Prevazilaženje imunodeficijencije uz pomoć alogroominga

Jednostavan sažetak:

Istražili smo razlikuju li se dvije blisko srodne vrste termita u svom oslanjanju na društveni ili individualni imunitet protiv dvije vrste patogenih gljiva, koje su sve sakupljene s iste lokacije. Naši rezultati pokazuju da je uzajamno doterivanje (alogrooming) veoma efikasno u ograničavanju fatalnih infekcija u meri u kojoj može da nadoknadi relativno slabu individualnu imunološku odbranu. Nakon što se naiđu na patogene, termiti koriste alternativnu strategiju za socijalno distanciranje i ograničavanje širenja zaraznih bolesti i umjesto toga se okupljaju kako bi očistili jedni druge. Varijacije u intenzitetu ovog bihevioralnog odgovora ukazuju na nijansiran odgovor na nivo prijetnje.

prednosti dodatka cistanche-povećavaju imunitet

sažetak:

Čini se da je alogrooming ključan kod mnogih društvenih životinja za zaštitu od rutinske izloženosti parazitima. Kod društvenih insekata, čini se da je kritičan za uklanjanje patogenih propagula iz kutikule prije nego što započnu infektivni ciklus. Za podzemne termite, ovo uključuje spore gljivica koje se obično susreću u tlu, kao što je Metarhizium conidia, koje mogu brzo proklijati i prodrijeti u kutikulu. Istražili smo da li postoji razlika u oslanjanju na socijalni i urođeni imunitet kod dva blisko srodna podzemna termita za zaštitu od smrtonosnih infekcija od strane dviju vrsta Metarhizium koje se lokalno susreću. Naši rezultati pokazuju da je relativno slab urođeni imunitet kod jedne vrste termita nadoknađen trajnijim alogroomingom. To uključuje pojačano alogrooming kao odgovor na koncentracije konidija koje odražavaju rutinskiju kontaminaciju kutikule, kao i na tešku kontaminaciju kutikule koja izaziva umreženi hitni odgovor.

Ključne riječi:

socijalni imunitet; urođeni imunitet; entomopatogeni; ponašanje alarma; terminus

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

1. Uvod

Društveni mehanizmi odbrane mogu biti vrlo efikasni u suzbijanju osjetljivosti na zaraznu bolest uprkos društvenosti koja pogoduje njenom širenju [1,2]. Čini se da kod termita i mrava evolucija efikasnih društvenih mehanizama imunološke odbrane ima opušteni selektivni pritisak na individualne urođene imunološke mehanizme [3–6]. Nakon što se naiđu na patogene, prijetnja bolesti kod društvenih insekata ovisit će o djelotvornosti urođene odbrane na prvoj liniji, koja uključuje fizičke barijere za infekciju. Mnogi gljivični patogeni proizvode aseksualne spore (konidije) koje mogu direktno prodrijeti u kutikulu insekata. Čini se da je socijalna imunološka odbrana koja pomaže u zaštiti kutikule, uključujući alogrooming i izlučene antifungalne lijekove, posebno važna kod termita za odbranu od Metarhizium spp [7–9]. Metarhizium konidije su sveprisutne u tlu kroz koje se kreću mnogi termiti dok traže hranu i dostižu koncentracije koje održavaju stalnu opasnost od infekcije [10]. Termiti koji se hrane hrane, kao što su vrste iz roda Reticulitermes kreću se kroz tlo kako bi proširili raspon svojih kolonija i pristupili višestrukim hranilištima, koja su obično drvni resursi koji počivaju na površini tla [11]. Podzemne mreže njihovih kolonija mogu se protezati preko desetina metara, sadržavati preko stotinu hiljada jedinki i dostići gustinu od preko stotinu kolonija po hektaru [12]. Evoluirali su od pretka sa kolonijama ograničenim na jedan komad drveta [13,14]. Ova tranzicija bi rezultirala povećanim susretima s grabežljivcima, patogenima i konkurentima i poklopila se s evolucijom posvećene prave radničke kaste koja se obično odriče direktne reprodukcije. Poboljšana higijena je vjerovatno bila kritična za ovu tranziciju i naknadnu radijaciju i trenutni ekološki uspjeh termita, čiji doprinos propadanju drva može premašiti mikrobnu razgradnju [15,16] i koji izgleda spremni da se brzo šire globalno kako temperatura raste [17] . Tokom prelaska na ishranu, opuštanje selektivnog pritiska na gene urođenog imuniteta poklopilo se sa njegovim intenziviranjem na dva gena koji proizvode izlučene antifungalne proteine ​​[6]. Čini se da su ovi proteini esencijalni za uklanjanje gljivičnih konidija alogromingom. Kontrastni selektivni pritisak na komponente individualnih urođenih i društvenih mehanizama odbrane u prošlosti sugerira da i dalje postoji prilagodljivi kompromis u oslanjanju termita na individualni urođeni i društveni imunitet za zaštitu od gljivičnih bolesti. Ovo je potkrijepljeno zapažanjem da je ekspresija gena urođene imunosti niža u grupama nego kod pojedinaca radnika Reticulitermesa koji su bili izloženi Metarhizium conidia [18]. Allogrooming smanjuje potrebu za aktiviranjem unutrašnjeg imunološkog sistema. U ovoj studiji smo istraživali razlike u socijalnom i urođenom imunitetu kod dvije vrste podzemnih termita u odnosu na dvije lokalne vrste Metarhiziuma koje se prirodno susreću. Vrste Metarhizium izolovane su iz tla ispod ili pored trupaca u kojima su sakupljeni termiti. Dvije vrste termita, Reticulitermes virginicus i Reticulitermes flavipes, sakupljene su sa iste lokacije u Marylandu. Iako se čini da su agonistički, često se nalaze kako traže hranu jedan pored drugog ili čak povremeno u istom dnevniku. Interspecifična agresija između radnika često dovodi do smrtonosnih rana u analizama agonizma Petrijeve zdjelice [19]. Ranije se pokazalo da je antifungalna aktivnost kutikularnih ispiranja radnika R. virginicus efikasnija u inaktivaciji konidije Metarhizium nego ispiranja sa radnika R. flavipes [20]. Ovo sugerira da iako su ova dva termita blisko povezana i susreću se s istim patogenima, oni se mogu razlikovati u svom oslanjanju na individualni urođeni ili društveni imunitet. Koristili smo uporedni pristup kako bismo istražili postoji li razlika između oslanjanja i integracije socijalnog i urođenog imuniteta i postoji li potencijalni kompromis između njih dvoje. Povećani društveni imunitet može biti povezan sa manje efikasnim urođenim imunološkim mehanizmima, koji mogu uključivati ​​moć izlučenih antifungala, i obrnuto. Slabiji individualni imunitet može se nadoknaditi efikasnijim društvenim imunitetom. Preživljavanje radnika termita u kasnom stadiju u grupama od dvanaest, parova ili samaca istraženo je nakon što su bili izazvani gljivicama iz Metarhizium robertsii ili Metarhizium brunneum. Grupe od 12 radnika nakratko su bile izložene visokoj dozi gljivice. Ova potencijalno smrtonosna koncentracija uzrokuje slične bihevioralne odgovore kao što se opaža kada termiti naiđu na sporulirajući leš, u nekim slučajevima izazivajući značajno povećanje odgovora na alarm koji rezultira brzim uzdužnim oscilatornim pokretima, LOM [21–23]. Učestalost LOM-a u prvih 12 minuta nakon što su termiti izloženi konidijama različitih sojeva i vrsta Metarhizium u pozitivnoj je korelaciji sa učestalošću napada alogrominga. LOM, koje je lakše izmjeriti nego alogrooming, stoga se mogu koristiti kao indirektna mjera nivoa alogroominga. Čini se da je otkrivanje gljivica odgođeno sve dok se površine termita ne kontaminiraju konidijama, što sugerira da su receptori za prepoznavanje koji su povezani s ustima kritični za pojavu povišenog alarma i alogroominga. Parovi i samci bili su izloženi niskoj dozi gljive koja će vjerojatnije odražavati nivoe izloženosti na koje se termiti susreću kada grade galerije kroz tlo, za razliku od direktnih susreta sa sporulirajućim leševima. Za razliku od pojedinačnih termita, parovi termita su gotovo potpuno otporni na smrtonosne infekcije u ovoj dozi tijekom 10 dana. Kako bi se razdvojio društveni i urođeni imunitet pri ovoj niskoj dozi, parovi termita su razdvojeni u različitim vremenskim točkama ubrzo nakon izazova s ​​gljivičnim konidijama, a preživljavanje ovih parova uspoređeno je sa samcima koji nisu imali prilike za društvene interakcije nakon gljivičnih izazova. Alogrooming i LOM su uočeni prije vremenskih tačaka razdvajanja parova termita. Osim toga, testirana je antifungalna aktivnost sirovih ekstrakata cijelih termita kako bi se dalje procijenile razlike u urođenom imunitetu između dvije vrste termita kao odgovor na dvije vrste gljiva.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

