kanadski kriterijumi konsenzusa(CCC, 2003) i Međunarodni kriterijumi slučaja (2011), kojibaviti se kliničkim karakteristikama ME/CFS (2, 5, 6). Theetiologije i specifičnostipatofiziologija stanja, kojapogađa 17 do 24 miliona ljudi širom svijeta (7), ostaju nepoznati.ME/CFS se potencijalno razvija zbog oštećenja uProlazni receptorski potencijal (TRP) neselektivni kationkanali uzrokovani genetskim ili stečenim faktorima (8–13). Prethodne studije su ukazivale na važnost TRP Melastatina 3(TRPM3), široko izražen kalcijum (Ca2 plus)-propusnaneselektivni katjonski kanal, u patofiziologiji ME/CFS(8–10). Nedavno su nezavisna elektrofiziološka istraživanjapokazao gubitak funkcije jonskog kanala TRPM3 nakonstimulacija sa dva moćna TRPM3-agonista, pregnenolonomsulfat (PregS) i nifedipin, te inhibicija selektivnimi moćan blokator, deoksibezoin ononetin, u NK ćelijama iztri različite kohorte pacijenata sa ME/CFS (11–13). TRPM3 je ranije identifikovankao hemo- itermosenzitivni nociceptorski kanal u somatosenzorusistema i umiješan je u otkrivanje štetne topline i upaletoplotnu hiperalgeziju, kao i prijenos bola(14). Novija literatura sugerira da signalni putevipovezan sa aktivacijom određenih G-proteina spregnutihreceptori (GPCR), nazvani opioidni receptori, mogu inhibirati TRPM3aktivnost jonskih kanala direktnim vezivanjem Gbgpodjedinicatrimerni G-proteini na jonski kanal (15–18). fiziološki,opioidni receptori se aktiviraju endogenim opioidnim peptidimamoduliraju mehanizme boli i upaleputevi (19). Opioidni lijekovi ili opijati proizvode i analgeziju ineželjene nuspojave spajanjem na iste GPCR (19). Dokazi pokazuju da opioidni receptori nisu samo eksprimiraniod strane centralnog nervnog sistema (CNS), ali su široko rasprostranjenena tkivima i sistemima organa izvan CNS-a, kao što suimune ćelije (20). Aktivacija leukocitnih opioidnih receptoradovodi do lučenja endogenih opioidnih peptida, kojizatim aktiviraju neuronske opioidne receptore i ublažavajubol (21). Pokazalo se i da opioidi djeluju imunosupresivnoefekti na urođeni i adaptivni imuni sistem (22). ME/Patologija CFS se može smatrati poremećajem jonskih kanala ilikanalopatija (8–13) kao i imunološku disfunkcijusindrom i neurološki poremećaj (23, 24). Stoga je od vitalnog značajaistražiti regulatorne mehanizme koji su u osnoviInterakcija TRPM3-opioidnih receptora u NK ćelijama iz ME/CFSpacijenata kako bi bolje razumjeli patogenezu.Otkriće TRPM3 kao nociceptorskog kanalau velikoj mjeri ciljani određenim opioidnim receptorima, kao i njegovimimplikacija u Ca2 plus-zavisne imunološke funkcije NK stanicasugerira da TRPM3 jonski kanal može biti farmakološkiciljano na liječenje ME/CFS. Naltrekson hidrohlorid (NTX) je adugotrajni opioidni antagonist posebnociljanje na mu-opioidreceptor (MOR) i, u manjoj mjeri, delta-opioidreceptori (dILI) (25, 26). Uključivanje NTX-amOR negirainhibitornu funkciju ovih opioidnih receptora na TRPM3 (15, 17, 18, 26). To smo ranije izvještavaliin vitrotretmanNK ćelija od ME/CFS pacijenata sa NTX tokom 24 sata, obnavljaaktivnost jonskog kanala TRPM3 (13). Obnova TRPM3 jonaaktivnost kanala je zauzvrat ponovo uspostavila odgovarajući Ca2 plussignalizacija iper seNK ćelije' aktivacijske i efektorske funkcije(13). NTX se obično koristi u liječenju opioida izavisnost od alkohola u dozi od 50-100 mg/dan (25). Na visokojdoze, smatra se da NTX blokira euforične osjećaje beta-endorfinakoji su uključeni u prirodne krugove nagrađivanja istoga može izdržati ovisnost (27). Mala doza (3.0–5.0 mg/dan,čini se da niske doze NTX, LDN) imaju suprotan učinak,pojačava učinak endorfina za smanjenje boli i jačanjezadovoljstvo (28). Vjeruje se da je toimaju značaja za bolestikao što je ME/CFS, gdje je nedovoljnoizlučivanje endogenihopioidni peptidi utiču na imunološki odgovor ili kontrolu bola (29, 30), ili oslobađanje proupalnihcitokini (25, 31). Nedavnostudija je objavila da je LDN siguran i efikasan za ublažavanje ME/CFSsimptoma retrospektivnim pregledom kliničkog pacijentaevidencija o 218 pacijenata sa ME/CFS-om kojima je davan LDN (27). Čak iakonovi dokazi ukazuju da LDN može poboljšati svakodnevnu funkciju ikvaliteta života pacijenata sa ME/CFS, daljein vitroistraga jepotrebno za razumijevanje osnovnih regulatornih mehanizamakoji uključuju TRPM3 i opioidne receptore u NK ćelijama da pomognurazumjeti patomehanizam ME/CFS i identificiratiterapijski ciljevi.Ova studija istraživala je potencijalni terapeutski učinakLDN kod pacijenata sa ME/CFS obnavljanjem TRPM3 jonskog kanalafunkcioniraju u NK stanicama koristeći tehnike patch-clamp-a za cijelu ćeliju.Naši rezultati pokazuju da pacijenti sa ME/CFS koji uzimaju LDN imajuobnovljene TRPM3-poput jonskih struja u NK ćelijama. Restauracija ofTRPM3 funkcija je potrebna za promoviranje Ca2 plusremodeliranje signalau NK ćelijama iper seAktivacija NK stanica i efektorske funkcije.Ovo je prvistudija za izvještavanje o efikasnostiLDN-a za ME/CFSpacijenatain vitro, dakle potvrđujenjegov potencijal za upotrebu kao atretman za bolest.

