Dio ⅠMetaboličko razumijevanje genetske disregulacije u mikrookruženju tumora karcinoma bubrega bubrega

Abstract

Metabolička disregulacija je obilježje karcinoma uključujući KIRC, posebno uzrokovano promjenama u metaboličkim genima. Trenutno postoji nedostatak konsenzusa između metaboličkih potpisa u mikrookruženju tumora. U ovoj studiji, uočili smo značajne korelacije diferencijalno eksprimiranih metaboličkih gena (DEmGs) između KIRC-a i srodnih normalnih uzoraka. Ukratko, prikupili smo skupove metaboličkih gena putem RNA-seq podataka KIRC-a i normalnih tkiva iz TCGA, nakon čega je slijedila identifikacija DEmG-ova povezanih s KIRC-om. Zatim su pacijenti razvrstani u tri klastera, a pomoću WGCNA smo identificirali metaboličke gene uključene u preživljavanje među različitim klasterima.

Nadalje, istraživali smo preživljavanje i kliničke parametre zajedno s imunološkom infiltracijom u klasterima. Istovremeno smo konstruisali i potvrdili model predviđanja zasnovan na ovim DEmG. Ove analize su otkrile da su pacijenti sa visokom ekspresijom DEmGs pokazali slabo preživljavanje, dok je infiltracija manje imunih ćelija povezana sa metastazom KIRC-a. Na kraju smo identifikovali NUDT1 kao hub gen jer je pokazao značajno visoku ekspresiju u KIRC uzorcima, kao i povezan sa preživljavanjem i prognozom pacijenata. Dalja analiza je otkrila onkogenu ulogu NUDT1 u 786-O i ACHN ćelijama. Stoga zaključujemo da bi NUDT1 mogao biti potencijalni dijagnostički i prognostički marker za KIRC.

Ključne riječi

Metabolička disregulacija; Diferencijalno izraženi metabolički geni (DEmGs); Stopa preživljavanja; NUDT1;Cistanche koristi.

Kliknite ovdje da saznateCistancheovi efekti

Uvod

Karcinom bubrega bubrega (KIRC) je vrsta karcinoma bubrežnih ćelija (RCC), koji se smatra jednim od uobičajenih karcinoma koji čini 70-80 posto slučajeva [1], rangiran kao 16. najčešći uzrok smrtnosti od raka. širom svijeta [2]. Karcinom bubrežnih ćelija (RCC) je najčešći tip raka bubrega i čini 90 posto slučajeva raka bubrega [3]. Nedavno se široko koristi identifikacija potencijalnih markera kod karcinoma zasnovana na bioinformatici, ali je identifikovano samo nekoliko pouzdanih biomarkera KIRC-a ili većina markera do sada nije u potpunosti validirana. Stoga su bioinformatičke analize zajedno s eksperimentalnim validacijama neophodne da bi se razjasnio potencijalni mehanizam biogeneze i progresije KIRC-a [4]. Duboko istraživanje mikrookruženja tumora i razvoj imunoterapije omogućili su proučavanje interakcije između tumora i imunološkog sistema [5]. Ipak, mnogi od identificiranih biomarkera nisu proučavani zbog njihovog učinka na ćelijski fenotip i odgovarajuće molekularne mehanizme u KIRC-u [6]. Međutim, prognoza KIRC pacijenata je slabo shvaćena i ukupno 5-godišnje preživljavanje je manje od 10 posto nakon prve dijagnoze [7, 8]. Generalno, normalna tkiva pretežno sadrže visoke nivoe antiangiogenih faktora. Poremećaj nivoa ovih faktora može aktivirati proangiogene faktore koji dalje povećavaju deobu ćelija abnormalnom brzinom što dovodi do formiranja tumora [9]. U ovom procesu tumorske ćelije eksprimiraju visok nivo proangiogenog faktora rasta i ovaj efekat podržava razvoj novih krvnih sudova u tumorima [10]; tako počinje razvoj tumora. Dakle, mnogi drugi faktori su uključeni u tumorigenezu, uključujući infiltraciju imunih ćelija i ekspresiju različitih metaboličkih gena. Dobro je poznato da prisustvo različitih tipova imunih ćelija u mikrookruženju tumora u velikoj meri utiče na progresiju tumora i imunoterapiju; stoga, promjene gena povezanih s imunitetom također utiču na proporciju i funkciju imunoloških ćelija u mikrookruženju tumora [11]. Na primjer, infiltracija imunih stanica u mikrookruženje tumora značajno utiče na razvoj glioma [12]. Unatoč nedostatku interesa za metaboličke gene koji utiču na rak, trenutne studije su obnovile tu svijest o raku kao metaboličkom poremećaju [13, 14]. Ove studije pružaju osnovu za uključivanje metaboličkog reprograma kao novog obilježja maligne transformacije [15]. Međutim, ekspresija svih metaboličkih gena ili puteva između različitih tkiva, uključujući tumore i normalna tkiva, razlikuje se jedna od druge i uglavnom je neistražena, posebno u KIRC-u.

