1. DIO Antioksidativni i antikoagulantni efekti fenilpropanoidnih glikozida izolovanih iz brusne repice (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria i P. Ramosa)

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

a Univerzitet u Ło´d´z, Odsjek za opću biohemiju, Fakultet za biologiju i zaštitu okoliša, 90-236 Ł´od´z, Poljska

b Odsjek za biohemiju i kvalitet usjeva, Institut za nauku o tlu i uzgoj biljaka, Državni istraživački institut, 24-100 Puławy, Poljska

Centar za istraživanje i očuvanje biodiverziteta, Odsjek za biologiju okoliša, Institut za biologiju, Univerzitet Jan Kochanowski, 25-406 Kielce, Poljska

Abstract

Holoparazitske biljke Orobanchaceae, uključujućiCistanche, Orobanche i Phelipanche spp, poznati su po svom bogatstvu fenilpropanoidnih glikozida (PPG). Utvrđeno je da mnoga PPG jedinjenja posjeduju širok spektar aktivnosti, kao što su antimikrobna, protuupalna, antioksidativna i poboljšavaju pamćenje. Kako bismo bolje istražili potencijal bioaktivnosti europske lopatice (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) i deset pojedinačnih izolovanih fenilpropanoidnih sastojaka, istražili smo njihovo antiradikalno djelovanje, zaštitni učinak od oksidacije u plazmi in vitro sistemu. , te utjecaj na parametre koagulacije. Testirani ekstrakti su pokazali aktivnost čišćenja od 50-70 posto snage Troloxa. Ekstrakt OC, bogatacteoside, imao je preko 20 posto bolji antiradikalni potencijal od PR ekstrakta koji je jedini sadržavao PPGs bez B-prstena kateholnog dijela u acilnoj jedinici. Štaviše, otkriveno je da je samo osam testiranih PPG-a pokazalo antioksidativni potencijal u ljudskoj plazmi tretiranoj sa H2O2/Fe; međutim, tri testirana PPG-a posedovala su i antikoagulantni potencijal pored antioksidativnih svojstava. Čini se da je struktura PPG-a, posebno prisustvo acilnih i kateholnih dijelova, uglavnom povezana s njihovim antioksidativnim svojstvima. Antikoagulantni potencijal ovih jedinjenja je takođe povezan sa njihovom hemijskom strukturom. Odabrani PPG pokazuju potencijal za liječenje kardiovaskularnih bolesti povezanih s oksidativnim stresom.

Za više informacija kontaktirajte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubuloza ima mnogo efekata

1. Uvod

Oksidativni stres je nadaleko poznat po svom negativnom utjecaju na zdravlje živih organizama, uključujući ubrzano starenje i neke vrste raka. Pojava oksidativnog stresa povezana je s poremećenom ravnotežom između oksidativnih i antioksidativnih mehanizama (uključujući enzimsku (katalaza, glutation peroksidaza) i neenzimsku (glutation) odbranu) u stanicama organizma [1]. Prekomjerna proizvodnja reaktivnih vrsta kisika (ROS), uključujući oksidirajuće radikale i vrste zatvorene ljuske, jedan je od glavnih mehanizama za stvaranje oksidativnog stresa. Međutim, biološki efekat izazvan ROS u velikoj meri zavisi od koncentracije, vremena izlaganja i lokacije. U normalnim uvjetima (niska koncentracija), kisik/dušik radikali mogu igrati ulogu sekundarnih glasnika, ali na višem nivou mogu početi reagirati s biološkim strukturama, poput ćelijske membrane [2]. Među svim vrstama ROS, hidroksilni radikal (HO.) uzrokuje jednu od najvećih oštećenja bio-makromolekula: proteina, lipida i DNK. Poznato je da oksidativni stres igra važnu ulogu u nizu bolesti, uključujući kardiovaskularne. Poremećaji krvnog sistema su u korelaciji i/ili prethodili promenama različitih parametara hemostaze i biomarkera u plazmi [1,3].