2. Metode

2.1. Studijski organizmi

Termiti R. flavipes i R. virginicus, te gljive M. brunneum i M. Roberts, sakupljeni su iz listopadne šume sekundarnog rasta u okrugu Baltimore (Pleasant Hills i Monkton), Maryland. Vrste termita su identificirane korištenjem intra- i interspecifičnog agonizma [19] i mitohondrijalnih rRNA sekvenci [4]. Vrste Metarhizium izolovane su iz uzoraka tla u blizini mjesta sakupljanja termita (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) i drvo kojim su se hranili sakupljeni su i pohranjeni u plastičnim posudama u tamnim, vlažnim uslovima na 25 ◦C. Termiti koji pripadaju istoj vrsti sakupljeni su sa lokacija koje su bile udaljene najmanje 60 m, što je obično dovoljno da se osigura da su kolekcije iz različitih kolonija [12]. Ove odvojene kolekcije se u nastavku nazivaju kolonijama. Termiti su prikupljani u ljeto 2018. i 2019. godine za eksperimente sa grupama od 12, kao i in vitro eksperimente sa sirovim ekstraktima termita, te 2021. i 2022. godine za eksperimente sa parovima i singletonima. Termiti su korišteni u svojim eksperimentima unutar 4 mjeseca od sakupljanja. Radnici su pažljivo uklonjeni iz komada drveta i držani u grupama od 12 55 mm Petrijevih zdjela obloženih navlaženim filter papirom (Whatman 1) 24 h na ambijentalnom svjetlu prije nego što su korišteni za naše eksperimente. To im je omogućilo da se aklimatiziraju na svjetlost i očiste svoje kutikularne površine od čestica ostataka prije izlaganja gljivicama. Nismo uključili vojnike jer oni ne njeguju gnijezde, predstavljaju 1-2% kolonije i ne nalaze se stalno u grupama koje traže hranu.