Kliknite ovdje da biste saznali više o cistanche funkciji protiv umora

MATERIJALI I METODERegrutacija učesnika

Devet pacijenata sa ME/CFS i devet zdravih pacijenata koji odgovaraju dobi i polukontrole (HC) su regrutovane pomoću Nacionalnog centra zaPacijent neuroimunologije i novih bolesti (NCNED).baza podataka između septembra 2019. i februara 2021.Učesnici su bili starosti između 18 i 60 godina. Svi ME/CFSpacijenti su prethodno dobili potvrđenumedicinska dijagnozai pregledani su pomoću sveobuhvatnog online upitnikadopisivanje sa Centrima za kontrolu bolesti iDefinicije slučajeva prevencije (CDC), CCC i ICC. Svih devet ME/Definisani su pacijenti sa CFSod strane CCC. Svih devet pacijenata sa ME/CFSsu bili regrutovani od strane NCNED-a jer su prethodno započeli LDNtretman (3.0–5.0 mg/dan) najmanje 4 sedmice kao dio njihovogplan upravljanja nakon recepta od strane njihovog lekara opšte prakse.HC nije prijavio pojavu umora i dobrog je zdravljabez dokaza o bolesti. Učesnici su bili isključeni iz ovogaispitati da li su bile trudne ili dojile, ili su prijavile aprethodna istorija pušenja, zloupotrebe alkohola ili hronične bolesti(na primjer, autoimune bolesti, kardiovaskularne bolesti,dijabetes, metabolički sindrom, bolesti štitne žlijezde, maligni tumori,nesanica, hronični umor i primarni psihički poremećaji)ili su bili gojazni (BMIVeće ili jednako30). Nijedan učesnik nije prijavio upotrebu opioidaili bilo koji drugi lek protiv bolova u prethodna 3 meseca, kao ifarmakoloških agenasa koji direktno ili indirektno utiču TRPM3 ili ca2 plussignalizacija. Učesnicima je obezbeđenomogućnost prekida bilo kakvog sukobalijekove za minimalno 14dana prije davanja krvi uz odobrenje svog ljekara.Svi učesnici su ispunili online upitnik koji su trebali dostavitisociodemografska pozadina, medicinska istorija, lijekovi ianamneza simptoma kod pacijenata sa ME/CFS (Tabela 1). 36-stavkakratka zdravstvena anketa (SF-36) i Svjetska zdravstvena organizacija(WHO) Raspored procene invaliditeta (DAS).odrediti stepen invaliditeta i kvalitet života (Tabela 2) (32, 33). Konačno, od pacijenata sa ME/CFS je zatraženo da sami prijave težinusimptomi prije i nakon uzimanja LDN (Tabela 3). Ovoistragu je odobrio GriffithUniversity HumanOdbor za etiku istraživanja (GU2019/1005) i Gold CoastUniverzitetska bolnica za ljudska istraživanja Etički odbor(HREC/2019/QGC/56469).