S druge strane, mnoge prirodne tvari, kao što su polifenoli i polinezasićene masne kiseline, identificirane su kao moćni antioksidansi koji mogu spriječiti stvaranje i/ili smanjenje reaktivnih vrsta kisika. Jedinjenja s takvim svojstvima nalaze se u mnogim prehrambenim proizvodima i farmaceutskim preparatima biljnog porijekla. Prehrana obogaćena svježim povrćem i voćem, te antioksidativne terapije zasnovane na prirodnim antioksidansima, stoga se široko preporučuju jer mogu smanjiti razinu oksidativnog stresa i spriječiti različite patofiziološke procese [4,5]. Biljni polifenoli su raznolika grupa sekundarnih metabolita, među kojima značajno mjesto zauzimaju fenolne kiseline, koje su široko rasprostranjene i ispoljavaju različite biološke efekte, kao što su antimikrobno, antioksidativno i protuupalno. Fenilpropanoidni glikozidi (PPG) su esteri desrodnici hidroksicimetne kiseline i oni su glavna/jedina klasa sekundarnih metabolita prisutnih u holoparazitskim biljkama Orobanchaceae, uključujućiCistanche, Orobanche i Phelipanche spp. Nekoliko vrsta ove porodice su ozbiljne štetočine useva kojih se farmeri žele otarasiti na poljima (primer Phelipanche ramosa), nekoliko se koristi u farmakologiji, dok je većina od malog značaja za ljude. HerbaCistanchese intenzivno koristi u azijskoj tradicionalnoj medicini u liječenju nedostatka bubrega i kao sredstvo za poboljšanje imuniteta i pamćenja, protiv starenja i umora [6]. Fitokemijske analize različitih istraživačkih grupa pokazale su da su fenilpropanoidni glikozidi, kao što su acetonid, ehinakozid i podijumska strana, jedan od glavnih aktivnih sastojaka Herba Cistanche [7]. Nedavna studija o nekoliko vrsta metličke repice pronađene u Poljskoj od strane Jedrejek et al. [8] je pokazao da ovaj biljni materijal ima sličan kvalitativni sastav (dominacija PPG-a), štoviše, jednak je ili čak prevazilaziCistanchespp. u pogledu sadržaja aktivnih supstanci [8].

Cistanche deserticola ima mnogo efekata, kliknite ovde da saznate više

Ovo istraživanje je imalo za cilj procjenu antiradikalnog i antioksidativnog potencijala, kao i utjecaja na parametre hemostaze tri ekstrakta ogrlice (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Phelipanache Arenaria – PA i P. ramosa – PR) bogata raznim fenilima. -

prostanoidi, kao i njihovi pojedinačni PPG sastojci. Antiradikalni kapacitet je mjeren korištenjem 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonske kiseline/Trolox ekvivalenta (ABTS/TE) i 2,2-difenil-1-pikrilhibrazila (DPPH ) testovi. Oksidativni stres u plazma test sistemu indukovan je hidroksilnim radikalom (H2O2/Fe), zatim peroksidacijom lipida (testom reaktivnih vrsta tiobarbiturne kiseline (TBARS)) i meren je nivo proteinskih karbonilnih i tiolnih grupa. Među utvrđenim parametrima hemostaze bili su: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTT), protrombinsko vrijeme (PT) i trombinsko vrijeme (TT).

2. Materijali i metode

2.1. Hemikalije

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal (DPPH), 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina (ABTS), kalijum persulfat, {{9 }}hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina (Trolox), dimetilsulfoksid (DMSO), tiobarbiturna kiselina (TBA), mravlja kiselina (LC-MS stepen), i H2O2 su kupljeni od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Metanol (HPLC gradijent grade) i acetonitril (LC-MS grade) su nabavljeni od Merck (Darmstadt, Njemačka). deset fenil-