2.2. Preživljavanje i odgovor na alarm za grupe od dvanaest

Grupe od 12 radnika R. flavipes ili R. virginicus bile su izložene visokoj dozi 10 6 konidija mL−1 od 0.05% Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, SAD) ili 0,05% Tween 80 za kontrole. Tween 80 je uključen kako bi se razbili nakupine konidija prilikom pripreme suspenzija. Dan prije ovih tretmana, svih 12 termita je označeno malom tačkom obojene emajl boje na dorzalnoj strani njihovih trbuha kako bi se mogli pojedinačno identificirati. Alogrooming je uklonio boju sa nekoliko pojedinaca, ali su te osobe i dalje mogle biti pojedinačno identificirane u trenutku smrti ispitivanjem preživjelih i prirodnim individualnim varijacijama kod radnika, kao što je stepen tamne boje na trbuhu. Termiti korišteni za svaku repliku od 12 izazvanih termita i kontrole bili su iz različitih kolonija. Pet kolonija je korišteno za R. flavipes i R. virginicus (n=480 radnika). Eksperimenti sa kolonijama M. Roberts ponovljeni su nakon tri mjeseca kako bi se testirala dosljednost preživljavanja. Ukupno je bilo 60 replika 12 ili 11 termita (n=709). U 11 replika termit je uginuo prije izlaganja gljivicama, što se činilo kao posljedica rukovanja prilikom označavanja boje. Termiti su bili izloženi konidijama pripremljenim iz klonske kulture bilo M. Roberts ili M. brunneum. Radnici su dodani u epruvete od 1,5 mL koje su sadržavale 500 µL razrjeđenja konidije, ili 0,05% Tween 80 za kontrole, s malim plastičnim lijevkom i lagano miješane 10 s kako bi se osiguralo potpuno uranjanje. Radnici su zatim stavljeni na filter papir da apsorbuju višak tečnosti, prebačeni u Petrijeve zdjelice prečnika 55 mm obložene navlaženim filter papirom (Whatman 1), a video je snimljen 12 minuta. Smrtnost je praćena dnevno tokom dvije sedmice. Mrtve osobe su uklonjene, površina sterilizirane sa 70% etanola i stavljene na vlažni filter papir u Petrijeve posude (55 mm) održavane na 24 ◦C i 100% vlažnosti radi potvrde infekcije Metarhizium (rast zelenog muskardina nakon 3-4 dana). Ukupan broj LOM-a uočenih u video zapisima tokom 12 minuta je ocijenjen za svaki termit. LOM-ovi su trajali između 2-7 s i morali su se zaustaviti, a zatim nastaviti da bi se bodovali kao odvojeni događaji [23].

2.3. Survivorship i Allogrooming za parove i samce

Preživljavanje parova termita upoređeno je sa samcima nakon izlaganja niskoj dozi (104 konidija mL-1) konidija koje nisu uzrokovale pretjeranu smrtnost i vjerovatno odražavaju koncentracije s kojima se termiti susreću kada se kreću kroz tlo [10] . Parovi i samci su upoređivani kako bi se izmjerilo preživljavanje koje pružaju društveni mehanizmi odbrane. Grupe od 12 radnika inicijalno su izazivane sa ili bez gljivica kao što je gore opisano, osim što su konidijalne suspenzije od približno 107 konidija mL-1 pripremljene u 0,1% Tween 80 i snažno vorteksirane prije razrjeđivanja sa sterilnom vodom do 104 konidija mL-1. Tween 80 nije uključen u razrjeđenja jer se suspenzije pojedinačnih konidija mogu održavati u niskim koncentracijama i zato što surfaktant može ometati prianjanje konidije na kutikulu. Ove osobe nisu bile obilježene bojom. Neposredno nakon tretmana i prije nego što su termiti imali priliku da stupe u interakciju, oni su podijeljeni u parove ili pojedinačne u jažice 24-plastičnih ploča za kulturu ćelija (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Svaki bunar je obložen navlaženim filter papirom (Whatman 1). Za svaku kombinaciju termita/gljivica (n=4), četiri para termita su razdvojena u pojedinačne grupe nakon 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h i 27 h (n=160), i za svaki kombinacija termita/gljivica 12 termita koji nikada nisu imali priliku da stupe u interakciju razdvojeno je na pojedinačne grupe tretirane gljivicom ili kontrolne grupe (n=96). Ovi pojedinačni termiti su također bili podijeljeni u 24-ploče bunara obložene filter papirom. Smrtnost termita je naknadno praćena tokom deset dana, a uginule osobe su uklonjene radi potvrde infekcije Metarhizijumom. Jedna kolonija je korištena za oba R. flavipes tretirana sa M. robertsii ili M. brunneum i R. virginicus tretirana sa M. robertsii ili M. brunneum (n=256). Šest netretiranih parova je također držano u 24-pločama s bunarima 10 dana za svaku vrstu. Odvojeni eksperiment sa istim kolonijama bio je fokusiran na snimanje alogrominga prije vremena razdvajanja parova na 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h i 27 h. Šest različitih parova svake vrste termita tretirano je sa svakom gljivicom ili vodom za kontrolu i ocijenjeno za alogrooming 15 minuta prije vremenskih tačaka razdvajanja (n=180). Allogrooming događaji su bodovani kada je kontakt usta na tijelo između dva termita uključivao pomicanje usnih organa (palpa), a zabilježeno je trajanje svakog neprekinutog događaja alogroominga. Allogrooming je ocjenjivao jedan posmatrač koji je bio slijep na tretman koji su termiti primili. LOM-ovi su također bodovani, ali su bili zanemarivi i nisu korišteni u analizi. Nije primećeno samouređivanje.

