Nova multi-biomarkerska analiza za neinvazivno kvantitativno praćenje ozljede bubrega
Feb 22, 2022
Drew Watson1, Joshua YC Yang1,2,3et al
sažetak:Trenutni standard mjera njege zabubregfunkcija, proteinurija i serumski kreatinin (SCr) su loši prediktori ranog stadijumabubregbolest. Mjere koje mogu otkritihroničnobubregbolestu svojim ranijim fazama potrebni su kako bi se omogućila terapijska intervencija i smanjili štetni ishodihroničnobubregbolest. Razvili smo test ozljede bubrega (KIT) i novi KIT Score baziran na kompozitnom mjerenju i validaciji više biomarkera u jedinstvenom setu od 397 uzoraka urina. Test se izvodi na uzorcima urina koji ne zahtijevaju obradu na mjestu prikupljanja i bez ciljanog sekvenciranja ili amplifikacije. Pokušali smo da potvrdimo da unapred definisani KIT test, KIT rezultat i klinički pragovi koreliraju sa utvrđenimhroničnobubregbolest(CKD) i može pružiti prediktivne informacije o statusu ranog oštećenja bubrega iznad i izvan mjerenja proteinurije i bubrežne funkcije. Statističke analize za šest markera DNK, proteina i metabolita obavljene su na podskupini rezidualnih uzoraka urina saCKDkoji je zadovoljio kontrolu kvaliteta rada testova od pacijenata koji pohađaju kliničke laboratorije na Univerzitetu Kalifornije u San Francisku (UCSF) kao dio tekuće prospektivne studije koju je odobrio IRB. Kriterijumi za uključivanje uključivali su izbor pacijenata sa potvrđenimCKDi normalne zdrave kontrole; Kriterijumi za isključenje uključivali su nepotpune ili nedostajuće informacije za klasifikaciju uzoraka, logistička kašnjenja u transportu/obradi uzoraka urina ili mali volumen uzorka i akutnu ozljedu bubrega. Multivarijantna logistička regresijabubregpovredaStatistika statusa i omjera vjerovatnoće korištena je za procjenu doprinosa KIT Scorea za predviđanjebubregpovredastatus i stadijum CKD-a, kao i procijeniti potencijalni doprinos KIT Score-a za otkrivanje ranog stadijumaCKDiznad i izvan tradicionalnih mjera bubrežne funkcije. Uzorci urina obrađeni su zaštićenom imunoprobom za mjerenje DNK bez ćelija (cfDNA), metilirane cfDNA, klasterina, CXCL10, ukupnog proteina i kreatinina. KIT Score i stratificirana KIT Score Rizična grupa (visoki naspram niskih) imali su osjetljivost i specifičnost za otkrivanje statusa oštećenja bubrega (zdravo iliCKD) od 97,3 posto (95 posto CI: 94,6–99,3 posto) i 94,1 posto (95 posto CI: 82,3–100 posto). Osim toga, kod pacijenata s normalnom funkcijom bubrega (procijenjena stopa glomerularne filtracije (eGFR) > 90), KIT skor jasno identificira one sa predisponirajućim faktorima rizika zaCKD, što nije moglo biti otkriveno eGFR ili proteinurijom (p < 0.001).="" kit="" score="" otkriva="" teret="" ozljede="" bubrega="" koji="" još="" uvijek="" nije="" u="" potpunosti="" prepoznat,="" otvarajući="" vrata="" za="" ranije="" otkrivanje,="" intervenciju="" i="" očuvanje="" bubrežne="">
Ključne riječi:KIT Assay; hroničnobubregbolest; biomarker; neinvazivni; urin; eGFR; cfDNA
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
1. Uvod
Hroničnibubregbolest(CKD) je svjetski javnozdravstveni problem, s globalnim opterećenjem od 850 miliona ljudi.CKDje sada prepoznata kao "skrivena epidemija", jer većina pacijenata sa ranim stadijumima CKD (~11 posto odrasle populacije u svijetu) ostaje neprepoznata, jer nemaju simptome i nisu svjesni povećanog rizika od srčanih problema, infekcija , hospitalizacija i zatajenje bubrega. Stoga se HBB često ne smatra velikim zdravstvenim problemom, iako pogađa dvostruko veći broj dijabetičara (422 miliona) i preko 20 puta veći broj ljudi sa rakom (42 miliona) ili HIV/AIDS-om (36,7 miliona).
CKD is defined as a reduced renal reserve, persisting for >3 mjeseca i/ili prethodna dijagnoza stanja s poznatim rizikom zabubregdamage [1]. CKD is defined in a five-stage classification system for the assessment of kidney injury as patients advance towards the need for dialysis or transplantation [2]. The current standard of care tests, the blood-based serum creatinine (SCr) assay (and its use to calculate the estimated glomerular filtration rate or eGFR [3]) and protein in the urine, detect CKD 3–5 (eGFR of s60 mL/min/1.73 m2 of body surface area). However, most cases of CKD 1–2 (CKD >60 mL/min/1,73 m2 površine tijela) ostaju neotkriveni. eGFR ima slabu osjetljivost za rano otkrivanje CKD, jer inherentna redundantnost bubrežne rezerve maskira rani porast SCr. Biopsije bubrega, koje se često pokreću u uznapredovalim stadijumima CKD, imaju vrednost za procenu patologije, ali su invazivne, skupe [4] i ne mogu se koristiti za serijsko praćenje progresije CKD.
Višestruki okidači i faktori rizika započinju kaskadububregoštećenje uCKD, s progresijom do zatajenja bubrega (CKD 5). Postoji preko 10 miliona ljudi širom svijeta kojima je potrebna terapija spašavanja bubrega uz doživotnu podršku dijalizom ili transplantacijom bubrega. Iako dijaliza i transplantacija pružaju funkcionalnu zamjenu bubrega, oboje su i dalje opterećeni različitim negativnim utjecajima na morbiditet i mortalitet pacijenata. Takođe postoji značajan uticaj CKD na druge organske sisteme u telu;CKDpacijenti imaju veći rizik od infekcija, kardiovaskularnih smrti i raka [5].