Mononuklearna ćelija periferne krviIzolacija i izolacija prirodnih ćelija ubojica

Ukupno je prikupljeno 85 ml pune krvietilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA) cijeviprekovenepunkcijaod strane kvalifikovanogflebotomista od svakog učesnika između 8:30 ujutroi 10:30 na lokacijama za prikupljanje uključujući Griffithuniverzitet,Royal Brisbane i žene's Hospital, Robina bolnica, SunshineUniverzitetska bolnica Coast, bolnica Calvary John James,

Kraljevska bolnica u Melburnu, Australija. Rutinska puna analiza krviobavljeno je u roku od četiri sata od prikupljanja crvenih krvnih zrnacabroj, broj bijelih krvnih zrnaca i broj granulocita za svakiučesnik u Univerzitetskoj bolnici Gold Cost ili Royal MelbourneBolnica, Australija.Uzorci su dostavljeni u laboratoriju i deidentifikovanikoristeći ajedinstveni kod nezavisnog sakupljača krvi. Periferna krvmononuklearne ćelije (PBMC) izolovane su iz 80 ml celinekrv centrifugiranjem preko medija s gradijentom gustine (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, Švedska) kao i ranijeopisano (34, 35). PBMC su obojeni tripan plavim(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) za određivanje broja ćelija ivitalnost ćelije. PBMC su prilagođeni afifikonačnu koncentraciju5x107 ćelija/ml za izolaciju NK ćelija.NK ćelije su izolovane imunomagnetskom selekcijom korišćenjem anEasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (matične ćelijeTechnologies, Vancouver, BC, Kanada). Pročišćavanje NK ćelija utvrđeno je korištenjemflflow citometrija. NK ćelije su inkubirane20 minuta na sobnoj temperaturi u prisustvu CD56FITC ({{0}}.25µg/5µl) i CD3 PE Cy7 (0,25µg/20µl) monoklonskiantitijela (BD Bioscience, San Jose, CA, SAD) kao i ranijeopisano (10). 7-amino-aktinomicin (7-AAD) (2,5 µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, USA) korištena je za određivanje ćelijeodrživost. Ćelije su isprane i resuspendovane u 200ml ofpufer za mrlje (BD Bioscience, New Jersey, SAD) i nabavljenna 10,000 događaja koristeći LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Dijego, Kalifornija, SAD). Koristeći raspršivanje naprijed i bočno, thepopulacija limfocita je zatvorena prilikom preuzimanja uzorka.Zatim je identificirana populacija NK ćelijakao CD3− CD56plusćelije.

Snimanje elektrofiziologije cijele ćelije

Elektrofiziološka snimanja vršena su borosilikatomstaklene kapilarne elektrode vanjskog prečnika 1,5 mm i anunutrašnji prečnik od 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,SAD). Otpor pipete kada je napunjensa otopinom za pipetu je 8-12 MW. Pipete su postavljene na CV203BU glavu(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, SAD) povezan na 3-načingrubi manipulator i mikro-manipulator (Narishige, Tokio,Japan). Električni signali su pojačanii snimljeno pomoću anAxopatch 200B pojačaloi softver PClamp 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SAD). Podaci su filtriranina 5 kHz iuzorkovano digitalno na 10 kHzprekoanalogni Digidata 1440Adigitalni pretvarač (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). TheProtokol naponske rampe bio je korak od potencijala zadržavanja od plus 10mV to−90 mV, nakon čega slijedi rampa od 0,1 s na plus 110 mV, prijevraćanje na plus 10 mV (ponavlja se svakih 10 s). Tečni spojpotencijal između pipete i rastvora za kupanje (−10 mV) je bioispravljeno. Komponenta struje curenja nije oduzeta odsnimljene struje. Elektroda je bila napunjenasa intracelularnimpipeta otopina koja sadrži 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2, 110 mML-asparaginska kiselina, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP,0.1 mM GTP, podešen pH na 7,2 sa CsOH i osmolalnošću