Prednosti cistanche tubulosa- jača imunološki sistem

2.4. In vitro antifungalna aktivnost

Dvanaest radnika iz 5 kolonija R. flavipes ili R. virginicus hladno je imobilizirano u Eppendorf epruvete od 1,5 mL, a u svaku epruvetu je dodato 120 µL hladne, sterilne vode. Radnici obje vrste korišteni u ovom istraživanju bili su približno iste veličine (dužine 4-5 mm). Termiti su homogenizovani plastičnim tučkom, a ekstrakt je centrifugiran na 16,000 g 2 min. Supernatant je steriliziran filterom sa 0,22 µm Ultrafree filterima (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Deset µL filtrata je inkubirano 24 h sa deset µL koji je sadržavao 100 konidija M. robertsii ili M. brunneum i 20 µL 100 µg mL-1 ampicilina kako bi se dalje izbjegla bakterijska kontaminacija. Kontrole su uključivale 10 µL sterilne vode umjesto sirovog ekstrakta. Dvije replike za svaku inkubiranu mješavinu su raspoređene na krompir dekstrozni agar (PDA) sa dodatkom 50 µg mL-1 ampicilina (60 mm Petrijeve zdjelice) i inkubirane na sobnoj temperaturi u mraku 4-5 dana. Antifungalna aktivnost je mjerena poređenjem jedinica koje formiraju kolonije (CFU) u tretmanima sirovog ekstrakta sa kontrolama.

2.5. Statistika

Kaplan–Meierove procjene srednjeg vremena preživljavanja korištene su za poređenje preživljavanja u paru. Odnosi rizika smrti (HR) su izračunati pomoću Cox regresione analize. Koristili smo Cox regresiju da istražimo razlike u mortalitetu između pojedinaca koji pokazuju LOM ili ne pokazuju LOM, dok kontroliramo druge kategoričke varijable (tretman ili kontrola gljivica, vrste gljiva, vrste termita, kolonija porijekla). LOM su kategorizirani kao odsutni ili prisutni kod pojedinaca zbog učestalosti odstupanja i nedostatka normalnosti. U analizi preživljavanja sa parovima termita i pojedinačnim osobama, HR je zasnovan na poređenju parova tretiranih konidijama (odvojenih u različitim vremenskim tačkama) i pojedinačnih tretiranih konidijama. Ovi HR, dakle, daju mjeru preživljavanja koju pružaju društveni mehanizmi odbrane dok kontroliraju individualne mehanizme odbrane. Povezanost između vremena provedenog u paru i promjene u HR mjerena je Pearsonovim korelacijama. Distribucija LOM-a među različitim tretmanima upoređena je s Kruskal-Wallisovim testom s Bonferronijevim korekcijama za višestruko testiranje za poređenje u paru. Srednja vrijednost CFU ili trajanje alogrooming događaja je upoređena sa ANOVA testom sa Bonferronijevim korekcijama za poređenje u paru. Za statističke testove koristili smo IBM SPSS Statistics (verzija 28).

3. Rezultati

3.1. Preživljavanje i uzbuna izazovnih grupa od dvanaest

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>90% potvrde). Za izazvane termite sa M. Robertsom, uočeno je 129 smrtnih slučajeva među 237 jedinki, a srednje vrijeme preživljavanja za R. virginicus (9,10 dana) bilo je značajno kraće nego za R. flavipes (10). 98 dana)(Breslow=10.05, df=1, p=0.002) (Slika 1). Za zaražene termite sa M. brunneum, 79 smrtnih slučajeva je uočeno među 120 jedinki, a srednje vrijeme preživljavanja za R. flavipes (9,70 dana) bilo je kraće nego za R. virginicus (10,68 dana), ali ne značajno (Breslow=2 .74, df=1, p=0.098). Distribucija LOM-a (Slika 2) između gljivičnih i kontrolnih tretmana bila je značajno različita (Kruskal–Wallis=176.897, df=5, p < 0.001). Učestalost LOM-a nije se značajno razlikovala između tretmana M. brunneum i njihovih odgovarajućih kontrola za R. flavipes (prilagođeno p=0.097) i R. virginicus (prilagođeno p=1.000 ). Međutim, učestalost LOM-a bila je značajno veća za tretmane M. Roberts u poređenju sa njihovim odgovarajućim kontrolama za R. flavipes (prilagođeno p < 0,001) i R. virginicus (prilagođeno p < 0,001) (Slika 2). Za tretman M. Roberts, učestalost LOM-a R. flavipes bila je značajno veća od R. virginicus LOM-a (prilagođeno p < 0,001). Međutim, za tretman M. brunneum, učestalost LOM-a R. flavipes nije se značajno razlikovala od LOM-a R. virginicus (prilagođeno p=1.000). Za razliku od M. brunneum, grupe od 12 termita izazvanih konidijom M. Roberts rezultirale su značajnom reakcijom ponašanja.

3.2. Preživljavanje izazovnih parova i samaca

Preživljavanje parova termita razdvojenih u različito vrijeme ubrzo nakon izazivanja patogena upoređivano je sa preživljavanjem izazvanih samaca sa omjerom opasnosti od smrti (HRs). HR od 1 odgovara jednakom preživljavanju u razdvojenim parovima i samcima tokom deset dana. Vrijednosti manje od jedan ukazuju na smanjenu smrtnost u razdvojenim parovima u poređenju sa samcima. Korelacija između vremena provedenog u paru i smanjenja HR bila je značajna samo za R. flavipe tretirane bilo kojim M. Robertsom (r=−0.978, p=0.{101} {7}}04) ili M. brunneum (r=−0.983, p=0.003), a ne za R. virginicus tretiran bilo kojim M. Roberts (r=−0.643, p=0.242) ili M. brunneum (r=−0.812, p=0.095). Ovo se također odražava u vrijednostima R2 iz linearnih regresija prikazanih na slici 3 (vrijeme je logaritamsko transformirano za izračunavanje Pirsonovih korelacija i vrijednosti R2). Nije uočena smrt u netretiranim parovima (6 parova za svaku vrstu termita) i jedna smrt u 16 tretiranih parova (4 para za svaku kombinaciju termita/gljive) koji nikada nisu bili razdvojeni tokom 10 dana.