Rano otkrivanje oštećenja bubrega je ključno, jer liječenje uCKD1-2 može dovesti do očuvanja bubrega bilo zaustavljanjem ili usporavanjem progresije oštećenja bubrega [6]. Trenutno, dostupni testovi urina ne mogu otkriti niske nivoe oštećenja bubrega [7–14] i uglavnom su evaluirani kod akutne ozljede bubrega (AKI), sa slabom diskriminacijom za CKD [9]. Stoga, postoji kritična nezadovoljena potreba za razvojem osjetljive, kvantitativne, neinvazivne dijagnostike za otkrivanje CKD 1-3. Rano otkrivanje i rano liječenje CKD-a bi ublažilo globalni teret bolesti i smanjilo ogromno financijsko opterećenje nacionalnih budžeta za zdravstvenu zaštitu [15–21].
The primary aim of this study was to perform an assessment of multiple novels and known urine biomarker measurements to conduct an inexpensive, portable assay, called the Kidney Injury Test (KIT) in consecutive patients presenting with CKD at a large tertiary health care system, and develop and independently validate a quantitative KIT Score to reflect the diferent CKD stages. The KIT assay performance was also directly compared to the current standard of care tests (eGFR and proteinuria). A secondary aim was to explore the accuracy of the KIT assay to detect and quantitate kidney injury in CKD 1–2, i.e., subjects with normal eGFR (>60), ali sa predisponirajućim faktorima rizika za CKD. Ovaj izvještaj opisuje proces odabira biomarkera, razvoja algoritma i nezavisne validacije KIT Scorea kao nove dijagnostike za procjenu i kvantififikaciju kako ranih tako i kasnih fazabubregoštećenja.
2. Eksperimentalna sekcija
2.1. Odabir pacijenata
Preostali, nasumični urin prikupljen je od 1169 uzastopnih pacijenata iz kliničkih laboratorija na Univerzitetu Kalifornije u San Francisku (UCSF), tokom 3 mjeseca, od oktobra 2016. do januara 2017., kao dio rutinskog kliničkog testiranja na Parnassusu i Mission Bayu. kliničke laboratorije u kampusu. Odabir uzoraka za dijagnozu CKD obogaćen je odabirom uzoraka urina dobivenih sa klinika za nefrologiju, dijabetes ili kardiologiju UCSF-a. Kako bi se olakšala statistička moć, studija je obogaćena za pacijente s povećanim rizikom od bolesti bubrega, koristeći sljedeće kriterije: pacijent je imao potvrđenu dijagnozu CKD (ICD10 kod N18 [22]), nije dijagnosticirana CKD, ali trenutna dijagnoza dijabetesa , hipertenzija ili autoimuna bolest, bez CKD-a ali pozitivna porodična anamneza CKD-a, bez CKD-a, ali stariji od 60 godina ili iz statusa etničke manjine. Pacijenti sa AKI nisu bili uključeni u ovu studiju, sa sledećim obrazloženjem: (1) ova prva studija o KIT-u je fokusirana na razvoj i validaciju kvantitativnih i funkcionalnih metrika KIT rezultata u hroničnom kontinuumu progresije bolesti bubrega. AKI ima drugačiju putanju sa akutnim početkom i rezolucijom; (2) AKI može imati potpuno ili nepotpuno razrješenje ozljede, tako da će smanjenje KIT Scorea nakon rješavanja AKI postati klinički interpretabilno kada su rasponi KIT Scorea postavljeni u ovom radu za različite funkcionalne stadijume CKD; (3) AKI je jedan od uzroka rizika od CKD, ali većina slučajeva CKD, kao što su dijabetes i hipertenzija, ne počinje s AKI. Studija KIT Scorea u AKI je planirana kao naknadna studija.
Za potrebe razvoja KIT Score-a, relevantni uzrok CKD ili predisponirajući faktor rizika za CKD je uhvaćen iz elektronskih zdravstvenih kartona (EHR), zajedno sa demografskim varijablama i SCr, kako bi se omogućilo izračunavanje eGFR [23]. Za svakog pacijenta kliničkim pregledom medicinske i laboratorijske dokumentacije potvrđeno je prisustvo i uzrok bolesti bubrega. Najčešći uzroci CKD u ovoj kohorti bili su: imunološki posredovane sistemske bolesti koje mogu uzrokovati oštećenje bubrega (kao što je lupus nefritis, reumatoidni artritis, Sjogrenov sindrom), hipertenzija, dijabetes (tip 1 i 2), glomerularna bolest (ovi slučajevi su biopsija potvrđena IgA nefropatijom, membranoproliferativnim glomerulonefritisom ili fokalnom segmentnom glomerulosklerozom) i opstruktivnom uropatijom (neurogena bešika, stražnji uretralni zalisci i hidronefroza). U kohorti bolesnika s CKD, 74,8 posto pacijenata imalo je 2 ili više kliničkih dijagnoza koje bi bile relevantne za razvoj i progresiju CKD, dok je 13,3 posto pacijenata imalo dijabetes i hipertenziju kao faktore rizika dvostruke povrede bubrega u odsustvu kliničke dijagnoze CKD. , što odražava visoku prevalenciju ovih komorbiditeta u općoj populaciji. Uzrok CKD nije filtriran, a svi uzroci koji su doprinijeli CKD su uhvaćeni.
To avoid degradation of the biomarkers in the KIT assay, urine samples were either processed within an hour of collection or stored at 4 C and processed within 24 h. Samples were discarded or not included for analysis in this study if the sample volume was less than 2 mL, there were insufficient data to confirm patient CKD diagnosis, or there was a>24 h kašnjenje u obradi uzorka zbog logističkih razloga. Nakon gore navedenog procesa filtriranja, imali smo konačnu selekciju od 343 jedinstvena uzorka urina od 343 pacijenta. Također smo dobili dodatne uzorke urina od 54 zdrave kontrolne skupine odabrane od dobrovoljaca koji su imali dobro zdravlje, s normalnim SCr, bez proteinurije i bez identificiranih faktora rizika za HBB. Studija je bila u skladu sa deklaracijama iz Helsinkija i Istanbula i odobrena je od strane institucionalnog odbora za reviziju UCSF-a (IRB 16-21108), a IRB je odustao od zahtjeva za informiranim pristankom.
2.2. KIT Assay Methods
2.2.1. Obrada uzorka
Uzorci urina su sakupljeni u sterilne posude (čist ulov, praznina srednjeg toka), bez obzira na mikro- ili makroskopsku hematuriju ili proteinuriju. Uzorci urina su centrifugirani na 2000× g tokom 30 minuta na 4 oC. Supernatant je odvojen od peleta urina koje su sadržavale ćelije i ostatke ćelija. pH supernatanta je podešen na 7,0 upotrebom Tris-HCl i pohranjen na _80oC u UCSF biorepozitorijumu do daljnje analize.