290 mOsm/L sa D-manitolom. Otopina pipete je filtrirana koristeći 0.22mm membranski filter(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,SAD), podijeljen u alikvote i pohranjen na−20 stepeni. Rješenje za kupanjesadrži: 130 mM NaCl, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 1,5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, podešen pH na 7,4 sa NaOH iosmolalnost 300 mOsm/L sa D-glukozom. Svi reagensi su bilikupljen od Sigma-Aldrich, osim za ATP i GTP kojikupljeni su od Sapphire Bioscience. TRPM3 jonskistruje na NK ćelijama stimulisane su dodavanjem 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, UK) na rastvor za kupanje, dokPregS-indukovane TRPM3 struje su blokirane dodavanjem 10mM ononetin (Tocris Bioscience, Bristol, UK). Za svakog učesnika,Napravljeno je 10 različitih snimaka. Dakle, N se odnosi na brojučesnika u svakoj grupi (ME/CFS pacijenti ili HC) i n, dobroj očitavanja ili veličina uzorka. Sva mjerenja su bilaizvodi se na sobnoj temperaturi. Autori su uklonilimogućnost uključivanja hloridne struje u TRPM3procjena korištenjem L-asparaginske kiseline u intracelularnoj pipetirješenje. Također su isključene ćelije koje imaju nestabilne strujeiz analize.Statistička analizaIdentificirane su populacije limfocitaod strane kolegekorišćenjem citometrijedijagrami tačaka raspršenosti prema naprijed i sa strane. Čistoća CD3- CD56plusodređivani su limfociti. Podaci citometrije su izvezeni izFacsDiva v8.1 i analiziran pomoću SPSS v24 (IBM Corp, verzija24, Armonk, NY, SAD) i GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., verzija 7, La Jolla, CA, SAD). Electrophysiologicalpodaci su analizirani pomoću softvera pCLAMP 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SAD). Origin 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, SAD) i GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., verzija 7, La Jolla, Kalifornija, SAD) sukoristi se za statističku analizu i prezentaciju podataka. Vizuelno ikorišćene su kompjuterske metode za određivanje normalnostinezavisni podaci.

Konkretno, grafikoni histograma iKorišteni su Shapiro-Wilkov test normalnosti, iskrivljenost i kurtozisda se odredi distribucija podataka i normalnost. U zavisnostina normalnosti, izvršeno je statističko poređenje korišćenjemnezavisni neparametarski Mann-Whitney U test, ilinezavisni parametarski t-test. Naviknut je na Fishersov precizan testodrediti osjetljivost NK stanica na ononetin. Značajje postavljenona str<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">drugačije navedeno.REZULTATIKarakteristike učesnika iBlood ParametersUključeno je osamnaest učesnika koji odgovaraju spolu i dobiovu istragu. Demografski podaci za pacijente susažeto uTabela 1. Nije bilo značajnograzlika ustarost ili pol između pacijenata sa ME/CFS i HC. SF-36 iWHODAS ankete su korištene za određivanje zdravlja učesnikasrodan kvalitet života (Tabela 2) (36, 37). 

Očekivano, bilo je značajnograzlika između SF-36 i WHODAS rezultataME/CFS pacijenti i HC. Štaviše, puna krvna slikamjereni su parametri za svakog zdravog učesnika iME/CFS pacijenti (Tabela 2). Dok smo izvijestili o značajnom razlika za eozinofile između zdravih učesnika i ME/Pacijenti sa CFS-om, svi rezultati su bili u okviru navedenihreferencarasponi koje obezbjeđuje Univerzitetska bolnica Gold CoastJedinica za patologiju, NATA akreditovana laboratorija. Nema značajnog razlike su zabilježene u drugim parametrima. Konačno, ME/CFSpacijenti su prijavili poboljšanje u poremećenom mišljenju,koncentraciju i kognitivno preopterećenje, kao i druge imunesimptomi poremećaja (upaljeno grlo, povećana ili osjetljiva limfačvorovi i podložnost prehladi/gripi) nakon tretmana saLDN (Tabela 3), kao što je ranije opisano (27, 38). 

