Dio 1: Ekstrakti Cistanche Deserticola mogu antagonizirati imunosenescenciju i produžiti životni vijek kod miševa sklone starenju 8 (SAM-P8)

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang,1 Xu Ma,1 Wenjun He,1 Haixia Li,1 Shuyan Han,1 Yong Jiang,1

Hounan Wu, 2 Li Han, 3 Tomohiro Ohno, 3 Nobuo Uotsu, 3 Kohji Yamaguchi, 3 Zhizhong Ma, 1,4 i Pengfei Tu1

1 Department of Natural Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, China

2 Medicinski i zdravstveni analitički centar, Univerzitet u Pekingu, br. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Kina

3 Fakultet za fundamentalna istraživanja, Fancl Research Institute, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Japan

4 Odeljenje za integraciju tradicionalne kineske i zapadne medicine, Fakultet osnovnih medicinskih nauka, Univerzitet u Pekingu, br. 38 Xueyuan Road, Peking 100191, Kina

Prepisku treba uputiti na Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn i Pengfei Tu; pengfeitu@bjmu.edu.cn Primljeno 19. jula 2013.; Revidirano 23. oktobra 2013.; Prihvaćeno 11. novembra 2013.; Objavljeno 9. januara 2014.; Akademski urednik: Adair Santos

1. Uvod

Cistanche deserticola, jedan od najpopularnijih tradicionalnih kineskih biljnih lijekova/zdravstvenih proizvoda, opisan je u brojnim povijesnim kineskim biljnim farmakopejama kao da ima svojstva protiv starenja. Zbog toga se u Kini naširoko koristi za liječenje različitih poremećaja povezanih sa starenjem, uključujući senilnu demenciju, impotenciju, neplodnost, kronične infekcije i hematopoetske poremećaje kod starijih [1]. Savremeni hemijski pristupi omogućili su da se dva glavna tipa jedinjenja, feniletanoidni glikozidi i oligosaharidi, izoluju kao glavni aktivni sastojci Cistanche deserticola [1]. U posljednjoj deceniji, Cistanche deserticola i njeni ekstrakti su intenzivno proučavani i dokazano je da su sposobni zaštititi neurone od ozljeda uzrokovanih neurotoksinima[2], inhibirati hepatotoksičnost uzrokovanu tetrahloridom ugljika [2] i promovirati oporavak stanica koštane srži iz Oštećenja izazvana zračenjem [3]. Također se pokazalo da ima protuupalno, antioksidativno i anti-age djelovanje [4]. Međutim, može li Cistanche deserticola produžiti životni vijek i koji su temeljni molekularni mehanizmi [3] povezani sprotiv starenjasvojstva nisu rigorozno ispitana.

Ekstrakti Cistanche deserticola protiv starenja

Imunosenescencija, odnosno promjena imunološkog sistema sa godinama, čini pozadinu na kojoj je zabilježena povećana osjetljivost na infekcije, rak, neurodegenerativne bolesti i autoimune bolesti kod starijih [5]. Izvještava se da su terapeutske intervencije, kao što su ograničenje kalorija [6] i suplementacija vitaminom E, učinkovite u odgađanju progresije imunosenscencije, a time i smanjenju morbiditeta od nekih bolesti povezanih sa starenjem, kao i produžavanju životnog vijeka ljudi i glodavaca. [7, 8]. Međutim, istraživanja u ovoj oblasti su komplikovana činjenicom da je starenje povezano sa paradoksom istovremenog imunodeficijencije i hronične upale [9]. To znači da jednostavna stimulacija proliberacije limfocita ili anti-inflamacija ne predstavlja idealnu terapijsku intervenciju u borbi protiv starenja i stanja povezanih sa starenjem [10]. Shodno tome, u potrazi za medicinskim intervencijama koje mogu spriječiti ili ublažiti stanja povezana sa starenjem, uključujući infekcije, rak, autoimune bolesti, aterosklerozu i neurodegenerativne bolesti koje su vodeći uzroci smrti i invaliditeta, te popravak defekata imunološkog sistema mora biti praćena inhibicijom upalne reakcije.