2.2.2. KIT Biomarkeri
KIT unosi normalizirana mjerenja 6 primarnih biomarkera urina. Prvi biomarker bila je DNK bez ćelija (cfDNA): kao mjera ukupnog apoptotičkog opterećenja bubrežne ozljede [24], mjereno vlasničkim 5' biotiniliranim oligonukleotidom komplementarne hemiluminiscentne imunosonde na specifično ciljane fragmente u cf2 kiD5. Ovaj pristup prevazilazi ograničenja dugotrajne obrade uzoraka, skupe PCR amplifikacije [26], detekcije SNP-a ([27,28] ili metoda sekvenciranja DNK [29], inače korištenih za mjerenje cfDNA u krvi [27,30].) Markeri izmjereni ELISA-om uključuju metiliranu cfDNA (m-cfDNA) kako bi se poboljšao udio cfDNA koji može biti relevantniji za ozljedu parenhima bubrega [31,32]; CXCL10, kao marker upale [33-37], kao klasterin marker ozljede bubrežnih tubulara [38,39]; ukupni protein, kao kasni marker glomerularne ozljede [40,41]; i kreatinin, kao normalizirajući marker jer na njega može utjecati tjelesna masa, ishrana i/ili hidratacija i iskoristiti kako bi se izbjegla potreba za vremenskim prikupljanjem urina [42,43].
2.3. Statistička analiza
2.3.1. KIT Score Development
Slučajno uzorkovanje je korišteno za podjelu 397-kohorte pacijenata u skup za obuku (n=233, sa 37 zdravih kontrola), stratificiran prema statusu povrede bubrega. Modeliranje nasumične šume korišteno je za identifikaciju odnosa između različitih markera za detekciju CKD sa visokom osjetljivošću. Prediktivni modeli su obučeni korištenjem statističkih metoda i metoda mašinskog učenja za razvoj algoritma KIT Score, za svih šest odabranih DNK i proteinskih biomarkera, a višedimenzionalna podjela ovih mjerenja analize zasnovana je na identificiranim kliničkim pragovima uključivanjem SCr i dodatnog poznatog rizika varijable za CKD kao što su rasa, spol i starost. Konačno, jednostavan linearni model koji uključuje rezultujuću particiju razvijen je u KIT Score sa dodatnim pragom za procjenu niskog i visokog rizika od CKD.
2.3.2. KIT provjera rezultata
Nezavisna validacijska podskupina od 164 pacijenta, sa 17 zdravih kontrola, naknadno je korištena za prospektivnu validaciju unaprijed specificiranog KIT testa i KIT rezultata. Logistička regresija je korištena za poređenje (potpunog) modela sa trenutnim standardom testova nege, samo proteina u urinu i eGFR. P-vrijednost < 0.01="" za="" odgovarajući="" test="" omjera="" vjerovatnoće="" smatrana="" je="" značajnom.="" analize="" logističke="" regresije="" su="" obavljene="" da="" bi="" se="" procijenila="" tačnost="" unaprijed="" specificiranog="" praga="" kit="" score="" za="" kategoričke="" (niske="" i="" visoke)="" kit="" score="" rizične="" grupe.="" izračunati="" su="" osjetljivost="" i="" specifičnost="" rezultirajućeg="" kvantitativnog="" i="" kvalitativnog="" kit="" scorea,="" zajedno="" sa="" intervalima="" povjerenja="" od="" 95="">
T-test and logistic regression were used to compare the pre-defined KIT Score and model patient status (individuals predisposed to CKD versus healthy subjects), to assess its ability to distinguish subjects with early stages of CKD (eGFR 60–90, CKD 2) and normal eGFR but with predisposing risk factors for developing kidney damage (>90, CKD 1), od zdravih dobrovoljaca (eGFR > 90) koji nemaju poznate predisponirajuće faktore rizika. P-vrijednost < 0,01="" se="" smatrala="">
3. Rezultati
Od 1169 regrutovanih pacijenata i prikupljenih uzoraka urina, 201 uzorak je zadovoljio kriterijume isključenja male zapremine urina i trijažni su iz dalje analize, što je ostavilo 968 pacijenata (demografski podaci u Tabeli 1). Distribucija proteinurije kod ovih 968 pacijenata (0 do 5469,73; medijan (IQR) od 4,69 (0–39,11) mg/mmol) i raspon eGFR (izračunat za sve pacijente s CKD [23] (Slika 1C) ) naglašava da smo uhvatili spektar bolesti CKD (Slika 1A). Iz ove grupe, 397 jedinstvenih pacijenata i uzoraka preživjelo je kriterije isključenja (vidi Metode). Etiologije njihove povrede bubrega obuhvatale su širok i višestruki spektar bolesti, sa hipertenzijom kao uzrokom za 42 posto pacijenata (Slika 1B). Preko 60 posto pacijenata imalo je više od jednog uzroka koji je doprinio ozljedi bubrega. S obzirom na to da je to realnost za većinu pacijenata sa CKD, posebno kada napreduju u kasnijim stadijumima CKD, KIT Score je modeliran za otkrivanje povrede bubrega bez obzira na osnovni uzrok. Uprkos tome što je proteinurija trenutni zlatni standard za neinvazivnu procjenu oštećenja bubrega, nije postojala korelacija između eGFR i omjera proteina/kreatinina u urinu (R2=0.0087) i, kao što su pokazali drugi istraživači [44 ], proteinurija je bila slaba u kategorizaciji stadijuma CKD (Slika 2).