Prirodna čistoća ćelija ubica

NK ćelijačistoća (CD3- /CD56plus) iznosio je 92,42 posto ± 1,849 za HC i82,20 posto ± 9,409 za pacijente sa ME/CFS koji uzimaju LDN kako je utvrđenobyflflova citometrija (Slika 1A). Nije bilo značajnog razlika u čistoći NK ćelija kod pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDNu poređenju sa HC (Slika 1B).

Aktivnost ionskog kanala TRPM3 poslijeStimulacija pregnenolonom u NK ćelijamaOd ME/CFS pacijenata koji uzimaju LDNU poređenju sa NK ćelijama iz HC

Aktivnost jonskih kanala TRPM3 zabilježena je u izolovanom humanom NKćelije pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN (3.0–5.0 mg/dan) iu poređenju sa izolovanim ljudskim NK ćelijama sličnih po godinama i poluHC, koristeći tehniku ​​patch-clamp na cijeloj ćeliji.Funkcija endogenog TRPM3 jonskog kanala bila je brzo ireverzibilno se aktivira primjenom 100mM PregS, aneuronski steroid. Stimulacija sa PregS omogućenim merenjemmale struje ispravljanja prema van pod naponomuslovi i posmatranje tipičnog oblika strujnog napona TRPM3odnos (I–V) (Slika 2). Mi, dakle,izmjerio malu jonsku struju sa tipičnim TRPM3-kaospoljašnje ispravljanjeu NK ćelijama izolovanim iz HC nakondodatak PregS-a (Slike 2A, B). Zanimljivo, PregSprimjena u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDNoponaša PregS-indukovano povećanje NK ćelija iz HC(Slike 2C, D). Stoga je PregS stimulacija izazvala povećanjespolja ispravljenogamplitude struje u NK ćelijama izME/CFS pacijenti koji uzimaju LDN na istom nivou kao i NK ćelijeHC (Slika 2E). Štaviše, struje izazvane PregS predstavljaju atipičnoI–V od TRPM3 (Slika 2D). Podaci govore da ME/CFS pacijenti koji uzimaju LDN više nemaju oštećenjeAktivnost TRPM3 kanala kao što je prethodno objavljeno (11–13), istoga LDN može imati potencijalnu terapeutsku koristzapatologija.

Modulacija PregS- izazvanih strujaSa ononetinom u NK ćelijama iz ME/CFSPacijenti koji uzimaju LDN u poređenju sa NKĆelije iz HC

PregS izazvan Ca2 plus-prilivi jonske struje kroz TRPM3jonski kanali mogu biti efikasno inhibirani prirodnim jedinjenjem,deoksibezoin ononetin (39). Stoga, da potvrdimtaj TRPM3aktivnost je uključena u PregS izazvane jonske struje u NK ćelijama, misljedeće korišteno 10mM ononetin za modulaciju TRPM3 jonskog kanalaaktivnost (Slika 3). Kao što je prethodno prikazano (11–13), jonskistruje izazvane primenom PregS-a bile su efektivneinhibirano istovremenom primjenom none in in izoliranoNK ćelije iz HC (Slike 3A–C). Štaviše, theI–V ofstruje osetljive na ononetin su spolja ispravljenei tipičnoza TRPM3 (Slika 3B). Zanimljivo je da su izazvane jonske strujeprimenom PregS-a su takođe efikasno inhibirani od straneistovremena primjena 10mM ononetin u izolovanom NKćelije pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN (Figure 3D–G). Zaista, TRPM3-zavisna jonska struja je ranije bilaprijavljeno je da je otporan na ononetin u izolovanim NK ćelijama izME/CFS pacijenti (11–13). Međutim, NK ćelije iz ME/CFSpacijenti koji uzimaju LDN su osjetljivi na ononetin u istom rasponukao NK ćelije iz HC (Slika 3G). Štaviše, theI–V ononetinaosjetljive struje su bile ispravljene prema vani tipično za TRPM3