Miš sa ubrzanim starenjem [11] je inbred model miša, izveden iz AKR/J soja, koji se široko koristi u studijama starenja. Podsoj P8 (SAM-P8) ovih miševa ima značajno skraćen životni vek u poređenju sa podsojom R1 (SAM-R1), koji takođe pokazuje sporiji proces starenja [12]. Paralelno sa svojim preranim starenjem, SAM-P8 miševi također pokazuju povećano neurološko starenje, imunosenescenciju i hematopoetske deficite povezane sa starenjem koji blisko oponašaju tipične karakteristike ljudskog starenja [13, 14]. Analiza temeljnih mehanizama odgovornih za ubrzani proces starenja i poremećaje povezane sa starenjem ukazuje da se čini da su uključeni mitohondrijalna disfunkcija [15], oksidativni stres i povećana stopa mutacije somatske DNK [16, 17]. Ovaj mišji sistem, sa svojom homogenom genetskom pozadinom, stoga, pruža odličan eksperimentalni model za proučavanje starenja i terapeutika protiv starenja [12] pohranjenih u herbarijumu Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Pekingu, Kina.

cistanche može protiv starenja

2. Materijali i metode

2.1. Materijali.

SvežeCistanche deserticola YC MAprikupljen je iz različitih područja na sjeverozapadu Kine, uključujući autonomne regije Xinjiang, Neimenggu i Ningxia. Uzorke korištene za pripremu ekstrakata potvrdio je profesor Pengfei Tu, specijalista farmakognozije na Odsjeku za prirodne lijekove Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Pekingu. Korišteni vaučerski primjerak Cistanche deserticola (broj CD-2007-03-08) imao je Naučni centar (Peking, Kina). Ovu studiju je odobrio Komitet za istraživanje životinja Univerziteta Peking i sprovedena je u skladu sa smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja na Univerzitetu u Pekingu. Sertifikacijski broj ovih miševa bio je SCXK2001-2008. Miševi su držani u standardnim metaboličkim kavezima u okolišu

C, 45–60 posto vlažnosti i 12 h ciklusa svjetlo/mrak) i omogućio slobodan pristup hrani i vodi. Nakon 2 sedmice aklimatizacije, životinje su podijeljene u pet grupa: 3 ECD tretirane grupe, SAM-R1 kontrolna grupa i SAM-P8 kontrolna grupa bez tretmana. Dijeta 3 tretirane grupe je dopunjena ishranom pomiješanom s različitim koncentracijama ECD-a: prinos malih (50 mg/kg), srednjih (150 mg/kg) i visokih (450 mg/kg) prosječnih doza ECD-a dnevno . Kontrolne grupe SAM-R1 i SAM-P8 bez tretmana hranjene su istom ishranom bez ECD. Merenje unosa hrane kod svih životinja je vršeno svaka tri dana tokom eksperimenta. Krvni pritisak i srce mjeseci za vrijeme trajanja eksperimenta kako bi se utvrdilo zdravstveno stanje miševa. Životni vijek svakog miša bio je Viable apoptotski i nekrotični limfociti su kvantificirani korištenjem Annexin V-FITC kompleta (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Peking, Kina). Limfociti su podvrgnuti dvostrukom bojenju sa fluorescein izotiocijanatom konjugiranim obilježenim aneksinom V (Annexin V-FITC) i suspendirani propidom u 200 ul pufera za vezivanje (10 mM HEPES/NaOH,

2.2 Priprema ekstrakta Cistanche deserticola (ECD) i HPLC analiza.

Na zraku sušena i narezana Cistanche deserticola(2.0 kg) je u prahu i ekstrahovan dva puta sa 70% etanolom po 1 sat. Korišteni omjeri biljka/etanol bili su 1/6 (w/w) u prvoj ekstrakciji i 1/4 (w/w) u drugoj. Dva ekstrakta su kombinovana i filtrirana pre nego što su koncentrisana do relativne gustine od 1,10-1,15 pod sniženim pritiskom na 60 C. Ovaj koncentrat je zatim osušen u vakuumu i dobijeni prah je bio ekstrakt Cistanche deserticola (ECD) koji se koristio tokom ove studije. .