Primarni cilj ove studije bio je razviti kompozitni KIT Score skaliranje od {{0}} (nizak rizik) do 100 (visok rizik) i prospektivno procijeniti sposobnost kvantitativnog KIT Score-a za otkrivanje ozljede bubrega sa visokim stepenom osetljivosti i specifičnosti. Pokazali smo da, iako trenutne mjere bubrežne funkcije (eGFR i proteinurija) predviđaju kasni stadijum CKD (tabela 2), kvantitativno skaliranje KIT rezultata od 0 (najniži rizik) do 100 (najveći rizik) daje prediktivne informacije
na status ozljede bubrega iznad samo proteinurije i bubrežne funkcije (omjer vjerovatnoće x {{0}}.507, p-vrijednost < 0,0001),="" i="" nadmašuje="" trenutne="" standardne="" testove="" njege="" (tabela="" 3).="" kreatinin="" u="" urinu="" se="" koristi="" u="" svrhu="" normalizacije="" u="" kit="" algoritmu="" i="" kontrole="" dnevnih="" i="" hidratacijskih="" varijacija="" (čime="" se="" otklanja="" potreba="" za="" vremenskim="" uzorkovanjem="" urina)="" i="" nije="" bio="" značajan="" za="" stadijum="" ckd="" u="" multivarijantnim="" analizama="" (p-vrijednost="0.">
We also developed a qualitative KIT Score, an approach that can have important implications for population kidney risk assessment. A pre-defined risk threshold of 18.5 was established in the training data, allowing the separation of the KIT Scores into low (s18.5) and high risk (>18.5) grupe oštećenja bubrega. Ovo je potvrđeno u test-setu kako bi se pružile prediktivne informacije o statusu povrede bubrega iznad i izvan proteinurije i eGFR (omjer vjerovatnoće je bio x=44.244, p-vrijednost <>
Procijenjena osjetljivost i specifičnost KIT rezultata za otkrivanje CKD je 97,3 posto (početni 95 postotni CI: 94,6, 99,3 posto) i 94,1 posto (početni 95 postotni CI: 82,3, 100 posto), respektivno. Nasuprot tome, osjetljivost i specifičnost proteinurije iznosila je 46,9 posto (početni 95 postotni CI: 38,8, 55,8 posto) i 88,2 posto (početni 95 postotni CI: 70,6, 100 posto), respektivno, za iste uzorke. Slično tome, osjetljivost SCr-a je bila 65,6 posto (bootstrap 95 posto CI: 57,4, 73,8 posto). Procjena negativnih i pozitivnih prediktivnih vrijednosti KIT skora ovisi o stopi prevalencije bolesti, tako da se stopa prevalencije hipertenzije može koristiti kao primjer. Prevalencija hipertenzije u općoj američkoj populaciji je otprilike 33 posto. Shodno tome, procijenjena pozitivna i negativna prediktivna vrijednost kvantitativnog KIT skora za hipertenziju bila bi ~89,1 posto i 98,2 posto, respektivno.
U nastavku prikazujemo doprinos pojedinačnih biomarkera KIT skoru (Tabela 4). Obilje cfDNA u urinu bilo je veoma varijabilno u različitim kategorijama bubrežne bolesti i nije bilo nezavisno u korelaciji sa stadijumom CKD. Korelacije među pojedinačnim biomarkerima bile su male (najveća korelacija R2=0.14 bila je između eGFR i proteina), što sugerira da svaki od biomarkera pruža nezavisne informacije za predviđanje statusa oštećenja bubrega. Analize glavnih komponenti (PCA) (Slika 2B) razjašnjavaju odnos nezavisnih linearnih kombinacija biomarkera prema ukupnoj varijabilnosti u mjerenjima testa i naglašavaju važan doprinos m-cfDNA, cf-DNA i CXCL10 kao pružanja nezavisne vrijednosti u generacija kompozitnog KIT Score. Clusterin je bio jedini biomarker statusa oštećenja bubrega koji nije bio značajan u multivarijantnim analizama (p-vrijednost=0.1671). Ovi faktori naglašavaju da, uprkos objavljenim podacima o korelacijama između obilja cfDNK u krvi i disfunkcije bubrega [27,28], cfDNA u urinu u ovim okruženjima ne bi bila dovoljna sama, i da postoji vrijednost uključivanja više biomarkera za razvoj kompozitnog KIT rezultata za CKD procjena.
CXCL10 is a key inflammatory cytokine dysregulated in immune-mediated renal injury [45–51]. To evaluate where CXCL10 identifies a specific cause of CKD, such as immune-mediated causes of renal injury from systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-positive vasculitis, we evaluated which CKD categories had a high abundance of urinary CXCL10. Interestingly, only ~30% of the immune-mediated cohort had very high CXCL10 values (>100 pg/mL), dok su u mnogim uzorcima bubrežnih ozljeda uzrokovanih imunitetom ove vrijednosti bile niske i mogu odražavati remisiju bolesti ili izloženost imunoterapiji. Na naše iznenađenje, oko 30 posto hipertenzivnih i dijabetičarskih kohorti također je imalo visoke razine CXCL10 u urinu, bez ikakvih identificiranih sistemskih imunološki posredovanih bolesti. Nije bilo povezanosti između nivoa CXCL10 u urinu i stadijuma CKD.
Figure 2C displays the KIT Score, shown here as a function of CKD stage (based on the eGFR) and matched with presence (red dots) or absence (black dots) of proteinuria (threshold cut of urine protein/creatinine ratio of >0.2). The healthy controls are marked in green and are shown in a pre-CKD 1 or CKD 0 stage where the eGFR is >90 mL/min/1,73 m2 kao kod CKD 1, bez proteinurije ili identifikovanog rizika od povrede bubrega. Važno je napomenuti da oko 15 posto zdravih kontrola koje su ovdje testirane ima blago povišenje u KIT skoru (neposredno iznad praga visokog rizika od 18,5). U ovoj fazi studije, ne možemo identifikovati da li ove zdrave kontrole sa višim KIT rezultatima imaju neotkrivene faktore rizika za povredu bubrega, pošto su svi subjekti deidentifikovani.