(Slika 3E). konačno,Slika 3Hjavlja TRPM3 strujuamplitude nakon PregS stimulacije i ononetinske modulacijeunutar HC i ME/CFS koji uzimaju LDN grupe i samouključeni su zapisi osjetljivi na ononetin. Značajan smanjenje amplitude struje TRPM3 zabilježeno je nakonmodulacija sa ononetinom kod oba pacijenta koji uzimaju ME/CFSLDN (p=0.0336) i HC (p=0.0205) grupe. Ovaj grafikon potvrđujeTRPM3 jonski kanal funkcionira slično u ME/CFSpacijenti koji uzimaju LDN u poređenju sa HC kao istu strujuamplituda se prikazuje (Slika 3H). Zajedno, ovirezultati potvrđujuda pacijenti sa ME/CFS koji uzimaju LDN nemaju anporemećena aktivnost jonskih kanala TRPM3, što je navodnokarakteristika bolesti (11–13). Zaključno, tretmansa LDN-om omogućava vraćanje funkcije jonskog kanala TRPM3 u ME/CFS pacijenata i stoga ima potencijalni terapeutski učinak.

DISKUSIJA

U ovoj studiji koristili smo patch-clamp za cijelu ćelijutehnika za mjerenje endogenog jonskog kanala TRPM3funkcija u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN. Miizvještaj za prvivrijeme koje imaju pacijenti sa ME/CFS koji uzimaju LDNobnovljene TRPM3-poput jonskih struja u NK ćelijama. Zaista, theprimena PregS-a je omogućila merenje malih jonastruje sa tipičnim TRPM3-kao što je vanjsko ispravljanjeu NKćelije pacijenata koji uzimaju LDN. Pored toga, PregS-evociran jonskistruje kroz TRPM3 su bile značajnemodulirano od straneononetin u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN asslično opisano u HC. Ovi rezultati odražavajunaši prethodni nalaziprijavljivanje obnavljanja funkcije jonskog kanala TRPM3u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS nakonin vitrotretman saNTX (13). Ovi rezultati su također u skladu s našim prethodnimistrage koje sugeriraju da se ME/CFS mogu smatrati akanalopatija izazvana gubitkom funkcije TRPM3 ikarakterizira smanjenje PregS-induciranih jonskih strujakao i otpornost na ononetin u NK ćelijama iz ME/CFSpacijenti (8–13). Gubitak funkcije TRPM3 može biti odgovoranza oštećene Ca2 plussignalizacija i Ca2 plus- posredovane ćelijske funkcije,uključujući imunološke funkcije NK stanica (11–13). Naša sadašnja nova studija je prva in vitrostudija koja potvrđuje efikasnosti terapeutsku koristLDN za pacijente sa ME/CFSkarakterizacijom osnovnih regulatornih mehanizama LDN-atretman koji uključuje TRPM3 i interakciju opioidnih receptorau NK ćelijama. Prethodno je prijavljeno da je LDN koristanzaliječenje raznih bolesti, kao što je multipla skleroza,Crohn'bolest, fibromijalgija, rak, inflamatornicrijevabolest i ME/CFS (40–44). Preciznije, upreliminarna studija koju su proveli Polo et al. o sigurnosti iefikasnost LDN tretmana, 73,9 posto pacijenata sa ME/CFSprijavio pozitivan odgovor na liječenje (27). Većina pacijenatadoživjeli poboljšanu budnost/budnost i poboljšani fizičkii kognitivne performanse. Neki pacijenti su prijavili i manji boli groznicu, što pokazuje da LDN može pokazati određeni potencijal zaublažavaju širok spektar simptoma ME/CFS (27). Slično,Bolton i dr. opisao tri izvještaja o slučajevima koje je sastavio ME/CFSpacijenti koji su uzimali LDN i prijavili raspon odgovora,od promjene života do smanjenja samo nekih simptoma (38).