Slika 1. Preživljavanje za grupe od 12. Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii i Mb sa M. brunneum. Značajne razlike u preživljavanju za poređenje u paru zasnovane su na Breslow testovima (generalizovani Wilcoxon testovi). * Značajna razlika između tretmana, NS nema značajne razlike između tretmana (str< 0.025 Bonferroni adjusted α). The distribution of LOMs (Figure 2) among fungal and control treatments was significantly different (Kruskal–Wallis = 176.897, df = 5, p < 0.001). The frequency of LOMs was not significantly different between M. brunneum treatments and their respective controls for R. flavipes (adjusted p = 0.097) and R. virginicus (adjusted p = 1.000). However, the frequency of LOMs was significantly greater for M. robertsii treatments compared to their respective controls for R. flavipes (adjusted p < 0.001) and R. virginicus (adjusted p < 0.001) (Figure 2). For the M. robertsii treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was significantly greater than R. virginicus LOMs (adjusted p < 0.001). However, for the M. brunneum treatment, the frequency of R. flavipes LOMs was not significantly different from R. virginicus LOMs (adjusted p = 1.000). In contrast to M. brunneum, groups of 12 termites challenged with M. robertsii conidia resulted in a significant behavioral response. 

Slika 1. Preživljavanje za grupe od 12. Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii i Mb sa M. brunneum. Značajne razlike u preživljavanju za poređenje u paru zasnovane su na Breslow testovima (generalizovani Wilcoxon testovi). * Značajna razlika između tretmana, NS nema značajne razlike između tretmana (str< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Antifungalna aktivnost sirovih ekstrakata

Dvije vrste gljiva su analizirane odvojeno (vijalnost konidije na PDA se razlikuje između dvije vrste). Za M. robertsii, srednje jedinice koje formiraju kolonije (CFU) među gljivičnim i kontrolnim tretmanima su se značajno razlikovale (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Slika 5a). Sirovi ekstrakti R. virginicus, ali ne i R. flavipes, pokazali su značajnu antigljivičnu aktivnost protiv M. robertsii u poređenju sa kontrolom (prilagođeno p < 0.001 i p=1.{{ 10}}). Antifungalna aktivnost ekstrakta R. virginicus protiv M. robertsii bila je značajno veća od antifungalne aktivnosti ekstrakata R. flavipes protiv M. robertsii (prilagođeno p < 0,001). Za M. brunneum, srednje vrijednosti CFU (Slika 5b) među gljivičnim i kontrolnim tretmanima su se značajno razlikovale (F=27.26, df=2, p < 0.001). Sirovi ekstrakti R. virginicus, ali ne i R. flavipes, pokazali su značajnu antifungalnu aktivnost protiv M. brunneum u poređenju sa kontrolom (prilagođeno p < 0,001 i p=0},072, respektivno). Antifungalna aktivnost ekstrakta R. virginicus protiv M. brunneum bila je značajno veća od antifungalne aktivnosti R. flavipes protiv M. brunneum (prilagođeno p < 0,001).

Slika 2. Odgovor alarma na gljivični izazov. Okvirni grafikoni predstavljaju distribuciju LOM-a (LOM-ovi postignuti kod 709 osoba označenih bojom). Kutije odgovaraju udaljenosti između gornjeg i donjeg kvartila od medijane (IQR). Brkovi odgovaraju 1,5 × IQR. Krugovi i zvjezdice prikazuju granične vrijednosti iznad 1,5 × IQR ili 3 × IQR, respektivno. Različita slova ukazuju na značajne razlike između distribucija za gljivične i kontrolne tretmane (prilagođeno Bonferronijem). Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii i Mb sa M. brunneum.

3.4. Allogrooming među izazovnim parovima

Učestalost alogrooming napada značajno se smanjila s gljivičnim izazovima (srednja vrijednost izazova {{0}}.55, kontrolna srednja vrijednost=8.80, t=−4.461, p < {{20}}.001). Međutim, srednje trajanje alogroominga se značajno povećalo s gljivičnim izazovima (srednja vrijednost izazova=19.01 s, srednja vrijednost kontrolne vrijednosti=5.62 s, t=4.876, p < 0.001). Trajanje alogrooming napada za svaku interakciju između parova termita značajno se razlikovalo u različitim tretmanima i kontrolama (F=7.166, df=5, p < 0.001) (Slika 6). Trajanje alogroominga po događaju je značajno povećano u parovima R. flavipes tretiranih sa M. robertsii (prilagođeno p < 0,001) ili M. brunneum (prilagođeno p=0.037) u odnosu na kontrole, ali ne i u parovima R. virginicus tretiranih sa M. robertsii (prilagođeno p=1.000) ili M. brunneum (prilagođeno p=1.000) u odnosu na kontrole.

Slika 3. Preživljavanje dva termita naspram jednog upoređeno je sa omjerom opasnosti smrti (n=80 parova, 96 pojedinačnih). Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii i Mb sa M. brunneum. Vrijeme je logičko transformirano za izračunavanje vrijednosti R2.

Slika 4. Preživljavanje pojedinačnih termita nakon gljivične infekcije (n=96). Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii i Mb sa M. brunneum. Pogledajte tekst za detalje o statističkim razlikama između tretmana. Značajne razlike u preživljavanju za poređenje u paru zasnovane su na Breslow testovima (generalizovani Wilcoxon testovi). * Značajna razlika između tretmana (p < 0.025 Bonferroni prilagođeno).

Slika 5. Antifungalna aktivnost sirovog ekstrakta protiv M. robertsii (a) i M. brunneum (b). Vrijednosti iznad crtica predstavljaju srednje vrijednosti CFU (±SD), a različita slova označavaju značajne razlike (Bonferroni prilagođen). Rf korespondira sa R. flavipes, a Rv sa R. virginicus. U analizi su korištene dvije replike iz 5 kolonija svake vrste termita, 6 replika za Rf kontrolu i 2 replika za Rv kontrolu.

