Adherentne i suspendirane bubrežne ćelije bebe hrčka imaju drugačiji repertoar citoskeleta i površinskih receptora

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Veronika Dill¹, Florian Pfaff¹, Aline ZimmerID², Martin Beer¹, Michael EschbaumerID^1*

Abstract

Kultura životinjskih ćelija, sa pojedinačnim ćelijama koje rastususpenzija, idealno u hemijski definisanom okruženju, glavni je oslonac biofarmaceutske proizvodnje. Sintetičkom okruženju nedostaju egzogeni faktori rasta i obično zahtijeva dugotrajan proces prilagođavanja da bi se odabrali klonovi stanica koji se razmnožavaju ususpenzijado velikog broja ćelija. Molekularni mehanizmi koji olakšavaju adaptaciju i koji se odvijaju unutar ćelije su uglavnom nepoznati. Posebno za ćelijske linije koje se koriste za proizvodnju antigena virusa, kao što su ćelije bubrega beba hrčaka (BHK), ograničavanje rasta virusa kroz evoluciju neželjenih ćelijskih karakteristika je vrlo nepoželjno. Poređenje između adherentno rastućih BHK ćelija i suspenzijskih ćelija sa različitimpodložnostvirusu slinavke i šapa otkrivene su razlike u ekspresiji ćelijskih receptora kao što su integrini i heparan sulfati i u organizaciji aktinskog citoskeleta. Transkriptomske analize i rastkinetikademonstrirao je raznolikost BHK ćelijskih linija i potvrdio važnost dobro okarakteriziranih klonova roditeljskih ćelija i pažljivog skrininga kako bi se osiguralo da se bitne ćelijske karakteristike ne izgube tokom adaptacije.

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

1. Uvod

Tehnologija kulture životinjskih ćelija prvo je korištena za proizvodnju virusnog antigena u proizvodnji cjepiva, ali su u novije vrijeme platforme za proizvodnju bakterija ili kvasca za rekombinantne proteine ​​promijenjene i na ćelijske sisteme sisara [1, 2]. U oba konteksta važne su ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), koje potiču od sirijskog zlatnog hrčka (Mesocricetus auratus). Prvobitno, BHK ćelije su bile adhezivno rastuće, sidreno zavisne ćelijske linije sisara sa obrascem rasta fibroblasta u standardnim uslovima ćelijske kulture uključujući fetalni goveđi serum (FBS) [3, 4]. Prilagođavanje adherentnih BHK ćelija nasuspenzijarast u podlozi bez seruma u kombinaciji sa velikim uslovima kulture je uspešna priča za proizvodnju rekombinantnih proteina (npr. faktor VIII) sa visokim prinosima [1, 2]. Nadalje, BHK stanice su osjetljive na širok spektar virusa, uključujući virus slinavke i šapa (FMD) [5]. Da bi se zadovoljila sve veća potražnja za vakcinama protiv FMD-a u mnogim dijelovima svijeta, velike količine antigena moraju se proizvoditi što je jeftinije moguće, što je moguće postići povećanjem gustine održivih ćelija na ćelijskoj strani i smanjenjem troškova kroz pojednostavljenje obrade uzvodno i nizvodno. antigena na strani proizvodnje [6]. Mediji bez životinjskih komponenti (ACFM) smanjuju rizik od kontaminacije slučajnim agensima i dodatno pojednostavljuju proces kada se serum ne mora dodavati [6, 7]. Međutim, adaptacija stanica na rast u suspenziji bez seruma iu ACFM je dugotrajan i postepen proces [6, 8]. BHK ćelije lako dostižu gustinu ćelija od 3,5×106 ćelija/mL u suspenziji, ali adaptacija uvek nosi rizik od razvoja neželjenih ćelijskih svojstava u poređenju sa početnom populacijom što može rezultirati lošim performansama rasta, nedovoljnim prinosom specifičnim za ćelije ili tumorogenim svojstvima. [5, 7]. Zauzvrat, promjene na stanicama mogu dovesti do neočekivanih varijanti virusa tokom procesa kulturne adaptacije. Posebno za proizvodnju antigena vakcine, promjena karakteristika virusa i antigenosti je vrlo nepoželjna. BHK ćelije se već razlikuju po svojoj osjetljivosti i mogućnosti da propagiraju određene sojeve virusa FMDV [9]. Očigledno je da će promjena od rasta fibroblasta ovisnog o sidrenju putem agregacije i formiranja sferoida do stanica koje rastu nezavisno u suspenziji biti praćene značajnim promjenama na samoj ćeliji [4, 6]. Gubitak integrinske signalizacije zbog prekida kontakta ekstracelularnog matriksa i ćelije dovodi do promjena u ekspresiji membranskih proteina i u organizaciji aktinskog citoskeleta koji je važan primalac signalizacije posredovane integrinom [6, 10]. U isto vrijeme, ovi integrini igraju važnu ulogu u infekciji FMDV jer su receptor za FMDV u prirodnom domaćinu i primarni receptor u ćelijskoj kulturi [11].