Na osnovu pogodnostipacijenti prijavljuju svoje simptome,LDN tretman se može koristiti kao potencijalni tretman i možeciljati na patomehanizam ME/CFS.Patogeneza ME/CFS je nepoznata, ali je abnormalan jonkanala i još konkretnijeporemećenu funkciju TRPM3 imajunedavno se pojavila kao karakteristična karakteristika bolesti (8–13). Ranije smo prijavili gubitak funkcije TRPM3 nakon togamodulacija sa snažnim TRPM3-agonistima i antagonistima u NKćelije iz tri različite kohorte pacijenata sa ME/CFS (11–13). TRPM3 je opisan kao centralni akter Ca2 plus- zavisne signalne puteve, ekscitabilne i neekscitabilnećelije, gde je Ca2 plussignali pokreću različite ćelijeprocesi (45). Papanikolaou et al, identifikovaniTRPM3 kao anvažna komponenta'Ca2 pluskomplet alata' koji podupire rad u radnjiCa2 plusulazak i održivost Ca2 plussignaliziranjeGlija bijele tvari CNS-a (46). Slično, pokazalo se da TRPM3 vodido povećanja Ca2 plus prilivu beta stanicama pankreasa što rezultiranaknadno oslobađanje inzulina (47). Svaki tip ćelije predstavlja jedinstvensignalni fenotip sposoban za isporuku strogo reguliranihprostorno-vremenski Ca2 plussignale za modulaciju njegove posebne funkcije(48). Posljedično, svaka suptilna disregulacija Ca2 plussignali mogujako utječu na funkcije stanica i rezultiraju bolestima (48, 49). NK ćelije takođe zahtevaju Ca2 plusza efikasnostimulacija ifunkcije uključujući citotoksičnost NK stanica (50–53). KompromitovanoCitotoksična funkcija NK stanica je dobro dokumentirana i dosljednakarakteristika ME/CFS (54). Stoga, gubitak funkcije TRPM3 možedoprinose simptomatologiji ME/CFS utječućiCa2 plussignalizacija i Ca2 plus-posredovane ćelijske funkcije, uključujući NKimunološke funkcije ćelija.Dobro okarakterisana funkcija TRPM3 u literaturi je njegovaulogu u otkrivanju štetne vrućine (akutni bol) kao i upalehiperalgezija (akutna i kronična bol) (14). Sintetiziraju se endogeni opioidiin vivoza modulacijufiziološki analgetski odgovori kod upaleineuropatski bol. Endogeni i egzogeni opioidi se vezuju zaOR, koji se nalaze na periferiji, u presinaptičkim i postsinaptičkimmjesta u dorzalnom rogu kičmene moždine i u moždanom stablu,talamus i korteks, u onome što čini uzlazni bolprenosni sistem (55). Nedavne studije su to objavileopioidni receptori se takođe eksprimiraju od strane imunoloških ćelija za obavljanjeopioidna analgezija posredovana imunim stanicama stvaranjem endogeneopioidni peptidi, koji uključuju Gai/o–Gbg–fosfolipaza C(PLC)–inozitol 1,4,5-trisfosfatni receptor (IP3R)– intracelularnoCa2 plusput. Oslobođeni opioidni peptidi se zatim aktivirajuperiferne neuronske opioidne receptore i ublažavaju bol (21). Također se pokazalo da opioidi direktno moduliraju funkcijelimfociti i druge ćelije uključene u odbranu domaćina iimunitet koji rezultira imunosupresivnim efektima (56, 57). Preciznije, aktivacija OR opioidnim alkaloidima ipeptidi kao što je morfin i endogeni peptidi,uključujući beta-endorfin i dinorfin peptide, što dovodi do asmanjen broj makrofaga, smanjen broj leukocitaproliferaciju i migraciju u inflamatornusajtova, smanjenfagocitotska aktivnost makrofaga, smanjena kemotaksa iproizvodnja superoksida od strane neutrofila i makrofaga,ubrzana apoptoza makrofaga, oslabljena mikrobiološkazaštita i smanjena adhezija leukocita i endotelaćelije (58). Drugi negativni efekti su također opisani uodnosu na mastocite, dendritske ćelije i NK ćelije sa asmanjena citotoksičnost NK stanica i proizvodnja citokina (22, 56, 59, 60). Imunske ćelije, glija i neuroni formiraju stoga anintegrirana mreža koja koordinira imunološke odgovore imodulira ekscitabilnost puteva bola (61). Ciljanje naopioidni receptori na imunim ćelijama mogu dovesti do promjena uimunološke reakcije za promicanje rješavanja inflflammation askao i modulacija bola kod pacijenata sa ME/CFS.Zanimljivo je da su molekuli koji se vežu i aktiviraju opioidreceptore značajnosmanjiti bol ovisan o TRPM3-u. Uodgovor na akutnu aktivaciju agonistima, opioidnim receptorimapar sa Gi/o proteini, koji se disociraju u Gai/o i Gbgpodjedinice za interakciju sa intracelularnim efektorima (62). TRPM3aktivnost je snažno inhibirana aktivacijom µOR krozdirektna interakcija sa Gbgkao TRPM{0}}zavisna Ca2 plusunosi su snažno i reverzibilno inhibirani kada ćelijamembrana jeflflisprano sa prečišćenim Gbg(15–18). NTX je dugotrajanopioidni antagonist posebnoinhibiranjemOR, daklenegirajući inhibitornu funkciju ovog opioidnog receptoraTRPM3 (22, 26). U našoj prethodnoj studiji to smo izvijestiliin vitrotretman sa NTX obnavlja TRPM3 jonski kanalaktivnost u NK ćelijama izolovanim iz ME/CFS (13). Slično, utrenutna studija, NK ćelije izolovane od pacijenata koji su uzimali LDNne pokazuju bilo kakvu oštećenu aktivnost jonskih kanala TRPM3. LDNČini se da tretman kod pacijenata sa ME/CFS obnavlja jon TRPM3funkciju kanala u NK ćelijama, što rezultira Ca2 plussignaleremodeliranje kako bi se doprinijelo obnavljanju integritetai stabilnost specifične za NK ćelijesistemi signalizacije (10–13). Zanimljivo je da je zabilježen efekat antagonizmaNTX uključenmILI također remeti regulaciju negativnih povratnih informacija nadILI, čime se povećavadOR funkcija.