Sveukupno, postoji manji broj pouzdanih biomarkera dostupnih za predviđanje prognoze i imunoterapijskih odgovora u KIRC-u; stoga je teško postići potpuni klinički uspjeh. Stoga, sveobuhvatne bioinformatičke studije zajedno s eksperimentalnim validacijama mogu razjasniti potencijalne mehanizme biogeneze i progresije KIRC-a. Stoga je sadašnja studija usmjerena na sveobuhvatnu procjenu efekata metaboličkih puteva na metaboličke transkripcione profile u KIRC-u u poređenju sa njihovim normalnim tkivima. Ovdje smo uspješno ne samo odvojili različita mjesta bolesti ili različite molekularne podtipove iste bolesti, već smo i predvidjeli odgovor na terapiju usmjerenu na metabolizam. Ovo predstavlja novi način identifikacije mehanizma kojim se metabolički putevi poremete u malignomu i nudi nove mete za kliničke intervencije.

Standardized Cistanche

Materijal i metode

1. Prikupljanje podataka.

Podaci o sekvenciranju RNK (FPKM) relevantni za KIRC direktno su preuzeti iz Atlasa genoma raka (TCGA). Nakon toga, podaci su obrađeni prema željenim nizvodnim aplikacijama. Osim toga, kliničkopatološki podaci za odgovarajuće KIRC pacijente, uključujući spol, rasu, starost, lokaciju tumora, histološku klasifikaciju, stepen diferencijacije, stadijum tumora i informacije o preživljavanju, dobijeni su od UCSC Cancer Browser. Da bi se stekao uvid u metaboličku heterogenost KIRC pacijenata, skupovi metaboličkih gena su uzeti iz prethodnih publikacija [16, 17]. Grafički sažetak ove studije prikazan je na Dodatnoj slici 1, a detaljan radni tok prikupljanja podataka i studija procesa nizvodno prikazan je na Dodatnoj slici 2.

2. Identifikacija diferencijalno izraženih metaboličkih gena (DEmGs).

Skupovi metaboličkih gena su identificirani ukrštanjem dva skupa podataka i korišteni za DEG analizu između tumorskih i normalnih uzoraka. Kasnije smo takođe identifikovali DEmG koristeći WGCNA, a na osnovu načina preživljavanja, pacijenti su ih klasifikovali u tri klastera. Ukratko, pacijenti su podijeljeni u tri klastera i to klaster C1, klaster C2 i klaster C3. Za identifikaciju DEG-ova korišteni su linearni modeli korištenjem R paketa limma. Stopa lažnog otkrivanja (FDR) prilagođena p-vrijednost < 0.05 u kombinaciji sa istovremenom apsolutnom vrijednošću log2 puta promjene, logFC > 1 i logFC < −1 postavljeni su kao prag za identifikaciju DEG. Vulkanske karte su napravljene pomoću ggplot2. Geni sa logFC > 1 smatrani su visokoregulisanim, a oni sa logFC < -1 su dodijeljeni kao niskoregulirani geni.

3. Analize funkcionalnog obogaćivanja i interakcija protein-protein.

Analize obogaćivanja GO i KEGG terminima izvedene su kroz R paket Cluster profil. GO termini su podijeljeni u tri kategorije uključujući molekularne funkcije (MF), ćelijske komponente (CC) i biološke procese (BP). Da bismo utvrdili značajne razlike i korelacije DEmG između tumora i normalnog tkiva, koristili smo kompjuterski softver GSEA (gene set enrichment analysis). KEGG i GO (Gene Ontology) analize obogaćivanja DEG-a su izvršene da bi se identifikovali potencijalni putevi i funkcije. Nadalje, aplikacija cistoskopa je korištena za konstruiranje mreže protein-protein interakcije (PPI) DEmG. Početni PPI je dobiven iz STRING baze podataka. Najviša granica pouzdanosti je postavljena na 0.9.

4. Analiza preživljavanja.

Diferencijalno ekspresirani geni kod pacijenata sa karcinomom bubrega identifikovani su kroz limma paket, a različito eksprimirani geni su analizirani korišćenjem WGCNA paketa za koekspresiju, da bi se konstruisala koekspresiona mreža koja je identifikovala ukupno 6 modula.=5 i mreža je mreža bez razmjera. Prognostički značaj DEmG identifikovanih od strane WGCNA u režimu preživljavanja određen je Kaplan-Meierovim (KM) dijagramima sa testom log ranga.