Dublje razumijevanje ćelijskih razlika između adherentno rastućih HK ćelija i ćelija ususpenzijaotvoriće nove mogućnosti za ćelijski inženjering i pojednostaviti odabir odgovarajućih ćelijskih klonova za proizvodnju antigena vakcine.

U ovoj studiji, adherentno rastuće BHK ćelije i prilagođene ACFMsuspenzijaBHK ćelije su ispitivane s obzirom na ekspresiju ćelijskih receptora kao što su integrini i heparan sulfati (HS), njihovu sposobnost da predstave proteine ​​na površini ćelije i organizaciju ćelijskog aktinskog skeleta. Analiza transkriptoma i kinetika rasta daju informacije o raznolikosti testiranih BHK ćelijskih linija.

cistanche može hraniti bubrege i poboljšati funkciju bubrega

2. Materijali i metode

2.1 Ćelijske linije i ćelijska kultura

Glavne korišćene ćelijske linije bile su dvije adherentne derivate BHK-21 klona 13 (iz American Type Culture Collection [ATCC] CCL-10, koji se čuva kao CCLV-RIE 164 i 179 u Zbirci ćelijskih linija u veterinarskoj medicini , Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald, Njemačka; ukratko: BHK164 ili BHK179) isuspenzijaćelijske linije BHK21C13-2P (BHK-2P) koje obezbjeđuje Evropska zbirka provjerenih ćelijskih kultura (ECACC; 84111301) i BHK-InVitrus (BHK-InV, također se naziva "linija #8" kao u našoj ranijoj publikaciji [12]; Sigma-Aldrich, St. Louis, SAD).

Za kinetiku rasta dodatno su korištene sljedeće ćelijske linije: BHK-2P održavan ili u Glasgowskom minimalnom osnovnom mediju (GMEM) sa 10 posto FBS-a ("linija #2") ili prilagođen ACFM Cellvento™ BHK200 ( Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka) u dva različita procesa (linije #4 i #5), plus četiri drugasuspenzijaćelijske linije: BHK21C13 prilagođena rastu ususpenzijapostepenim povlačenjem seruma (linija #3), BHK21-C (red #6), BHK21-Hektor (red #7) i proizvodnog BHK (linija #9) [12]. Sve ove ćelije obezbedio je Merck KGaA.

Sve BHK-21 ćelije korištene u studiji su u konačnici izvedene iz BHK-21 klon 13 ćelijske linije Macphersona i Stokera [13]. Termin "ćelijska linija" se koristi slobodno; nisu sve od jedanaest BHK-21 linija opisanih u ovoj studiji zaista različite ćelijske linije, a ne derivati ​​uzgajani u različitim uslovima. Radi lakšeg snalaženja, numeracija redova je u skladu s numeracijom u našoj prethodnoj publikaciji [12].

Ćelijska linija #1 iz prethodne publikacije nije uključena u ovu studiju i stoga se ovaj broj ne koristi. Umjesto toga, svaka referenca na BHK-2P ćelije u kojoj se ne spominju brojevi reda #2, #4 ili #5 odnosi se na glavnogsuspenzijaćelijska linija BHK21C13-2P (ECACC84111301) predstavljena na početku ovog odjeljka.

Ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (Cricetulus griseus) (CHO) CHO-K1 (ATCCCCL-61, držane kao CCLV-RIE 134) i CHO677 (CRL 2244, održavane kao CCLV-RIE 1524) kao i IB-RS Korištene su -2 ćelije (Instituto Biolo´gico-Rim Suı´no-2, držane kao CCLV-RIE 103) i ćelije goveđeg bubrega Madin-Darby (ukratko: MDBK, držano kao CCLV-RIE261) kao kontrole u eksperimentima protočne citometrije.

Uslovi uzgoja bili su 37 ˚C, 5 posto CO2 i forsuspenzijaćelije 320 o/min u TubeSpin bioreaktorima (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Švicarska) pri 80 posto relativne vlažnosti. Sve adherentne ćelijske linije su uzgajane u Minimum Essential Medium Eagle (MEM) sa dodatkom Hanksove i Earleove soli (Sigma-Aldrich) sa 10 posto FBS. Sve ćelijske linije suspenzije su prilagođene da rastu u mediju Cellvento™ BHK200 (Merck KGaA) osim ćelijske linije #2, koja je kultivirana kako je gore opisano.

Mjerenja gustine i vitalnosti ćelija vršena su korištenjem tripan plavog (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) i automatskog brojača ćelija (model TC20, Bio-Rad).

2.2 Analiza krivulje rasta ćelija suspenzije

Analize krivulje rasta su sprovedene kao eksperimenti serije, izvedeni u duplikatima, dva puta pojedinačno, sa gustinom zasijavanja od 0.6×106 ćelija/mL. Gustoća vitalnih ćelija (VCD) i vijabilnost u procentima mereni su dnevno do šest dana nakon inokulacije ćelija.

Proračuni specifični za ćeliju izvedeni su prema jednadžbi datim od strane [14]:

X: VCD (po ml); t: vremenske tačke uzorkovanja (sat); n i n-1: dvije uzastopne tačke uzorkovanja.

Broj ćelijske divizije (cd):

2.3 Protočna citometrija

Protočne citometrijske analize vršene su pomoću instrumenta za protočnu citometriju FACSCanto II (BD Biosciences, Oxford, UK). Ostaci ćelija su izolovani na osnovu šablona raspršenosti prema naprijed i sa strane. Za bojenje aktinom, srednji intenzitet fluorescencije u Alexa 488 kanalu je direktno izmjeren. Za sve bojenje antitijela, postotak Alexa 488 ili PE-pozitivnih ćelija je određen pomoću intervalne kapije čija je donja granica postavljena na osnovu kontrole izotipa. Svi eksperimenti su izvedeni tri puta nezavisno.

2.3.1 Bojenje antitijela receptora na površini ćelije.

površine. MDBK ćelije su služile kao pozitivna kontrola za ekspresiju v 3, IB-RS-2 ćelije su služile kao pozitivna kontrola za ekspresiju v 8, a CHO-K1 ćelije su služile kao pozitivna kontrola za ekspresiju HS . CHO677 ćelije ne eksprimiraju nijedan od testiranih integrina niti HS i stoga su služile kao negativna kontrola u svim eksperimentima. Korištena su sljedeća antitela: za v 3, PE-konjugovani klon LM609 (razblaženje 1:20) (mAb1976H, Merck KGaA); za v 8, primarno antitijelo 11E8, klon 68, mišji IgG2a (razrjeđenje 1:100) (ljubazno obezbijedio dr. Stephen Nishimura) sa sekundarnim antitijelom kozjeg antimišjeg IgG2a (razrjeđenje 1:1000) konjugirano s Alexa Fluor SThermo 488 ); za HS, klon 10E4, mišji IgM (razrijeđenje 1:200) (Amsbio, Abingdon, UK) sa sekundarnim anti-mišjim mu lancem anti-mišjih IgM mu lancem antitijela (razrjeđenje 1:2000) konjugirano s Alexa Fluor 488 (ab150121, Abcam, UK), Cambridge . U svakom eksperimentu korišteno je samo jedno primarno antitijelo.