Tabela 5 prikazuje raščlanjivanje srednjeg KIT skora po stadijumu CKD i za zdrave dobrovoljce, i primećujemo značajnu putanju povećanja KIT rezultata napredovanjem u stadijumu CKD. KIT skor može lako razlikovati CKD 1 i 2 (28,9; 95 posto CI: 27,9, 29,9) od zdravih dobrovoljaca bez CKD (11.0; 95 posto CI: 9,5, 12,6); p-vrijednost < 0.00001).="" u="" poređenju="" sa="" zdravim="" kontrolama,="" postoji="" jaka="" povezanost="" između="" kit="" scorea="" i="" predispozicije="" za="" ozljedu="" bubrega,="" čak="" i="" kod="" subjekata="" s="" normalnom="" funkcijom="" bubrega="" u="" ckd="" 1="" (egfr=""> 90), s omjerom vjerovatnoće x=148.4 (LR p-vrijednost < 0,0001)="" i="" prag="" analize="" od="" 18,5="" imali="" su="" osjetljivost="" i="" specifičnost="" od="" 92,9="" (tačnih="" 95="" posto="" ci:="" 87,0="" posto,="" 96,7="" posto)="" i="" 94,4="" posto="" (tačnih="" 9,6="" posto="" ci,="" 8,8="" posto),="" odnosno="" 8,8="" posto="" ovaj="" isti="" efekat="" je="" dodatno="" pojačan="" za="" sposobnost="" kit="" testova="" da="" detektuju="" i="" ckd="" 1="" i="" 2,="" sa="" omjerom="" vjerovatnoće="" x="196.5" (lr="" p-vrijednost="">< 0,0001),="">
the >18.5 KIT Score threshold having a sensitivity of 95.8% (exact 95% CI: 92.2, 98.1%) for early CKD detection. A total of 60% of patients in CKD 1 have elevated KIT Scores >18.5, iako imaju "normalnu" funkciju bubrega i nemaju proteinuriju. To su upravo ciljni pacijenti koje želimo uhvatiti KIT testom jer njihov rani stadijum CKD ne bi bio otkriven trenutnim standardima njege. U stvari, KIT Score identifikuje 92 posto pacijenata sa CKD 1 koji nemaju proteinuriju kao ranu povredu bubrega. U CKD 2–3, iako otprilike 60 posto pacijenata nema proteinuriju, KIT Score detektuje sve pacijente kao visokorizične i pruža različite kvantitativne mjere za opterećenje CKD-om za svakog pacijenta. Kod CKD 4-5, proteinurija i KIT rezultati su podudarniji jer oštećenje bubrega uznapreduje i proteinurija se prepoznaje kao kasni marker oštećenja bubrega.
Stoga, ovi kolektivni rezultati jasno pokazuju da test postiže svoje primarne i sekundarne ciljeve predviđanja ozljede bubrega s većom osjetljivošću od trenutnih standardnih testova nege (eGFR, SCr, proteinurija), i, za razliku od naših trenutnih kliničkih testova, KIT Score može precizno identifikuju vrlo rane stadijume CKD u populacijskim ekranima.
4. Diskusija
Pokretačka snaga razvoja KIT testa i KIT Scorea bilo je prepoznavanje masivnog i sve većeg tereta neprepoznate ozljede bubrega [52], kompliciranog slabošću trenutnih standardnih testova njege [53] u otkrivanju pravi i „skriveni“ teret bolesti bubrega. Praćenje oštećenja bubrega kod pojedinaca uzorkovanjem urina oduvijek je bio vrlo poželjan cilj, jer biološki signal iz urina može pružiti vrlo informativan prozor u zdravlje bubrega. Ipak, test urina za predviđanje ozljede bubrega, bez obzira na osnovni uzrok, ostaje klinički neispunjena potreba i biokemijski izazov za izvođenje, budući da postoje mnoge interferirajuće supstance u urinu kao što su proteaze [54,55], što rezultira degradacijom biomarkera i visoka međuindividualna varijansa pH urina – sve to može zbuniti razvoj robusnog laboratorijskog testa. Ciljane proteomske studije [56–59], potaknute protokoliranim uzorkovanjem urina iz prospektivnih kliničkih ispitivanja, koje su trajale jednu deceniju (u našim laboratorijama na Univerzitetu Stanford i UCSF), dovele su do razvoja standardnih operativnih procedura (SOP) za prikupljanje urina, stabilizaciju , obrada, evaluacija interferirajućih supstanci, očuvanje i transport sa udaljenih lokacija do centralne laboratorije za obradu [60]. Osim toga, više od jedne decenije transkripcijskih i LC-MS/MS proteomskih studija urina [48,50,58,61–64] rezultiralo je dubljim biološkim razumijevanjem oštećenja bubrega kroz različite uzroke CKD, što je dovelo do odabira biomarkera za uključivanje u KIT test za predstavljanje ozljede u različitim intra-renalnim odjelima.
Ova sveobuhvatna pretraga dovela nas je do šest biomarkera: cDNK, metilirana cfDNK, klasterin, CXCL10, kreatinin i protein u urinu. DNK bez ćelija prepoznata je kao osjetljivi marker opterećenja bolesti u plazmi pacijenata sa autoimunim bolestima [65,66] i tumorima [67]. Međutim, njihova korisnost u plazmi je ograničena u kontekstu višestrukih bolesti i morbiditeta, budući da bi ukupni teret cfDNA odražavao kumulativne procese različitih bolesti, dok mjerenje DNK bez stanica u plazmi za organ ili mjesto specifično zahtijeva napredne tehnologije sekvenciranja i bioinformatika [68,69]. Međutim, budući da cfDNA u urinu posebno odražava doprinose bubrega, KIT cfDNA test omogućava izuzetno osjetljivo otkrivanje oštećenja bubrega putem jeftinog ELISA testa. Mjerenje metiliranih fragmenata cfDNK daje dodatnu specifičnost u pogledu vrste ozljede. Dok je globalna hipermetilacija povezana sa imunološkim oštećenjem bubrega i povećanom fibrozom, globalna hipometilacija je povezana sa opadanjem bubrega uzrokovanim starenjem i oštećenjem bubrežne ishemije-reperfuzije [31,32,70]. Kao i kod našeg obrazloženja u mjerenju cfDNK, nalazimo da globalne promjene u stanju metilacije cfDNK omogućavaju tačnu diskriminaciju između stanja bolesti bubrega bez potrebe za lokus-specifičnim sekvenciranjem ili PCR-om.
CXCL10 je dobro utvrđen kao marker imunološki posredovanih povreda u različitim kontekstima zbog svoje uloge liganda za CXCR3 receptor [33,34,37,45,51,71]. Ranije smo pokazali da CXCL10 i cfDNA, mjereni KIT testom, mogu otkriti kroničnu disfunkciju alografta pluća u transplantaciji pluća, kao i odbacivanje u transplantaciji bubrega [35,72,73]. Zapanjujuće, ono što smo otkrili u ovoj studiji je da postoji značajan broj pacijenata sa tradicionalno neimunim bolestima bubrega, kao što su hipertenzija i dijabetes tipa 2, koji imaju povišen CXCL10, što potencijalno ukazuje na širu korisnost u otkrivanju ranog stadijum povrede bubrega. Prethodne studije su identificirale dijabetes tipa 2 da ima značajnu komponentu posredovanu CXCL10- [74] i identificirale su CXCL10 proizveden u endotelnim stanicama kao faktor koji doprinosi esencijalnoj hipertenziji [75]. Naši nalazi sugeriraju da CXCL10 može identificirati ne samo pacijente s imunološki posredovanom ozljedom bubrega, već i one drugih uzroka, koji imaju tendenciju da se pojavljuju podmuklo s kasnim kliničkim simptomima u odnosu na progresiju bolesti.