propanoična jedinjenja testirana u ovom radu, uključujući 2′-O-acetilakteozid (97 procenata), 2′-O-acetilpoliumozid (98 procenata), 3-O-metilpoliumozid (96 procenata), acetonid (99 procenata), arenu iznutra (97 posto), krenatozid (98 posto), tenipozid (99 posto), poliumozid (99 posto), tubulozid A (96 posto) i wiedemannioside D (96 posto) smo prethodno izolovali iz niže navedenog biljnog materijala [ 8]. Čistoća jedinjenja je procenjena upotrebom UHPLC-PDA-MS analize. Ultračista voda je pripremljena u kući koristeći Milli-Q sistem za prečišćavanje vode (Millipore Co.). Ostali reagensi su bili analitičkog kvaliteta i obezbijeđeni su od domaćih komercijalnih dobavljača.

2.2. Biljni materijal

Cvjetnice tri vrste ogrlice, uključujući Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel i P. Ramos (L.) Pomel, identificirao je prof. Renata Piwowarczyk (Univerzitet Jan Kochanowski, Kielce, Poljska) i sakupljena iz prirodnog izvora u Poljskoj.

Vaučerski primjerci (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), kserotermni travnjak, parazitira Galium boreale, maj 2014.; P. Arenaria – Zwierzyniec i 50.3349◦N, 20.4000◦E, 50.3349◦N, ◦N865. ugar, parazitira Artemisia campestris, jun 2014;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), polje, paraziti Solanum Lycopersicum, septembar 2014.) deponovani su u Herbarijumu Univerziteta Jan Kochanowski u Kielceu (KTC). Biljni materijal je liofiliziran i fino samljeven prije ekstrakcije.

2.3. Priprema ekstrakta ogrlice

Biljni materijal u prahu (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g i P. ramosa (PR) – 3 g) ekstrahovan je sa 80% MeOH na 40 ◦C i 1500 psi (pritisak rastvarača ) koristeći ubrzani ASE 200

ekstraktor rastvarača (Dionex, Sunnyvale, CA, SAD). Ekstrakti su upareni i osušeni zamrzavanjem (Gamma 2–16 LSC zamrzivač za sušenje, Christ, Njemačka). Efikasnost ekstrakcije za OC, PA i PR bila je 55 procenata, 37 procenata i 43 procenta po težini biljnog materijala, respektivno. Zbog visokog sadržaja ugljikohidrata (podaci nisu prikazani), sirovi ekstrakti su dalje prečišćeni ekstrakcijom u čvrstoj fazi (SPE) na Oasis HLB mikro koloni (500 mg; Waters, Milford, MA, SAD). Šećeri su uklonjeni sa 1% MeOH, a zatim su jedinjenja od interesa eluirana sa 80% MeOH. Nakon uklanjanja rastvarača, ekstrakti OC, PA i PR su liofilizirani (Gamma 2–16 LSC zamrzivač za sušenje), a prinosi prečišćavanja SPE bili su 53 posto (OC), 67 posto (PA) i 51 posto (PR) .

2.4. Fitokemijske karakteristike ekstrakta metličke repice

Kvalitativne i kvantitativne analize ekstrakta metličke repice vršene su korištenjem ACQUITY UPLC sistema (Waters) spojenog na fotodiodni niz detektora (PDA) i tandem kvadrupolni maseni spektrometar (TQD-MS/MS). Liofilizirani ekstrakti OC, PA i PR otopljeni su u 50 posto metanola u koncentraciji od 0,50 mg/mL, a zatim

hromatografisan na BEH C18 koloni (100 × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters). Uslovi hromatografije su bili sledeći: temperatura rerne – 25 ◦C,

linearni gradijent 10→25 posto mobilne faze B (0.1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu) u mobilnoj fazi A (0.1 posto mravlje kiseline u H2O) preko 12 min, brzina protoka – 0,4 mL/min, zapremina ubrizgavanja – 2 μL, UV opseg – 190–490 nm (rezolucija 3,6 nm). MS analiza je izvedena u režimu negativnih jona sa elektrosprej jonizacijom (ESI), uz korišćenje sledećih podešavanja: opseg skeniranja 100–1200 m/z; kapilarni napon 2,8 kV; konusni napon 35 V;

temperatura izvora 150 ◦C; temperatura desolvatacije 450 ◦C; desolvation

protok gasa 900 L/h, a protok konusnog gasa 100 L/h. Prikupljanje i obrada podataka obavljeni su pomoću softvera Waters MassLynx 4.1.