Komponente ECD-a su analizirane pomoću HPLC kao što je prethodno opisano [1]. Ukratko, 100 mg ECD praha je otopljen u 10.0 mL H2O i nakon filtracije ubrizgan u HPLC. HPLC analiza je izvedena na sistemu tečne hromatografije Agilent 1100 (Agilent Co., USA). Mobilna faza se sastojala od mešavine metanola (A) i 0,10 procenata metanoične kiseline (B). Korišten je program hromatografije sa gradijentom; ovo je bilo 26,5 posto (A) i 73,5 posto (B) za 0–7 minuta, 26,5–29,5 posto (A) i 73,5–70,5 (B) za 8–10 minuta i 29,5 posto (A) i 70,5 posto (B ) za 20–27 min. Brzina protoka je održavana konstantnom na 1,0 mL/min, volumen ubrizgavanja je bio 10 mL, a temperatura kolone je održavana na 25 C. UV detektor postavljen na 330 nm je korišten za praćenje izlaza kolone i generiranje hromatograma.

Osušena i narezana Cistanche deserticola

Feniletanoidni glikozidi i oligosaharidi cistanheidentificirani su na osnovu vremena retencije i spektra apsorpcije. Kvantifikacija je izvršena eksternim standardnim kalibracionim krivuljama. Prinos odekstrakti Cistanche deserticola(ECD) iznosio je oko 3,33 posto, a sadržaj feniletanoida 17,94 posto. Akteozid i ehinakozid su bili dva glavna sastojka u ovoj frakciji, sa njihovim sadržajem od 3,80 posto i 8,25 posto, respektivno. Oligosaharidi čine 82 posto ukupnog ECD-a. Koncentracije glavnih aktivnih komponenti ECD-a prikazane su u tabeli 1.

2.3 Analiza životnog vijeka životinja.

Ova studija se fokusirala na istraživanje da liekstrakti Cistanche deserticolamogu produžiti životni vijek miševa SAM-R1 kupljeni su od laboratorijskog uzgoja i istraživačkog centra za laboratorijsko istraživanje životinja Univerziteta u Pekingu za zdravlje miševa SAM-P8 i poništiti njihov imunološki status.

2.4. Statistička analiza.

Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti SD Poređenja između različitih grupa su rađena jednosmjernom ANOVA-om sa post hoc testom. U studiji o životnom vijeku, podaci su podvrgnuti Kaplan-Meierovoj analizi preživljavanja, koja je uključivala korištenje i Log-rank (Mantel-Cox) i Gehan-Breslow-Wilcoxon testa. Statistička analiza je provedena korištenjem Statističkog paketa za društvene nauke za Windows (SPSS, fiziološki rastvor fosfatnog pufera (PBS, pH 7,4) koji sadrži 0.01 posto natrijum azida i podvrgnut FCM analizi. Subpopulacije limfocita analizirane su protokom citometrija pomoću protočnog citometra FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, SAD) i softvera za analizu BD CellQuest. Chicago, IL) i a da bude značajno.

Feniletanoidni glikozidi i oligosaharidi cistanhe

3. Rezultati

Razmatrana je vrijednost manja od 0.05.Procjena ćelijske vitalnosti perifernih T limfocita pomoću aneksina V-FITC i PI dvostrukog bojenja i FACS analize. Nakon dodavanja ishrani miševa SAM-P8 sa tri doze ECD-a tokom 4 nedelje, životinje su pričvršćene na 12 sati, a zatim anestezirane, a krv je sakupljena i analizirana.

3.1. Analiza potencijalnih aktivnih komponenti u ekstraktima Cistanche deserticola (ECD). Kao što je prikazano u tabeli 1, ECD se sastoji uglavnom od dva tipa jedinjenja, feniletanoidnih glikozida i oligosaharida. U feniletanoidnim glikozidima identifikovani su ehinakozid, akteozid i 8-epiloganska kiselina, dok je u oligosaharidima identifikovan samo galaktitol.

3.2.UtjecajCistanchedeserticolakbdO4ct na prosječni životni vijek SAM-P8 miševa. Za ovu i naredne studije, osmomjesečni mužjaci SAM-P8 miševa podijeljeni su u 4 grupe. Među njima, jedna grupa miševa hranjena je normalnom ishranom bez ECD, ostale 3 grupe su zasebno unosile hranu koja sadrži različite proporcije ECD. Kao kontrolna grupa u svim eksperimentima korišćeni su miševi iz podsvoja SAM-R1, koji imaju nenormalan proces starenja i životni vek.