Cistanche pilule

5. Analiza imunološke infiltracije.

Imune i stromalne ćelije su izračunate korištenjem R paketa, "xCELL; " uzorci sa p < 0:05 su odabrani za dalju analizu. Nadalje, imunološke ćelije koje sadrže biološke markere analizirane su R paketom GSVA. Štaviše, da bismo analizirali čistoću tumora, koristili smo algoritam ESTIMATE za procjenu stromalnih i imunoloških rezultata serije KIRC tkiva.

6. Konstrukcija modela predviđanja.

Diferencijalno eksprimirani metabolički geni su dobijeni iz podataka sekvenciranja RNA KIRC tumora s informacijama o preživljavanju, a pacijenti su nasumično podijeljeni u grupe za obuku i testiranje koristeći R paket "caret;" zatim je izvršena univarijantna analiza preživljavanja na DEmGs. Nadalje, LASSO analiza je izvedena pomoću R paketa "glmnet;" a za optimizaciju modela predviđanja korišten je postupno proporcionalni model opasnosti.

7. Ćelijska kultura.

Ćelijske linije karcinoma bubrega kod ljudi 786-O i ACHN kupljene su od American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, SAD). 786-O ćelijske linije su uzgajane u mediju RPMI 1640 (kat. br. 11875093, Invitrogen, Carlsbad, CA, Sjedinjene Države) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (kat. br. 04-001- 1ACS, Biological Industries, Izrael). ACHN ćelijske linije su uzgajane u MEM mediju (kat. br. 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, Sjedinjene Države) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma. Sve kulture su inkubirane na 37 stepeni C i 5 posto CO₂u vlažnom inkubatoru.

8. Kvantitativni PCR u realnom vremenu.

Ukupna RNK iz KIRC ćelijskih linija i tkiva izolovana je upotrebom TRIzola (kat. br. 9109; TaKaRa, Tokio, Japan) prema protokolima proizvođača. RT-qPCR je izveden korišćenjem QuantiNova SYBR Green PCR kompleta (kat. br. 208054, QIAGEN, Duesseldorf, Nemačka). Relativna ekspresija gena izračunata je pomoću 2^−ΔΔCtmetoda. Sekvence prajmera navedene su u dodatnoj tabeli 1.

9. Test vitalnosti ćelije.

Citotoksičnost nakon transfekcije NUDT1 siRNA u 786-O i ACHN određena je pomoću testa Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (kat. br. C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Kina). NUDT1 siRNA sekvence su date u Dodatnoj tabeli 1. Sintetizovane su od GenePharma (Šangaj, Kina). Ukratko, obje ćelijske linije 786-O i ACHN u logaritamskoj fazi rasta (24 h nakon transfekcije siRNA) su sakupljene i raspoređene u 96-ploče za ćelijsku kulturu (1000 ćelija/bažirić). Sljedećeg dana, 10 ul CCK-8 je dodano u svaki bunar. Nakon inkubacije na 37 stepeni C tokom naredna 2 h, optička gustina (OD) na 450 nm ćelija je detektovana pomoću čitača mikroploča (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornija, SAD).

10. Test migracije ćelija, invazije i apoptoze.

KIRC ćelije {{0}}O i ACHN su transficirane radi uništavanja NUDT1 posredovanog siRNA. Nakon 24 h od transfekcije, ćelije su posađene u ploče 6-jažica za analizu zacjeljivanja rana. Nakon što su ćelije postigle 100 posto spajanja, rane su nastale u ćelijama kao monosloj pomoću plastičnog vrha pipete. Ćelije su zatim isprane sa PBS i kultivisane još 48 h. Udaljenost zatvaranja rane vizualizirana je mikroskopom i fotografirana za mjerenje efekta NUDT1 nokdauna na KIRC 786-O i ACHN ćelije. Ćelijska migracija i invazija su izvedene pomoću transwell 24-bunastih ploča (Corning, New York, NY). Ukratko, jednak broj ćelija je kultivisan u medijumu bez FBS u gornjoj komori, a migracija ćelija je primećena u donjoj komori transbunara gde je medij dopunjen sa 10 procenata FBS. Transwell komore su pažljivo isprane i obojene sa 0,2 posto kristalno ljubičaste boje, vizualizirane i fotografirane; kasnije, razlike između migriranih ćelija između negativne kontrole i NUDT1 nokdauna su određene jednostavnim brojanjem ćelija. Test apoptoze je izveden nakon 72 h od transfekcije, ćelije su sakupljene, isprane i resuspendirane u ledeno hladnom PBS-u. Ćelije su zatim detektovane kompletom za detekciju apoptoze (kat. br. KGA1013, KeyGen BioTech, Nanjing, Kina) prema uputstvima proizvođača i ispitane protočnom citometrijom (FACScan; BD Biosciences). Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka.