Suspenzirane ćelije su isprane sa fosfatnim puferom (PBS). Adherentne ćelije su odvojene upotrebom 10 mM EDTA u PBS, a zatim isprane sa PBS. Nakon ispiranja, ćelije su filtrirane kroz ćelijsko cjedilo (najlonska mreža, prečnik pora 70 μm, VWR, Radnor, SAD) da bi se uklonile nakupine ćelija i podešene su na 1×106 ćelija/mL prije 1 μL LIVE/ DEAD FixableViolet mrlja mrtvih ćelija (Thermo Fisher Scientific) dodata je u 1 mL suspenzije ćelija tokom 30 minuta. Ovaj i svi sljedeći koraci izvedeni su zaštićeni od svjetlosti i na 4 ˚C. Primarno antitelo je inkubirano 30 minuta, a sekundarno antitelo je inkubirano 20-30 minuta. Korak ispiranja sa 2 mL FACS pufera (PBS, 0,1 posto natrijum azida, 0,1 posto BSA) i centrifugiranje na 300 × g, 5 min, 4 ˚C izveden je nakon svih koraka. Konačno, obojene ćelije su resuspendirane u 300 μL FACS pufera.

2.3.2 Bojenje aktinom.

Filamentni aktin je obojen pomoću Phalloidin-iFluor 488 reagensa (ab176753, Abcam), pripremljenog prema podacima. BHK179, BHK-2P i BHK-InV ćelije su odvojene kako je gore opisano i fiksirane sa 4 posto formaldehida tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Ćelije su isprane dva puta sa PBS-om i 1×106 fiksnih ćelija je permeabilizirano sa 0,1 posto Triton X-100 (Sigma-Aldrich) u PBS-u, nakon čega je uslijedila inkubacija na sobnoj temperaturi 3 min. Ćelije su dva puta isprane sa PBS (centrifugiranje na 300 × g, 5 min) prije dodavanja pripremljenog osnovnog rastvora faloidina, razrijeđenog 1:1000 u FACS puferu i inkubirane 20 minuta na sobnoj temperaturi. Na kraju, ćelije su dva puta isprane FACS puferom i resuspendirane u 300 μL FACS pufera. Obojene ćelije su direktno analizirane fluorescentnim mikroskopom i korištene za FACS analizu.

2.3.3 Eksperimenti transfekcije.

BHK164 i BHK-2P ćelije su transficirane ili sa EGFP-N1, plazmidom koji eksprimira pojačani zeleni fluorescentni protein (EGFP) (Clontech), ili u drugoj seriji eksperimenata sa pVSV-G, plazmidom koji eksprimira G protein vezikularnog stomatitis Indiana virus (VSV), koristeći Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) prema uputama proizvođača. Ukratko, 2 ug plazmidne DNK i 1,875 μL ili 3,75 μL lipofektamina razrijeđenog u mediju Cellvento™ BHK200 pomiješani su i inkubirani na sobnoj temperaturi 20 minuta kako bi se omogućilo formiranje kompleksa. Nakon toga, ove smjese su prebačene u ćelije u12-pločama s bunarima (približno 4×105 ćelija/mL) i medij je dodan do 200 μL. Ćelije su inkubirane na 37 ˚C tokom 24 h.

Za FACS analizu, kompletan sadržaj bunara je sakupljen nakon 24 h. PEGFP transficirane ćelije su isprane tri puta sa PBS i resuspendirane u 300 μL FACS puferu. Jedan duplikat pVSV-G-transficiranih ćelija je permeabiliziran PBS-om sa 0,1 posto (v/v) TritonX-100 tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi prije bojenja antitijela, dok je drugi ostao ne-permeabiliziran. Bojenje antitela je izvedeno kao što je gore opisano sa poliklonskim zečjim serumom VSV 274/E (razblaživanje 1:500, ljubazno obezbedio dr Stefan Finke) i sekundarnim antitelom kozjim anti-zečjim (H plus L) konjugiranim sa Alexa Fluor 488 (razblaživanje 1: 1000; Thermo Fisher Scientific).