Slika 6. Trajanje alogroominga po interakciji (n=161 događaja alogroominga). Vrijednosti iznad crtica predstavljaju srednje trajanje alogrooming interakcija (±SD), a različite kombinacije slova ukazuju na značajne razlike (prilagođeno Bonferronijem). Rf korespondira sa R. flavipes, Rv sa R. virginicus, Mr sa M. robertsii, a Mb sa M. brunneum.

4. Diskusija

R. flavipes se u većoj mjeri oslanja na društvene mehanizme odbrane od lokalnih gljivičnih patogena nego R. virginicus. Za radnike R. flavipes koji su bili izazvani bilo kojom vrstom Metarhizium, postojala je jaka negativna korelacija između vremena koje su dva termita provela zajedno i njihove vjerovatnoće smrti u odnosu na zaražene pojedinačne termite. Odnos opasnosti od smrti u odnosu na zaražene pojedinačne termite prepolovljen je za otprilike dva sata (Slika 3). Čini se da su rane društvene interakcije kritične za preživljavanje kada radnici R. flavipes naiđu na niske koncentracije Metarhizium conidia. Nasuprot tome, radnici R. virginicus pokazali su slabu korelaciju između vremena koje su dva termita provela zajedno i njihove vjerovatnoće smrti. Takođe, za razliku od R. virginicus, radnički parovi R. flavipes značajno su produžili trajanje alogrooming napada nakon gljivične infekcije (Slika 6). Otkrivanje konidija na kutikuli srodnika vjerovatno je dovelo do ovog povećanja. Čini se da efikasnije uklanjanje konidija sa kutikularnih površina povećanjem trajanja alogrooming napada objašnjava superiorni socijalni imunitet R. flavipesa. Naši rezultati također pokazuju da se R. virginicus u većoj mjeri oslanja na individualne urođene mehanizme odbrane od lokalnih gljivičnih patogena nego R. flavipes. Smrtnost pojedinačnih radnika R. flavipes izazvanih bilo kojom od vrsta Metarhizium bila je značajno veća od smrtnosti radnika R. virginicus (Slika 4). Ranije se pokazalo da je antifungalna aktivnost kutikularnih ispiranja R. virginicus worker protiv Metarhizium conidia značajno jača od aktivnosti radnika R. flavipes [20]. Antifungalna aktivnost sirovih ekstrakata cijelih termita također je bila jača kod R. virginicus nego kod R. flavipes (Slika 5). Ovi ekstrakti uključuju spojeve crijevnih simbionta, koji, zajedno s antifungalnim spojevima termita, također mogu doprinijeti eliminaciji progutanih konidija [26]. Varijacije u omjerima opasnosti od smrti i njihova slaba korelacija s vremenom razdvajanja kod radnika R. virginicus su u skladu s većom ovisnošću o urođenim imunološkim odbrambenim mehanizmima koji variraju među pojedincima, a ne društvenim imunološkim mehanizmima. R. flavipes je također pokazao veću ovisnost o socijalnom imunitetu kada su grupe od 12 radnika nakratko bile izložene visokim koncentracijama konidije M. robertsii. Neposredno nakon izlaganja konidiji M. robertsii, obje vrste termita pokazale su povišene LOM. Ova alarmna aktivnost bila je značajno veća kod R. flavipes nego kod R. virginicus (Slika 2), a otpornost na smrtonosne infekcije takođe je bila značajno veća kod R. flavipes nego kod R. virginicus (Slika 1). Nasuprot tome, postojao je povišen, ali slab alarmni odgovor na konidiju M. brunneum. U skladu s ovim rezultatom, ranije je pokazano da je povišeni alarm kod R. flavipes kao odgovor na konidije različitih sojeva i vrsta Metarhizium u korelaciji s povišenim alogroomingom i preživljavanjem [23]. Radnici R. flavipes mogu imati niži prag od radnika R. virginicus za prepoznavanje i kolektivno i efikasno reagovanje na kutikularnu kontaminaciju konidijama M. robertsii. M. robertsii, koja je najrasprostranjenija vrsta Metarhizium na našem lokalitetu [24], može predstavljati prijetnju za R. flavipes koja zahtijeva snažan društveni imuni odgovor jer ovaj termit ima relativno slabu urođenu imunološku odbranu protiv njega. Efikasnost antifungalnih jedinjenja povezanih sa sekrecijom pljuvačnih žlezda verovatno će biti od suštinskog značaja za individualnu odbranu uočenu u ovoj studiji [20]. Ova jedinjenja su prisutna na površini radnika prije gljivičnih izazova jer su izražena konstitutivno i konstantno se šire bazalnim nivoima alogroominga, koji stoga integrira individualnu i društvenu odbranu. Ovaj geštalt vjerovatno uključuje mali antifungalni peptid termicin sličan defenzinu, koji se luči u pljuvačnu žlijezdu i kritično je važan za odbranu od fatalnih infekcija Metarhiziumom [27]. Studija o R. flavipes i R. virginicus sa istog mjesta sakupljanja u Marylandu korištena u ovoj studiji otkrila je da su se termicini nedavno suočili sa selektivnim čišćenjem koje je rezultiralo smanjenjem polimorfizma nukleotida, a ovo smanjenje je bilo veće kod R. flavipes nego kod R. virginicus [28].