Pikovi fenilpropanoidnog glikozida (PPG) identifikovani su poređenjem dobijenih LC-MS podataka sa prethodno izolovanim jedinjenjima [8]. Kvantifikacija PPG-ova u ekstraktima ogrlice bazirana je na UPLC-UV metodi sa detekcijom na 330 nm i eksternom standardnom kalibracijom korištenjemacteoside(Sigma-Aldrich, 99 posto, HPLC) as

grupni standard. Linearna kalibracijska kriva pripremljena je u šest koncentracija u rasponu od 1-200 ug/mL i pokazala je dobru linearnost (R2

0.999). Kvantitativni rezultati predstavljaju srednju SD vrijednost za tri injekcije i izraženi su u miligramimaacteosideekvivalenta (ekv.) po gramu ekstrakta (mgacteosideekv/g).

2.5. Antiradikalna aktivnost in vitro

2.5.1. ABTS test uklanjanja radikala

ABTS antiradikalni test izveden je metodom koju su opisali Kontek et al. [9], uz male modifikacije kako slijedi: 20 posto MeOH je korišteno za pripremu reagensa (7 mM ABTS i 4,9 mM kalija po-

sulfat); rastvori ekstrakata OC, PA i PR, u četiri nivoa koncentracije u rasponu od 100-400 ug/mL, i Trolox rastvori, u šest koncentracija u rasponu od 10 250 ug/mL, pripremljeni su sa 50 posto MeOH. Odnos uzorka prema radnom rastvoru ABTS bio je 1:25 (v/v). Apsorbancija na 734 nm je izmjerena nakon 30 min inkubacije

u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, SAD).

Inhibicija apsorpcije ( posto ) izračunata je na sljedeći način: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Izračunati su Trolox ekvivalenti (TE) ekstrakata metličke repice

koristeći formulu TE=msample/mstandard, gdje je m nagib prave

linijske krive (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju). TE vrijednost od

uzorak opisuje njegovu normaliziranu aktivnost protiv Troloxa (TEstandard =

1.0). Vrijednosti IC50 za OC, PA i PR ekstrakte i Trolox su bile

postignuti eksperimentalno, a zatim su izračunati iz njihove prave linije

krivulje (inhibicija apsorpcije u odnosu na koncentraciju) i izražene su u

ug/mL.

Analiza je izvedena u tri primjerka, a rezultati su predstavljeni

kao srednja vrijednost ± standardne devijacije (SD).

2.5.2. DPPH test uklanjanja radikala

DPPH antiradikalni test izveden je metodom koju su opisali Jedrejek i sar. [8] i Brand-Williams et al. [10], sa malim modifikacijama kako slijedi: otopine ekstrakta OC, PA i PR, u četiri nivoa koncentracije u rasponu od 50▽ 250 ug/mL, i otopine Troloxa, na šest nivoa koncentracija u rasponu od 10▽ 250 ug/mL, pripremljeni su sa 50 posto MeOH. Omjer uzorka prema DPPH bio je 1:19 (v/v). Apsorbancija na 517 nm izmjerena je nakon 30 min inkubacije u mraku pomoću UV-vis spektrofotometra (Evolution 260 Bio). Inhibicija apsorpcije (procenti) je izračunata na sljedeći način: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Vrijednosti Trolox ekvivalenta (TE) i IC50 testnih uzoraka izračunate su na isti način kao u ABTS testu (odjeljak 2.5.1). Test je izveden u tri primjerka, a rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SD.