2.4 Statistička analiza

Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism verzije 07.04 za Windows (GraphPad Software, La Jolla, SAD). Uobičajena jednosmjerna analiza varijanse urađena je sa Tukeyjevim post-hottestom kako bi se procijenile razlike između tretiranih grupa. Prag statističke značajnosti je postavljen na p-vrijednost od 0,001.

2.5 Analiza transkriptoma

2.5.1 Ekstrakcija RNK, priprema biblioteke i sekvenciranje.

Tri nezavisne serije svake od adherentnih BHK179 ćelijskih linija i BHK-2P i BHK-InV suspenzijskih ćelijskih linija korištene su za analizu transkriptoma. U prosjeku, 8,3×105 BHK179 ćelija, 1,6×107 BHK-2P ćelija i 1,4×107 BHK-InV ćelija je lizirano u TRIzol reagensu (Thermo Fisher Scientific). Nakon dodavanja 0,2 zapremine trihlorometana u ćelijski lizat, inkubacije i centrifugiranja, vodena faza je sakupljena i pomešana sa jednom zapreminom 100% etanola. Iz ovoga je ukupna RNK ekstrahirana korištenjem RNeasy Mini Kita (Qiagen, Hilden, Njemačka) sa digestijom DNase na koloni sa RNase-Free DNase Setom (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. ERCC RNA Spike-In Mix 1 (Thermo Fisher Scientific) je dodan i korišten kao interna kontrola za sve sljedeće korake. Zatim je poliadenilirana mRNA izolirana iz 1-3 ug visokokvalitetne ukupne RNK korištenjem Dynabeads mRNA DIRECT Micro kita (ThermoFisher Scientific). mRNA je naknadno fragmentirana i korištena za sintezu cDNK i pripremu biblioteke koristeći TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, SAD) prema uputstvima proizvođača. Sekvenciranje je obavljeno na Heinrich-Pette-Institutu u Hamburgu, koristeći NextSeq 500 (2x75 bp) i HiSeq 4000 (1x50 bp) opremu (Illumina).

2.5.2 Statistička analiza diferencijalne ekspresije gena.

Provjera kvaliteta sirovih čitanja iz svake biblioteke sekvenciranja je izvršena korištenjem FastQC (verzija {{0}}.11.9; Babraham Institute, Cambridge, UK) s naglaskom na distribuciju dužine čitanja i kontaminaciju adaptera prije i poslije adaptera obrezivanje pomoću Trim Galore (verzija 0.6.4_dev, Babraham Institute) i Cutadapt (verzija 2.10) [15]. Koristeći Salmona [16], obrezani sirovi očiti su zatim kvazimapirani u genom sirijskog zlatnog hrčka.

Ukratko, genomske i transkriptne reference GCF{{0}}.1_MesAur1.0 su dobijene od Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i kombinovane sa referentnim sekvencama ERCC spike- u kontrolama. Konstruiran je indeks transkriptoma koji je svjestan varalice [17] kako bi se omogućilo selektivno usklađivanje s lososom. Za kvantifikaciju, korišteno je deset bootstrap replika i omogućena je kompenzacija za pristrasnost specifične za sekvencu, GC pristrasnost i 5' ili 3' pozicionu pristranost.

Nakon toga, podaci kvantifikacije za ERCC spike-in kontrole su u korelaciji sa njihovom teoretskom koncentracijom, kako bi se otkrili problemi tokom pripreme uzorka.

Nadalje, podaci kvantifikacije specifični za gen su inicijalno filtrirani (samo geni koji se pojavljuju u više od jedne replike sa preko 15 brojanja), normalizirani korištenjem regularizirane log transformacije (rlog) i korišteni za istraživačku analizu podataka, npr. s PCA. Diferencijalno eksprimirani geni su identificirani i naknadno korišteni za analizu puta pomoću DESeq2 [18]. Podaci o ekspresiji su analizirani za značajno različito eksprimirane gene između parova ćelijskih linija BHK-2P i BHK179, BHK-InV i BHK-2P i BHK-InV i BHK179. Nakon toga, rezultujuća binarna logaritamska (log2) promjena nagiba je prilagođena korištenjem funkcija "lfcShrink" i "apglm" u DESeq2 kako bi se kompenzirao nizak ili varijabilan broj čitanja koji može dovesti do precijenjenja varijanse [19].