U poređenju sa kontrolnom SAM-R1 grupom, prosečan životni vek SAM-P8 miševa je značajno skraćen (Slika 1(a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Preokretanje imunosenscencije kod SAM-P8 miševa pomoću ekstrakta Cistanche deserticola (ECD). Smanjenje perifernih naivnih T limfocita i istovremeno povećanje perifernih memorijskih T limfocita su istaknute karakteristike imunosenescencije koje se široko smatraju glavnim osnovnim razlozima imunoloških abnormalnosti povezanih sa starenjem. Ova imunosenscencija u SAM-P8 u odnosu na SAM-R1

aniftalsv0izuzetno evidentno kada je FACS analiza trebalo da nabroji (CD3 plus CD44wCD4Bigh) limfocite kao indikator naivnih T ćelija i (CD3 plus CD44gh CD45 BR limfocite bez indikatora memorijskih T-ćelija. Dakle, u perifernoj krvi Slika 2) i stanica slezene (Slika 3) populacija smanjeni nivoi naivnih T ćelija i povećani nivoi memorijskih T ćelija su uočeni kod miševa SAM-P8. Utvrđeno je da suplementacija ishrane miševa SAM-P8 sa ECD može da preokrene ove indikatore imunosenescencije u dozi- zavisan način u populaciji periferne krvi (Slika 2) i ćelija slezene (Slika 3). Kao dodatni indikator preokreta imunosenscencije suplementacijom ECD ishranom, nivo prirodnih ćelija ubica [18], glavni ćelijski marker urođenog imunog sistema Ovo je pokazalo da suplementacija ECD ishranom dovodi do dozno-ovisnog povećanja NK(CD3 plus CD49 plus )ćelija u populaciji limfocita u perifernoj krvi (Slika 4) i ćelijama slezene (Slika 5).

3.4. Ekstrakti Cistanche deserticola jačaju intenzitet relativne fluorescencije Sca-1 pozitivnih ćelija kod SAM-P8 miševa. Antigen matičnih ćelija-1(Sca-1) je jedan od najistaknutijih biomarkera hematopoetskih matičnih ćelija (HSC) u populacijama ćelija koštane srži. Sca-1 pozitivne ćelije takođe predstavljaju limfocitne progenitore koji imaju novoizvezene iz koštane srži u perifernu krv gdje se podvrgavaju.

Slika 2: FACS analiza uticaja dijetetskih suplemenata sa ECD naivom i memorijom Tlimfociti u perifernoj krvi. Osmomesečni mužjaci SAM-P8 i kontrolni SAM-RI miševi su podeljeni u 5 grupa. 3 tretirane grupe životinja SAM-P8 hranjene su četiri sedmice ishranom dopunjenom niskim (100 mg/kg), srednjim (500 mg/kg) i visokim (2500 mg/kg) dozama ECD, a dvije kontrolne životinje

gatingon CD3 plus Tcels. Linija pokazuje pragove koji se koriste za razlikovanje CD44x* i CD45 koji se koriste za totalnu nisku identifikaciju naivnih (CD3 plus Cp b"C4RB→) i memorijskih (CD3 plus CD4hCD 4Bl) T-ćelija. b) Histogram koji pokazuje grupe su hranjene na istoj ishrani bez suplementacije. Nakon 12 sati gladovanja, periferna krv je sakupljena od anesteziranih životinja RB Tcell subsets i podvrgnuta FACS analizi, sve kako je opisano u Odjeljku 5. (a) Reprezentativni FACS grafikoni različitih grupa mića su generirali postotak naivnih T ćelija u perifernoj krvi različitih grupa životinja (c) Histogram koji pokazuje postotak memorijskih T ćelija u perifernoj krvi različitih grupa životinja. Crtice predstavljaju srednju vrijednost±SD (u svakoj grupi,=10).<0.05sam-p8versus>