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Zahvat je mogao biti, a vjerovatno i dalje biti, teži za R. flavipes jer R. virginicus ima efikasnije urođene imunološke mehanizme koji su smanjili njegovo oslanjanje na termicine za odbranu od nedavne gljivične epidemije. Alternativno, adaptivna ograničenja evolucije termita (nedostatak genetske varijacije) su možda ostavila R. flavipes sa slabijim oružjem u suočavanju s novom gljivičnom epidemijom. Ograničenje adaptivne promjene u termicinima pod jakim selektivnim pritiskom također je evidentno u australskom Nasutitermesu [29]. Čini se da je stohastički proces umnožavanja gena oslobodio ovo ograničenje u različitim nazutnim linijama, što je rezultiralo ponovljenom evolucijom dva terminicina s različitim molekularnim nabojem. Ovo je moglo imati koristi od zaštite od gljivica jer dva terminala s različitim svojstvima punjenja ograničavaju mogućnosti za razvoj otpornosti na gljivice na njih. Termiti koji su pokazivali alarm (LOM) nakon izlaganja visokoj dozi konidije imali su manju vjerovatnoću da će umrijeti tokom dvije sedmice od pojedinaca koji nisu pokazivali alarm. LOM su u pozitivnoj korelaciji sa agregacijom radnika R. flavipes i alogroomingom [23], što sugerira da su osobe koje su pokazivale uzbunu u ovoj studiji tražile više negovanja od gnijezda. LOM se retko javlja u istraživanjima koja istražuju infekcije Metarhizijumom kod termita i zanemareno je da igraju ulogu u signaliziranju izloženosti patogenima [30]. Međutim, oni se mogu propustiti jer se ne javljaju kod izolovanih pojedinaca, nisu u velikoj mjeri izazvani određenim sojevima i vrstama Metarhiziuma, traju otprilike 3 minute nakon izazova prije nego što eskaliraju i nestaju nakon otprilike 30 minuta [22,23]. Naši rezultati sugeriraju da LOM saopštavaju hitno upozorenje nakon izlaganja visokoj dozi konidije, koje se detektiraju tokom alogroominga. Međutim, LOM nisu neophodni za proaktivni bihevioralni odgovor jer se trajanje alogroominga povećalo nakon izlaganja niskim dozama kada su LOM bili zanemarivi.

5. Zaključci

Čini se da su LOM dio hitnog odgovora na tešku kutikularnu kontaminaciju koja koristi umreženu komunikaciju za brzu eskalaciju uklanjanja i uništavanja većine konidija prije nego što imaju priliku da se čvrsto pričvrste i klijaju, što traje otprilike 12 sati [31]. Ova hitna reakcija će vjerovatno biti energetski skupa. Pojačani društveni imunitet kod R. flavipes kao odgovor na M. robertsii može biti adaptivni kompromis koji R. virginicus ne mora činiti u istoj mjeri jer ima efikasnije urođene imunološke mehanizme. Kada su suočeni s niskim razinama izloženosti patogenima koje radnici koji traže hranu moraju rutinski izdržati, čini se da alogrooming također kompenzira slabe urođene imunološke mehanizme.

Reference

1. Cremer, S.; Pull, CD; Fuerst, MA Socijalni imunitet: Pojava i evolucija zaštite od bolesti na nivou kolonije. Annu. Rev. Entomol. 2018, 63, 105–123. [CrossRef] [PubMed] 2. Cremer, S.; Armitage, SA; Schmid-Hempel, P. Socijalni imunitet. Curr. Biol. 2007, 17, R693–R702. [CrossRef] [PubMed]

3. Evans, JD; Aronstein, K.; Chen, YP; Hetru, C.; Imler, JL; Jiang, H.; Kanost, M.; Thompson, GJ; Zou, Z.; Hultmark, D. Imuni putevi i odbrambeni mehanizmi kod medonosnih pčela Apis mellifera. Insect Mol. Biol. 2006, 15, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

4. Harpur, BA; Zayed, A. Ubrzana evolucija proteina urođenog imuniteta kod društvenih insekata: adaptivna evolucija ili opušteno ograničenje? Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 1665–1674. [CrossRef] [PubMed]

5. He, S.; Sieksmeyer, T.; Che, Y.; Mora, MAE; Stiblik, P.; Banasiak, R.; Harrison, MC; Šobotník, J.; Wang, Z.; Johnston, PR; et al. Dokazi za smanjenu raznovrsnost i aktivnosti imunoloških gena tokom evolucije termita. Proc. R. Soc. Ser. B 2021, 288, 20203168. [CrossRef]

6. Bulmer, MS; Stefano, AM Termitska eusocijalnost i kontrastni selektivni pritisak na društveni i urođeni imunitet. Behav. Ecol. Sociobiol. 2022, 76, 1–12. [CrossRef]

7. Yanagawa, A.; Shimizu, S. Otpornost termita, Coptotermes formosanus Shiraki na Metarhizium anisopliae zbog njegovanja. BioControl 2007, 52, 75–85. [CrossRef]

8. Rosengaus, RB; Traniello, JF; Bulmer, MS Ekologija, ponašanje i evolucija otpornosti na bolesti kod termita. U Biology of Termites: A Modern Synthesis; Bignell, DE, Roisin, Y., Lo, N., Eds.; Springer: London, UK, 2011; str. 165–192.

9. Žukovskaja, M.; Yanagawa, A.; Forschler, BT Ponašanje njegovanja kao mehanizam odbrane od bolesti insekata. Insekti 2013, 4, 609–630. [CrossRef]

10. Milner, RJ Selekcija i karakterizacija sojeva Metarhizium anisopliae za kontrolu zemljišnih insekata u Australiji. U biološkoj kontroli skakavaca i skakavaca; Lomer, CJ, Prior, C., Eds.; CAB International: Wallingford, UK, 1991; str. 200–207.