Kriterijumi za značajno različito izraženi gen su postavljeni na maksimalnu prilagođenu vrijednost {{0}}.05 i minimalnu apsolutnu vrijednost smanjene log2 puta promjene od 1. Putanja i Kriteriji za značajno drugačije eksprimiran gen postavljeni su na maksimalnu prilagođenu vrijednost od 0,05 i minimalnu apsolutnu vrijednost smanjenja log2 puta promjene od 1. Analiza puta i obogaćivanja je provedena korištenjem funkcije "obogati" u profilu klastera (verzija 3.16.0).

cistanche može hraniti bubrege i poboljšati funkciju bubrega

3. Rezultati

3.1 Osjetljivost ćelijske linije na FMDV je nezavisna od njene individualne stope rasta i broja diobe ćelije

Eksperimenti serije sa devet različitih BHK suspenzijskih ćelijskih linija su sprovedeni u periodu od šest dana, a gustina živih ćelija (VCD) i vitalnost mereni su svakodnevno. Na osnovu prethodnih zapažanja da su se ćelijske linije razlikovale po svojoj osjetljivosti na FMDV serotip Asia{{0}} [12], ispitano je da li su povišeni ćelijski metabolizam i stopa rasta povezani sa smanjenom osjetljivošću na infekciju ovim virus (tabela 1). Dvije od tri podložne BHK suspenzijske ćelijske linije su ćelije koje polako rastu s malim brojem diobe ćelija (cd) od 0.60 (#3) i 0.70 (#9), dok treća osjetljiva ćelijska linija (#8) ima najveća stopa rasta i cd (μ=0.035, cd=1.62) među svim testiranim ćelijskim linijama.

Povlačenje seruma i adaptacija na rast u ACFM nisu uticali na osjetljivost na FMDV u našem skupu ispitivanih ćelijskih linija. Ćelijska linija #2 je sporo rastući, serumski ovisan prekursor BHK-2P ćelijskih linija, održavan u suspenziji sa GMEM sa fetalnim goveđim serumom. Tokom adaptacije na rast u ACFM, ćelije su odabrane za visok VCD, povezan sa visokom stopom rasta i cd. Kao i glavna BHK-2P ćelijska linija korištena za istraživanje, ćelijske linije #4 i #5 su također izvedene iz ćelijske linije #2, ali se razlikuju u načinu prilagođavanja na ACFM. Sve BHK-2P ćelijske linije održavane u ACFM-u pokazale su vrlo sličan profil rasta. Osjetljivost na FMDV serotip Asia-1 nije stekla nijedna od ovih ćelija tokom adaptacije na ACFM, vjerovatno zato što je originalna linija #2 već bila otporna. Slično, nikakva promjena u osjetljivosti nije uočena za ćelijsku liniju suspenzije #3. Kada su rasle adhezivno (uporedi ćelijsku liniju #1 u [12]), ćelije su bile osjetljive na FMDV Asia-1 i zadržale su ovu karakteristiku tokom adaptacije na rast u suspenziji. Istovremeno, nisu stekle profil brzog rasta ostalih ćelija suspenzije.