Slika 3: FACS analiza efekta dijetetskih suplemenata sa ECD onnaivnim i memorijskim Tlymphocytes inslezene. Osmomjesečni mužjaci SAM-P8 i kontrolni SAM-RI miševi su podijeljeni u 5 grupa. 3 tretirane grupe životinja SAM-P8 hranjene su četiri sedmice uz dodatak ishrane sa niskim (100mg/kg), srednjim (500mg/kg) i visokim (2500mg/kg) dozama ECD i dvije kontrolne grupe životinja putem gatinga CD3 plus T ćelija. Linije prikazane na svakoj grafici ukazuju na to da treba koristiti za razlikovanje CD44zh i CD45 bw koji se koriste da bi se omogućila identifikacija naivnih (CD3 plus CD "CsRB动)" i memorije (CD3 plus CD42CD I'm) Tcels. (b) Prikazi histograma su hranjeni na ista dijeta bez dodataka Nakon 12 sati gladovanja, limfociti slezene su sakupljeni od anesteziranih podskupina RB T ćelija životinja i podvrgnuti FACS analizi, sve je opisano u Odjeljku 5. (a) Reprezentativni FACS dijagrami različitih grupa generiranih mikrofona.

Slika 4: Efekti ECD dodataka ishrani na ćelije prirodnih alkilera (NK ćelije, CD3 plus CD49 plus T ćelije) u populaciji limfocita periferne krvi SAM-P8 miševa. Osmomjesečni mužjaci SAM-P8 i kontrolni SAM-RI miševi podijeljeni su u 5 grupa. 3 tretirane grupe životinja SAM-P8 hranjene su četiri sedmice ishranom dopunjenom niskim (100 mg/kg), srednjim (500 mg/kg) i visokim (2500 mg/kg) dozama ECD, a dvije kontrolne grupe životinja su bile za ista dijeta bez suplemenata. Nakon 12 sati gladovanja, periferna krv je sakupljena od anesteziranih životinja i podvrgnuta FACS analizi, sve kao što je opisano u Odjeljku 5. (a) Reprezentativni FACS grafikoni različitih grupa miševa generiranih gajtiranjem na CD3 plus CD49 plus T stanicama. (b) Histogram koji pokazuje postotak prirodnih alkilera T ćelija u perifernoj krvi različitih grupa životinja. Trake predstavljaju srednju vrijednost±SD (u svakoj grupi,=10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Slika 5: Efekti dodataka ishrani ECD na prirodne ćelije ubice (NK ćelije, CD3 plus CD49 plus T-ćelije) u limfocitima slezene SAM-P8 miševa. Osmomjesečni mužjaci SAM-P8 i kontrolni SAM-RI miševi podijeljeni su u 5 grupa. 3 tretirane grupe životinja SAM-P8 hranjene su četiri sedmice ishranom dopunjenom malim (100mg/kg), srednjim (500mg/kg) i visokim (2500mg/kg) dozama ECD, a dvije kontrolne grupe životinja su hranjeni istom prehranom bez dodataka. Nakon 12 sati gladovanja. limfociti slezene su sakupljeni od anesteziranih životinja i podvrgnuti FACS analizi koja je opisana u Odjeljku 5. (a) Reprezentativni FACS grafikoni različitih grupa miševa generiranih gajtiranjem na CD3 plus CD494 T ćelijama. (b) Histogram prirodnog ubice u postotku ćelije u limfocitima slezene različitih grupa životinja. Trake predstavljaju srednji SD (u svakoj grupi,= 10), # < 0,01="" sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Dalja diferencijacija u različite vrste zrelih limfocita. Shodno tome, ove Sca-1 pozitivne ćelije predstavljaju glavni izvor naivnih T limfocita u perifernoj krvi. Slika 6 pokazuje da je u poređenju sa SAM-R1 kontrolnim miševima, relativni intenzitet fluorescencije Sca-1 pozitivnih ćelija kod SAM-P8 miševa bio znatno niži. Pokazalo se da dodatak ishrani SAM-P8 miševa sa tri različite doze ECD značajno povećava relativni intenzitet fluorescencije Sca-1 pozitivnih ćelija (Slika 6).

Prednosti biljke cistanche: protiv starenja