Enhancement ofdILIaktivnost potiče citotoksičnost NK ćelija kao odgovor na beta-endorfine in vitrona splenocitima štakora, što ukazuje na potencijalupotreba NTX-a u liječenju imunodeficijencije (63). Mehanizam koji leži u osnovi LDN-a's efikasnostza umor,Crohn'bolest, fibromijalgijai multipla skleroza, dakle,uključuje povremenu blokadu opioidnih receptora praćenuCa2 plus zavisna proizvodnjai regulacija endogenihopioidi. Ludwig et al. izvijestio je da je serum [Met5 ]-enkefalinnivoi su bili niži kod ljudi sa multiplom sklerozom u odnosu napacijenata koji nisu oboljeli od multiple skleroze, a LDN im je vratio nivoe.Slično, kod eksperimentalnih miševa s autoimunim encefalomijelitisom,[Met5 Nivoi ]-enkefalina su bili smanjeni prije pojavekliničke bolesti i obnovljeni su LDN tretmanom(28). Stoga se čini da LDN tretman rezultirapojačanje analgetskih efekata i može biti relevantno uME/CFS, gdje je nedovoljnoutiče na lučenje opioidnih peptidaimunološki odgovor ili kontrola bola (29, 30), ili oslobađanje proinflamatornihcitokini (25, 31). Zaista, smanjeni beta-endorfinikoncentracija je prijavljena u ME/CFSpacijenti koji pate od poremećaja termoregulacijereakcije i generalizirani teški ili dugotrajni bol (64). U zaključku, ova studija je prvavreme procenjeno i identifikovanoefekat LDN-a na funkciju jonskog kanala TRPM3 uNK ćelije kod pacijenata sa ME/CFS. Ova nova studija izvještava otemeljna obnova kanala TRPM3-opioidnog receptorainterakcija u NK ćelijama pacijenata sa ME/CFS koji uzimaju LDN.Štaviše, široka distribucija TRPM3 jonskih kanala utijelo sugerira da njihova ugrožena funkcija može doprinijetiznakove i simptome ME/CFS i stoga liječenje sLDN može imati terapeutsku ulogu. Konačno, ova studija služi dapodržavaju planiranje i odobravanje potencijalnih randomiziranihkliničke studije o ulozi i dozi NTX-a u liječenju ME/CFS pacijenti.