3.2 Suspenzirane ćelije imaju manje primarnih receptora, ali više sekundarnih receptora za FMDV na svojoj površini nego adherentne BHK ćelije

Prvi korak da virus uspješno inficira ćeliju je vezivanje virusne čestice za molekule receptora na površini ćelije. Da bi se analizirale razlike između adherentno rastućih BHK ćelija i BHK ćelija u suspenziji, testirana su antitijela na ćelijske receptore uključene u interakciju ekstracelularnog matriksa i za koja je poznato da igraju važnu ulogu u infekciji FMDV. Integrini v 3 i v 8 su ispitani kao reprezentativni ćelijski receptori koji prepoznaju RGD (Arg-Gly-Asp) vezujući motiv i stupaju u interakciju sa komponentama seruma i ekstracelularnim matriksom, ali ih FMDV koristi i kao svoje prirodne primarne receptore. Nijedna od testiranih suspenzijskih staničnih linija (BHK-InV i BHK-2P) nije eksprimirala integrin v 3 ili v 8 na površini ćelije. Dok razlika između adherentnog BHK i suspenzije BHK nije bila značajna za integrin v 8 (slika 1b), značajno veći procenat adherentnog BHK179 eksprimirao je integrin v 3 u poređenju sa suspenzijskim ćelijskim linijama BHK-InV i BHK-2P ( Slika 1a).

Visoke količine HS su bile prisutne na površini obe suspenzijske ćelijske linije. Ekspresija HS je bila veoma divergentna između repliciranih kultura adherentnih BHK179 ćelija. U poređenju sa ćelijskim linijama suspenzije, manje ćelija u kulturama BHK179 je bilo HS-pozitivno, iako razlika nije bila značajna na unaprijed određenom nivou značajnosti (slika 2).

Bojenje i mikroskopska analiza otkrile su velike razlike u rasporedu aktinskog citoskeleta između adherentnih i suspenzijskih ćelija (slika 3). Aktinski filamenti u adherentnim BHK179 ćelijama ravnomerno su raspoređeni po celoj ćeliji u finom retikularnom uzorku (slika 3a), dok su ćelije koje rastu u suspenziji imale difuzno bojenje aktina (slika 3b). Zanimljivo je da je količina filamentoznog aktina bila različita između suspenzijskih ćelijskih linija BHK-InV i BHK-2P. Medijan fluorescentnog intenziteta (MFI) nakon bojenja faloidinom bio je značajno veći u BHK-InV ćelijama u poređenju sa BHK-2P, što ukazuje na veći sadržaj filamentoznog aktina u ovim ćelijama (slika 3c).

3.3 Suspenzirane ćelije se razlikuju po efikasnosti transfekcije, ali ne i po sposobnosti prikazivanja površinskih proteina

Zbog razlika u konformaciji aktina između adherentnih i suspenzijskih ćelija, stanice su ispitivane s obzirom na njihovu prenosivost i sposobnost predstavljanja proteina na njihovoj površini. Općenito, efikasnost transfekcije, mjerena ekspresijom EGFP, smanjena je u ćelijama suspenzije (slika 4a). Kada se koristi niska doza reagensa za transfekciju, značajno veći procenat adherentnih ćelija je eksprimirao EGFP u poređenju sa ćelijama suspenzije. Kada je korišćena visoka doza transfekcionog reagensa, veći procenat ćelija suspenzije je uspešno transfektovan, iako razlika između visokih i niskih doza nije bila značajna. Da bi se odgovorilo na pitanje da li su suspenzijske ćelije i dalje sposobne da predstave proteine ​​kao što su ćelijski receptori na svojoj površini, ćelije su transficirane plazmidom koji kodira VSV G protein (slika 4b). Jedna serija ćelija je permeabilizirana prije bojenja kako bi se uzela u obzir mogućnost da je G protein eksprimiran, ali nije prikazan na površini ćelije. Nije bilo značajne razlike u sposobnosti ekspresije i prezentacije VSV G proteina između adherentnih i suspenzijskih ćelija, niti kada se koristila niska ili visoka doza transfekcionog reagensa.

3.4 Analiza transkriptoma otkriva razlike u ekspresiji gena povezanih sa ekstracelularnim matriksom između ćelija suspenzije

Urađena je analiza transkriptoma kako bi se dalje istražile razlike između adherentno rastućih BHK ćelija i BHK ćelija u suspenziji i da bi se razjasnilo zašto se suspenzijske ćelije razlikuju po svojoj osjetljivosti na FMDV. Adherentna BHK ćelijska linija (BHK179) uzgajana u MEM dopunjenoj FBS kao i brzorastuća ćelijska linija osjetljiva na FMDV (BHK-InV) i brzorastuća rezistentna ćelijska linija (BHK-2P), obje prilagođene ACFM-u, odabrani su za analizu.