Ukupni protein u urinu i klasterin su dobro utvrđeni markeri bubrežne disfunkcije [38,40,41], a kreatinin je dobro validiran u ovoj oblasti kao biomarker za normalizaciju [42,43]. Iznenađujuće, otkrili smo da klasterin, nakon multivarijatnih analiza, nije značajan u našem modelu oštećenja bubrega u kontekstu naših drugih biomarkera. Ovo može biti uzrokovano brojnim uzrocima, uključujući njegovu korelaciju s omjerom ukupnog proteina i kreatinina, čije su komponente već uključene u model [38], kao i varijacije visoke tačke zbog ultradijanskih ritmova čvrstog korelirani nivoi klasterina u plazmi i urinu [76,77].
Rano otkrivanje ozljede bubrega ima vrlo važne posljedice u ograničavanju stope napredovanja CKD i pozitivno utiče na zdravstvenu zaštitu širom svijeta. Kako su bubrežne hemodinamske promjene akutno osjetljive na sistemske poremećaje, poboljšano upravljanje glavnim uzrocima CKD bi bilo od neposredne koristi, posebno poboljšana i stroga kontrola krvnog tlaka [78], stabilnost i stroga kontrola hiperglikemije [79], i rano otkrivanje i brza imunomodulacija za otklanjanje bubrežne upale i ozljede kod imunološki posredovanih sistemskih bolesti kao što su sistemski eritematozni lupus [80] i reumatoidni artritis [81]. Uporno i rano povećanje rezultata moglo bi pokrenuti snimanje bubrega za procjenu opstruktivne uropatije, uz brzu intervenciju kako bi se spriječio visoki intrarenalni tlak i progresivna intersticijska fibroza bubrega i tubularni ispadanje. Rano otkrivanje bubrežne ozljede najvjerovatnije će se dogoditi u ustanovama primarne zdravstvene zaštite, gdje dostupnost brzog protoka, jednostavnog testa s kvantitativnim očitavanjem ocjene rizika za bubrege može potaknuti ranije upućivanje nefrologu radi kontrole krvnog tlaka, dijeta modifikacije, liječenja koronarne i/ili periferne vaskularne bolesti, osnovnog uzroka CKD i razmatranja terapija očuvanja bubrega [82,83]. Sposobnost kvantitativnog praćenja rezolucije KIT rezultata tokom vremena pruža mogućnost praćenja rezolucije povrede bubrega. Pored izbora za korištenje lijekova ili podrške za bolju kontrolu sistemske bolesti, novi renoprotektivni lijekovi, kao što su inhibitori SGLT2 i drugi [84], dodatno naglašavaju koliko je ključno biti u stanju vrlo rano otkriti ozljedu bubrega, liječiti i obrnuti ga.
Kašnjenja u otkrivanju ozljede bubrega i posljedično upućivanju pacijenata su značajna prepreka uvođenju novih pacijenata u efikasne režime liječenja, dok oni još uvijek imaju priliku da maksimiziraju prednosti terapija za očuvanje bubrega. Da bi se naglasilo koliko pacijenata "propušta" priliku za dijagnozu CKD u ranijim fazama svoje bolesti, pacijenti sa ESRD-om koriste hitnu pomoć po stopi šest puta većoj od nacionalne srednje stope za odrasle odrasle osobe u SAD-u - od čega polovina rezultira prijemom u bolnicu. [85]. Stoga, pored upotrebe KIT Scorea za praćenje oporavka bubrega, postoji ogromna vrijednost da se ovaj test koristi i za praćenje progresije bubrežne ozljede, tako da se intervencije mogu uvesti prema potrebi za stabilizaciju progresije putanje KIT Scorea. Opažanje da trećina pacijenata s CKD etiologijom zbog hipertenzije ili dijabetesa također ima jak imunološki/upalni milje kao dio oštećenja bubrega sugerira da uvažavanje biološke heterogenosti različitih kategorija bolesti prema vrijednostima pojedinačnih biomarkera u KIT testu, i druge upitne studije, omogućit će prilagođenije pristupe liječenju pacijenata sa CKD.
Planirane su i u toku su tekuće studije pri čemu će nam serijska procena unapred definisanog KIT rezultata sa unapred definisanim KIT testom omogućiti da procenimo vrednost pojedinačnih biomarkera u testu tokom bubrežne povrede i oporavka bubrega. Osim toga, uspostavljamo suradnju s farmaceutskim partnerima gdje se serijska procjena KIT testa može koristiti kao sredstvo za neinvazivno i precizno praćenje ranih ozljeda bubrega zbog nefrotoksičnosti lijekova, svojstvene mnogim imunomodulatorima, kao što je kalcineurin inhibitori [86] i anti-TNF agensi [87]; hemoterapeutski agensi kao što su cisplatin [88], aminoglikozidi [89] i novije imunoterapije [90], kao i izlaganje radionuklidnim kontrastnim medijima u svrhu snimanja [91]. Dodatne kohorte se okupljaju za analizu gdje su pacijenti praćeni longitudinalno tokom progresije CKD, što će nam omogućiti da bolje razumijemo granularnu putanju KIT skora i možda pomoći u preciziranju stadijuma CKD.
Kako su odabrani biomarkeri za analizu i analiza je razvijena sa specifičnom namjerom da otkrije vrlo ranu ozljedu bubrega, također smo primijetili da KIT test može otkriti da mali postotak "normalnih" kontrola pokazuje KIT rezultate urina koji lebde na visokoj prag rizika od 18.5. Iako nije potvrđeno, moguće je da ovo nije šum analize i ovi slučajevi su istinski pozitivni uz vrlo ranu identifikaciju rizika od ozljede bubrega u fazi prije CKD 1 ili CKD 0. Kako 96 posto ljudi sa CKD ne shvaća da ga imaju [92], jedan značajan izazov u razvoju modela oštećenja bubrega je velika vjerovatnoća da pacijenti koji su regrutirani kao zdrava kontrolna skupina zapravo imaju ranu fazu bolesti bubrega. Na primjer, projekt ljudske dugovječnosti, koji je vodio Craig Venter sa Health Nucleus testom, opsežno je sekvencirao i izvršio dodatne testove skrininga odraslih bez simptoma i otkrio kliničke korelacije potencijalne bolesti kod 21 posto njihovih "zdravih" učesnika studije uključujući urološke /bolesti bubrega, što ukazuje na potrebu pojačanog skrininga. Ovo se posebno odnosi na bolesti kod kojih rana intervencija može odgoditi ili čak preokrenuti napredovanje bolesti. Smatramo da su CKD i ozljeda bubrega u cjelini primjer bolesti u kojoj je to istina, budući da brojni način života i terapijske intervencije mogu spriječiti dalje napredovanje opadanja funkcije bubrega [6,82,83,92].