2.6. Osnovni rastvori testiranih biljnih jedinjenja i ekstrakata za eksperimente sa ljudskom plazmom

Osnovni rastvori testiranih jedinjenja i biljnih ekstrakata pripremljeni su u 50 posto DMSO. Konačna koncentracija DMSO u ispitivanim uzorcima bila je niža od 0,05 posto i njeni efekti su utvrđeni u svim eksperimentima.

2.7. Izolacija ljudske plazme

Ljudska krv, odnosno plazma, dobijena je od šest redovnih davalaca (muškaraca i žena nepušača) u banci krvi (Lođ, Poljska) i medicinskom centru (Lođ, Poljska). Krv je sakupljena kao rastvor CPD (citrat/fosfat/dekstroza; 9:1; v/v krv/CPDA) ili rastvor CPDA (citrat/fosfat/dekstroza/adenin; 8,5:1; v/v; krv/CPDA). Donatori nisu uzimali nikakve lijekove ili supstance koje izazivaju ovisnost (uključujući duvan, alkohol i antioksidanse) najmanje dvije sedmice prije donacije. Naša analiza uzoraka krvi obavljena je u skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije za ljudska istraživanja i odobrena od strane Komiteta za etiku istraživanja u eksperimentiranju na ljudima na Univerzitetu u Lođu. Plazma je pripremljena centrifugiranjem svježe ljudske krvi na 4500x g tokom 25 minuta na sobnoj temperaturi. Koncentracija proteina je izračunata mjerenjem apsorbancije ispitivanih uzoraka na 280 nm, prema proceduri Whitaker i Granum [11].

2.8. Markeri oksidativnog stresa u ljudskoj plazmi

2.8.1. Merenje lipidne peroksidacije

Peroksidacija lipida u plazmi je kvantificirana mjerenjem koncentracije reaktivnih supstanci tiobarbiturne kiseline (TBARS). Koncentracija TBARS je izračunata korištenjem koeficijenta molarne ekstinkcije (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Metoda je detaljnije opisana u drugim [12,13]. 2.8.2. Mjerenje karbonilnih grupa Nivo karbonilnih grupa izračunat je korištenjem koeficijenta molarne ekstinkcije (ε=22, 000 M 1 cm 1) i izražen je kao nmol karbonilnih grupa/mg proteina plazme, prema Bartoszu [ 13] i Levine et al. [14]. 2.8.3. Određivanje tiolne grupe Sadržaj tiolne grupe u proteinima plazme mjeren je spektrofotometrijski pomoću SPECTROstar Nano Microplate Reader-a (BMG LABTECH, Njemačka) apsorbancijom na 412 nm sa 5,5′-ditiol-bis-(2- nitrobenzojevom kiselinom). Metoda je detaljnije opisana na drugom mjestu [15–17].

2.9. Parametri hemostaze

2.9.1. Merenje protrombinskog vremena (PT)

PT je određen koagulometrijski pomoću optičke koagulacije

Slova označavaju rezultate Tukeyovog testa (p < 0.05), vrijednosti sa istim

slovo unutar reda se ne razlikuje bitno.

2.9.2. Merenje trombinskog vremena (TT)

TT je određen koagulometrijski pomoću optičkog analizatora koagulacije (model K-3002, Kselmed, Grudziadz, Poljska), prema metodi koju su opisali Malinowska et al. [18].

2.9.3. Mjerenje aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTT)

APTT je određen koagulometrijski pomoću K-3002 optičkog analizatora koagulacije (Kselmed, Grudziadz, Poljska) prema Mali now ska et al. [18].

2.10. Analiza podataka Q-Dixon test je izveden da bi se eliminisali nesigurni podaci.

Podaci su testirani na normalnu distribuciju Shapiro-Wilkovim testom i jednakost varijanse sa Levenovim testom. Statistički značajne razlike su identificirane korištenjem ANOVA, nakon čega je uslijedio Tukeyjev test višestrukih poređenja ili Kruskal-Wallisov test. Poređenja su smatrana značajnim na p < 0.05.="" vrijednosti="" su="" predstavljene="" kao="" srednje="" vrijednosti="" ±="">