11. Traniello, JF; Leuthold, RH Ponašanje i ekologija ishrane kod termita. U Termitima: evolucija, društvenost, simbioze, ekologija; Abe, T., Bignell, DE, Higashi, M., Higashi, T., Abe, Y., Eds.; Springer: Dordrecht, Holandija, 2000; str. 141–168.

12. Vargo, E.; Husseneder, C. Biologija podzemnih termita: Uvidi iz molekularnih studija retikuliterma i koptoterma. Annu. Rev. Entomol. 2009, 54, 379–403. [CrossRef]

13. Abe, T. Evolucija životnih tipova kod termita. U evoluciji i koadaptaciji u biotičkim zajednicama; Kowana, S., Connell, JH, Hidaka, T., ur.; University of Tokyo Press: Tokio, Japan, 1987; str. 128–148.

14. Shellman-Reeve, JS Spektar eusocijalnosti kod termita. U Evoluciji društvenog ponašanja insekata i pauka; Choe, JC, Crespi, BJ, ur.; Cambridge University Press: Cambridge, UK, 1997; str. 52–93.

15. Griffiths, HM; Eggleton, P.; Hemming-Schroeder, N.; Swinfield, T.; Woon, JS; Allison, SD; Coomes, DA; Ashton, LA; Parr, CL Tok ugljika i dinamika šuma: Povećana razgradnja mrtvog drva u tropskim prašumskim prazninama u krošnjama drveća. Glob. Chang. Biol. 2001, 27, 1601–1613. [CrossRef]

16. Guo, C.; Tuo, B.; Ci, H.; Yan, ER; Cornelissen, JH Dinamičke povratne informacije među funkcionalnim osobinama drveća, populacijama termita i prometom mrtvog drveta. J. Ecol. 2021, 109, 578–1590. [CrossRef]

17. Zanne, AE; Flores-Moreno, H.; Powell, JR; Cornwell, WK; Dalling, JW; Austin, AT; Classen, AT; Eggleton, P.; Okada, KI; Parr, CL; et al. Osetljivost termita na temperaturu utiče na globalne stope propadanja drveta. Science 2022, 377, 1440–1444. [CrossRef] [PubMed]

18. Liu, L.; Wang, W.; Liu, Y.; Sun, P.; Lei, C.; Huang, Q. Utjecaj ponašanja alogroominga na individualni urođeni imunitet kod podzemnog termita Reticulitermes chinensis (Isoptera: Rhinotermitidae). J. Insect Sci. 2019, 19, 6. [CrossRef] [PubMed]

19. Polizzi, JM; Forschler, BT Intra- i interspecifični agonizam kod Reticulitermes flavipes (Kollar) i R. virginicus (Banks) i efekti arene i veličine grupe u laboratorijskim testovima. Insectes Sociaux 1998, 45, 43–49. [CrossRef]

20. Hamilton, C.; Lay, F.; Bulmer, MS Profilaktički sekret podzemnih termita i vanjska antifungalna odbrana. J. Insect Physiol. 2011, 57, 1259–1266. [CrossRef]

21. Rosengaus, RB; Jordan, C.; Lefebvre, ML; Traniello, JFA Ponašanje alarma patogena kod termita: Novi oblik komunikacije kod društvenih insekata. Sci. Nat. 1999, 86, 544–548. [CrossRef]

22. Myles, TG Alarm, agregacija i odbrana pomoću Reticulitermes flavipes kao odgovor na prirodni izolat Metarhizium anisopliae. Sociobiologija 2002, 40, 243–256.

23. Bulmer, MS; Franco, BA; Fields, EG Socijalni alarm podzemnih termita i higijenski odgovori na gljivične patogene. Insekti 2019, 10, 240. [CrossRef]

24. Denier, D.; Bulmer, MS Varijacije u osjetljivosti podzemnih termita na smrtonosne infekcije od strane lokalnih izolata tla Metarhizium. Insectes Sociaux 2015, 62, 219–226. [CrossRef]

25. Bischoff, JF; Rehner, SA; Humber, RA Multilokusna filogenija loze Metarhizium anisopliae. Mycologia 2018, 101, 512–530. [CrossRef]

26. Rosengaus, RB; Schultheis, KF; Yalonetskaya, A.; Bulmer, MS; DuComb, WS; Benson, RW; Thottam, JP; Godoy-Carter, V. Symbiont-izvedene -1, 3-glukanaze u društvenom insektu: Mutualizam izvan ishrane. Front. Microbiol. 2014, 5, 607. [CrossRef] [PubMed]

27. Hamilton, C.; Bulmer, MS Molekularna antifungalna odbrana kod podzemnih termita: RNA interferencija otkriva in vivo uloge terminusa i GNBP-a protiv patogena koji se prirodno sreće. Dev. Comp. Immunol. 2012, 36, 372–377. [CrossRef] [PubMed]

28. Bulmer, MS; Lay, F.; Hamilton, C. Adaptivna evolucija u antifungalnim peptidima podzemnih termita. Insect Mol. Biol. 2010, 19, 669–674. [CrossRef] [PubMed]

29. Bulmer, MS; Crozier, RH Umnožavanje i diverzifikacija selekcije među antifungalnim peptidima termita. Mol. Biol. Evol. 2004, 21, 2256–2264. [CrossRef]

30. Moran, MN; Aguero, CM; Eyer, PA; Vargo, EL Strategija spašavanja kod termita: Radnici izloženi gljivičnom patogenu se reintegriraju u koloniju. Front. Ecol. Evol. 2022, 10, 840223. [CrossRef]

31. Davis, HE; Meconcelli, S.; Radek, R.; McMahon, DP Termiti oblikuju svoj kolektivni bihevioralni odgovor na osnovu stadijuma infekcije. Sci. Rep. 2018, 8, 14433. [CrossRef]