Ograničenje trenutnog dizajna studije je korištenje populacije obogaćene za osobe s CKD-om iz mjesta tercijarne nege. Subjekti dobijeni iz više skrininga i okruženja u zajednici mogu biti reprezentativniji za opštu populaciju, posebno za otkrivanje HBB u ranom stadijumu. Osim toga, studija je bila poprečnog presjeka i možda nije u potpunosti predstavljala ranu i kasnu fazu CKD. Longitudinalne studije koje prate pacijente sa znacima CKD u ranom stadijumu planirane su za poboljšanu procjenu mogućnosti ranog otkrivanja KIT Scorea i za uticaj ranog otkrivanja na napredovanje CKD. Konačno, moglo bi biti moguće dodatno povećati KIT skor dodatnim biomarkerima kako bi se omogućila poboljšana diferencijalna dijagnoza CKD i minimizirala potreba za mjerenjem serumskog kreatinina i proteinurije.
Ne može se naglasiti pozitivan ekonomski uticaj ranog otkrivanja oštećenja bubrega i njegovog liječenja. Gotovo trećina budžeta Medicarea je posvećena zbrinjavanju ozljeda i bolesti bubrega u SAD-u. Gubitak funkcije bubrega kod CKD 5 dodaje dodatno fiskalno opterećenje od ~80$,000 godišnje zbog podrške dijalizi. Iako transplantacija bubrega omogućava pacijentima da siđu sa dijalize, nedostatak bubrežnih donora, kako živih tako i kadaveričnih, transplantacija bubrega, s početnim troškovima procedure od ~100$,000, nakon čega slijede troškovi lijekova za održavanje od ~20$,{{ 6}} godišnje, rezultira samo malim gubitkom u budžetu Medicare za dijalizu [93]. Očekuje se da će putanja broja pacijenata sa CKD nastaviti da raste širom sveta, sa sve većim trendovima u gojaznosti, što će rezultirati porastom broja ljudi sa hipertenzijom i dijabetesom [94]. Osim toga, etničke varijacije u bubrežnim bolestima pokreću nacionalne zdravstvene probleme, zahtijevajući populacijski skrining s biopsijama bubrega radi ranog otkrivanja oštećenja bubrega od IgA bolesti bubrega u jugoistočnoj Aziji [95], gdje je IgA bolest bubrega glavni uzrok zatajenja bubrega. . Uključivanje osjetljivog neinvazivnog testa za oštećenje bubrega, koji bi zamijenio invazivne, skupe procedure biopsije visokog morbiditeta, rezultiralo bi velikim socio-ekonomskim prednostima za ove rizične populacije.
Cistanche tubulosa sprječava bolesti i ozljede bubrega, kliknite ovdje za uzorak
U zaključku, ova studija pruža nacrt za biomarkere KIT testa, proces razvoja algoritma za KIT test, definiciju KIT Scorea i njegove performanse za rano otkrivanje ozljede bubrega, te njegovo direktno poređenje sa trenutnim standardima njege. Ova studija predlaže da se KIT test može koristiti (1) kao skrining test kada postoji zabrinutost za komorbiditete za koje se zna da povećavaju rizik od CKD-a, kao što su kardiovaskularni morbiditet, gojaznost, dijabetes, bez dokumentacije o abnormalnom radu bubrega. funkcija trenutnim testovima; (2) kao dodatni test za praćenje opterećenja i tačne progresije CKD kod pacijenata kod kojih su trenutni standardni testovi nege već otkrili oštećenje bubrega, tj. pacijenata sa poznatom već postojećom CKD u različitim stadijumima bolesti bubrega; (3) kako bi se omogućila osjetljiva procjena oporavka od ozljede bubrega kada su izloženi različitim renoprotektivnim terapijama i opcijama upravljanja. Potrebne su i planirane daljnje studije za longitudinalni skrining pacijenata tokom vremena kako bi se bolje razumjela prirodna povijest progresije CKD, prednosti ranog otkrivanja, intervencije i praćenja, te točke infekcije gdje ozljeda CKD postaje fiksirana i progresivna. .
Doprinosi autora:MMS, JYCY, DW i TKS dizajnirali su studiju i eksperimente; JML, ID, VL, SS, DL, KS, RS, AC, PC.L. i ML, izvršili eksperimente; DW, JYCY, RDS i MMS analizirali su podatke; DW, JYCY i MMS su napravili brojke; JYCY, DW, RDS, TKS i MMS su izradili i revidirali dokument; svi autori su kritički revidirali rukopis zbog značajnog intelektualnog sadržaja i odobrili konačnu verziju rukopisa. MMS je imao pun pristup svim podacima u studiji i preuzima odgovornost za integritet podataka i tačnost analize podataka.
finansiranje:MMS i TKS imaju istraživačku podršku NIH (NIAID i NIDDK). Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka, analizi, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.
Priznanja:Zahvalni smo na pomoći ljekara, kliničkih koordinatora, istraživačkog osoblja, pacijenata i porodica pacijenata.
Sukobi interesa:MMS, DW i JYCY su osnivači KIT Bio, Inc. (Los Altos, Kalifornija, SAD), IP za koji je u ekskluzivnom vlasništvu Regents, Univerzitet Kalifornije u San Francisku i licenciran za KIT Bio. Svi ostali autori izjavljuju da nemaju sukob interesa
1. KIT Bio, 665 3rd Street, San Francisco, CA 94107, SAD; drew@kit.bio (DW); joshua.yang@ucsf.edu (JYCY)
2. Department of Surgery, University of California San Francisco, San Francisco, CA 94143, SAD;
reuben.sarwal@ucsf.edu (RDS); tara.sigdel@ucsf.edu (TKS); juliane.liberto@ucsf.edu (JML);
izabella.damm@ucsfmedctr.org (ID); victorialouie11@gmail.com (VL); shristisigdel@gmail.com (SS); peichen@berkeley.edu (P.-CL)
3. Master program Translational Medicine, University of California Berkeley, Berkeley, CA 94720, SAD; devonlivingstone@berkeley.edu (DL); katherine_soh@berkeley.edu (KS); archakra@berkeley.edu (AC); liangmichael@berkeley.edu (ML)
Reference
1. KDIGO 2012. Vodič za kliničku praksu za evaluaciju i liječenje hronične bubrežne bolesti; KDIGO: Brisel, Belgija, 2013.