11. Statistička analiza.

Sve statističke analize su rađene na GraphPad prizmi (V7.0) i R (3.6.4), Wilcox test je korišten za poređenje infiltracije imunih stanica u normalno i tumorsko tkivo, a hi-kvadrat test je urađen za proučavanje korelacije između infiltracije imunoloških stanica i patoloških parametara. Analiza varijanse je korištena za poređenje imunološkog skora, stromalnog skora i čistoće tumora između tri klastera. Za analizu preživljavanja, p-vrijednost je izračunata pomoću log-rank testa. P-vrijednost od<0.05 was considered statistically significant.

Cistanche suplementi

Reference

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai, et al., "Klinički uticaj ciljanih terapija kod pacijenata sa metastatskim karcinomom renalnih ćelija čistih ćelija", Oncotargets and Therapy, vol. 7, str. 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal i F. Bray, "Međunarodne varijacije i trendovi incidencije i mortaliteta karcinoma bubrežnih ćelija", European Urology, vol. 67, br. 3, str. 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem, et al., "Smjernice Evropskog udruženja urologije o karcinomu bubrežnih ćelija: ažuriranje za 2019.", European Urology, vol. 75, br. 5, str. 799–810, 2019.

[4] W. Zheng, S. Zhang, H. Guo, et al., "Multi-omička analiza karakteristika tumorske angiogeneze i potencijalnih mehanizama epigenetske regulacije u karcinomu renalnih bistrih ćelija," Ćelijska komunikacija i signalizacija: CCS, vol. 19, br. 1, str. 39, 2021.

[5] J. Galon i D. Bruni, "Pristupi liječenju imunih vrućih, izmijenjenih i hladnih tumora kombinovanim imunoterapijama", Nature Reviews Drug Discovery, vol. 18, br. 3, str. 197–218, 2019.

[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris et al., "HIF pokreće taloženje lipida i rak u ccRCC preko represije metabolizma masnih kiselina", Nature Communications, vol. 8, br. 1, str. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward, et al., "Cancer statistics, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, vol. 58, br. 2, str. 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajković, M. de Martino, i SF Shariat, "Erratum: Rodne razlike u incidenci i ishodima raka urotela i bubrega", Nature Reviews Urology, vol. 12, br. 12, str. 653, 2015.

[9] IJ Fidler, "Angiogeneza i metastaze raka", Cancer Journal, vol. 6, dodatak 2, str. S134–S141, 2000.

[10] C. Kut, F. Mac Gabhann i AS Popel, "Gdje je VEGF u tijelu? Meta-analiza distribucije VEGF-a kod raka," British Journal of Cancer, vol. 97, br. 7, str. 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao, et al., "Profiliranje imunološke infiltracije kod raka želuca i njihove kliničke implikacije", Cancer Science, vol. 112, br. 9, str. 3569–3584, 2021.

[12] X. Ge, Z. Wang, R. Jiang et al., "SCAMP4 je novi prognostički marker i povezan je sa progresijom tumora i imunološkom infiltracijom u gliomu," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol. 139, 2021.

[13] MG Vander Heiden i RJ DeBerardinis, "Razumijevanje ukrštanja između metabolizma i biologije raka", Cell, vol. 168, br. 4, str. 657–669, 2017.

[14] DS Wishart, "Da li je rak genetska bolest ili metabolička bolest?" biomedicina, vol. 2, br. 6, str. 478-479, 2015.

[15] D. Hanahan i RA Weinberg, "Obilježja raka: sljedeća generacija", Cell, vol. 144, br. 5, str. 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar, et al., "Molekularna karakterizacija i klinička relevantnost podtipova metaboličke ekspresije kod karcinoma kod ljudi", Cell Reports, vol. 23, br. 1, str. 255–269.e4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, et al., "Genomske promjene leže u osnovi metaboličke promjene pan-kancera povezane s hipoksijom tumora", Genome Biology, vol. 17, br. 1, str. 140, 2016.

Junwei Xie,1,2,3,4,5 Lingang Cui,6 Shaokang Pan,1,2,3,4,5 Dongwei Liu,1,2,3,4,5 Fengxun Liu,1,2,3,4 ,5 i Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 Odsjek za nefrologiju, Prva pridružena bolnica Univerziteta Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Kina

2 Istraživački institut za nefrologiju, Univerzitet Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Kina

3 Istraživački centar za bubrežne bolesti, Zhengzhou, 450052 Henan, Kina

4 Ključna laboratorija za preciznu dijagnozu i liječenje kronične bubrežne bolesti u provinciji Henan, Zhengzhou 450052, Kina

5 Osnovna jedinica Nacionalnog kliničkog medicinskog istraživačkog centra za bubrežne bolesti, Zhengzhou 450052, Kina

6 Odsjek za urologiju, Prva pridružena bolnica Univerziteta Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Kina