2. Levin, A.; Stevens, PE Sažetak KDIGO 2012 CKD smjernica: Iza kulisa, potreba za vodstvom i okvirom za kretanje naprijed. Kidney Int. 2014, 85, 49–61. [CrossRef]
3. Levey, AS; Stevens, LA; Schmid, CH; Zhang, YL; Castro, AF; Feldman, HI; Kusek, JW; Eggers, P.; Van Lente, F.; Greene, T.; et al. Nova jednadžba za procjenu brzine glomerularne filtracije. Ann. Intern. Med. 2009, 150, 604–612. [CrossRef] [PubMed]
4. Khati, NJ; Gorodenker, J.; Hill, MC Ultrazvučno vođene biopsije abdomena. Ultrazvuk Q. 2011, 27, 255–268. [CrossRef] [PubMed]
5. Fried, LF Funkcija bubrega kao prediktor nekardiovaskularne smrtnosti. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 3728–3735. [CrossRef]
6. Qaseem, A.; Hopkins, RH; Sweet, DE; Starkey, M.; Shekelle, P. Skrining, praćenje i liječenje stadijuma 1 do 3 CKD: Smjernica za kliničku praksu iz CGC-a ACP. Ann. Intern. Med. 2013, 159, 835–847. [PubMed]
7. Mishra, J.; Dent, C.; Tarabishi, R.; Mitsnefes, MM; Ma, Q.; Kelly, C.; Ruf, SM; Zahedi, K.; Shao, M.; Bean, J.; et al. Lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL) kao biomarker za akutnu ozljedu bubrega nakon kardiohirurgije. Lancet 2005, 365, 1231–1238. [CrossRef]
8. Parikh, CR; Jani, A.; Melnikov, VY; Faubel, S.; Edelstein, CL Urinarni interleukin-18 je marker akutne tubularne nekroze kod ljudi. Am. J. Kidney Dis. 2004, 43, 405–414. [CrossRef] [PubMed]
9. Han, WK; Bailly, V.; Abichandani, R.; Thadhani, R.; Bonventre, JV Molekul ozljede bubrega-1 (KIM-1): Novi biomarker za ozljedu proksimalnog tubula bubrega kod ljudi. Kidney Int. 2002, 62, 237–244. [CrossRef] [PubMed]
10. Matteucci, E.; Carmellini, M.; Bertoni, C.; Boldrini, E.; Mosca, F.; Giampietro, O. Stope izlučivanja mokraćom višestrukih bubrežnih indikatora nakon transplantacije bubrega: klinički značaj za rani ishod transplantata. Ren. Fail. 1998, 20, 325–330. [CrossRef]
11. Lybarger, JA; Lichtveld, MY; Amler, RW Bubrežna insuficijencija Biomedicinsko testiranje bubrega za osobe izložene opasnim supstancama u životnoj sredini. Ren. Fail. 1999, 21, 263–274. [CrossRef]
12. Donadio, C.; Tramonti, G.; Lucchesi, A.; Giordani, R.; Lucchetti, A.; Bianchi, C. Gama-glutamiltransferaza je pouzdan marker za tubularne efekte kontrastnog sredstva. Ren. Fail. 1998, 20, 319–324. [CrossRef] [PubMed]
13. Nouwen, EJ; De Broe, ME Ljudska intestinalna u odnosu na tkivno nespecifična alkalna fosfataza kao komplementarni urinarni markeri za proksimalni tubul. Kidney Int. Suppl. 1994, 47, S43–S51. [PubMed]
14. Gatta, A.; Mazzella, G.; Amodio, P.; Menon, F.; Angeli, P.; Schiaffino, E.; Schmid, C. Detekcija ranih koraka kadmijum nefropatije — poređenje svjetlosnih i elektronskih mikroskopskih uzoraka s izlučivanjem urinarnih enzima. Nefron 1989, 51, 20–24. [CrossRef] [PubMed]
15. Locatelli, F.; Del Vecchio, L.; Pozzoni, P. Važnost ranog otkrivanja hronične bolesti bubrega. Nefrol. Dial. Transplant. 2002, 17 (Suppl. 11), 2–7. [CrossRef]
16. Remuzzi, G.; Ruggenenti, P.; Perico, N. Hronične bubrežne bolesti: Renoprotektivne prednosti inhibicije renin-angiotenzin sistema. Ann. Intern. Med. 2002, 136, 604–615. [CrossRef]
17. Gansevoort, RT Previše nefrologije? Epidemija CKD-a je stvarna i zabrinjavajuća. PRO pogled. Nefrol. Dial. Transplant. 2018, 34, 577–580. [CrossRef]
18. Coresh, J.; Byrd-Holt, D.; Astor, BC; Briggs, JP; Eggers, PW; Lacher, DA; Hostetter, TH Svest o hroničnoj bubrežnoj bolesti, prevalencija i trendovi među odraslim osobama u SAD, 1999. do 2000. J. Am. Soc. Nefrol. 2005, 16, 180–188. [CrossRef] [PubMed]
19. Coresh, J.; Wei, GL; McQuillan, G.; Brancati, FL; Levey, AS; Jones, C.; Klag, MJ Prevalencija visokog krvnog pritiska i povišenog nivoa kreatinina u serumu u Sjedinjenim Državama: Nalazi trećeg nacionalnog istraživanja o zdravlju i ishrani (1988–1994). Arch. Intern. Med. 2001, 161, 1207–1216. [CrossRef] [PubMed]
20. McClellan, WM; Knight, DF; Karp, H.; Brown, WW Rano otkrivanje i liječenje bubrežne bolesti kod hospitaliziranih dijabetičara i hipertenzivnih pacijenata: važne razlike između prakse i objavljenih smjernica. Am. J. Kidney Dis. 1997, 29, 368–375. [CrossRef]