Analiza glavnih komponenti (PCA) istakla je blisku vezu između bioloških replika pojedinačnih ćelijskih linija (slika 5a). Sve replike iste ćelijske linije nalaze se blisko jedna uz drugu na dijagramu sa malo naznaka efekata serije do serije. Prva glavna komponenta (koja čini 81 posto varijanse u normaliziranom skupu podataka) interpretirana je kao razlika u transkripciji između stanica koje rastu u suspenziji i stanica koje rastu u adherenciji, dok je druga glavna komponenta (15 posto varijanse) predstavljala razliku između suspenzijske ćelijske linije BHK-2P i BHK-InV, moguće povezane sa osjetljivošću na infekciju FMDV. Zajedno, prve dvije glavne komponente bile su u stanju da objasne 96 posto varijanse pronađene unutar skupa podataka, što ukazuje da je analiza transkriptoma identificirala relevantne razlike između tri ćelijske linije.

Najmanji broj različito eksprimiranih gena pronađen je kada se uporedi BHK-InV sa BHK-2P (590 regulirano naviše; 304 niže regulirano). Slični brojevi su viđeni u poređenju ili BHK-2P ili BHK-InV pojedinačno sa BHK179 (1527 i 1519 regulisano naviše; 1308 i 943 niže regulisano, respektivno) (slika 5b). Kada su dvije suspenzijske ćelijske linije (BHK-InV i BHK-2P) kombinovane i upoređene sa adherentnom ćelijskom linijom BHK179, 1814 gena je različito eksprimirano. Dok je 411 gena isključivo različito izraženo kada se poredi BHK179 sa BHK-InV, skoro dvostruko više (701 gen) je isključivo različito izraženo između BHK179 i BHK-2P. Između dvije suspenzijske ćelijske linije, samo 104 gena bila su isključivo različito izražena.

Kada se poredi skup različito eksprimiranih gena ćelijskih linija osjetljivih na FMDV BHK179 i BHK-InV sa ćelijskom linijom BHK-2P otpornom na FMDV, utvrđeno je da je podskup od 553 gena različito izražen u oba poređenja ( Slika 5c). Kako ovi geni mogu biti uključeni u osjetljivost na FMDV, provedena je analiza obogaćivanja termina GO i otkrila je da su mnogi od ovih gena povezani sa ćelijskim komponentama ekstracelularnog matriksa (ECM), ćelijskim membranama i spojevima stanica-ćelija (slika 5d) .

Pošto smo uočili razlike između ćelijskih linija koje se odnose na ECM interakcije, transkriptom je ponovo analiziran s fokusom na ekspresiju integrina v 1, v 3, v 6, v 8, kao i aktina, koji su svi potencijalno relevantni za osjetljivost na infekciju FMDV-om. (Slika 5e). Sa izuzetkom ACTA2, nije bilo značajne razlike u ekspresiji gena povezanih sa aktinom između BHK-InV i BHK-2P ćelija na nivou mRNA. Normalizirani broj gena za sve ispitivane gene povezane s aktinom bio je značajno veći u adherentnoj ćelijskoj liniji BHK179 nego u ćelijskim linijama suspenzije (S1 slika).

Sve tri ćelijske linije su izrazile slične količine ITGAV transkripata, kodirajući za integrinsku podjedinicu v, ali su pokazale diferencijalnu ekspresiju za podjedinice integrina. Detaljnije, ćelijske linije suspenzije BHK-2P i BHK-InV su eksprimirale značajno manje ITGB1, ITGB3 i ITGB6 u poređenju sa adherentnom ćelijskom linijom BHK179. ITGB3 i ITGB8 su značajno različito eksprimirani između suspenzijskih ćelijskih linija BHK-2P i BHK-InV. Zanimljivo, ITGB8 je bio jedini kodirajući gen za podjedinicu integrina koji je bio visoko eksprimiran u objema ćelijskim linijama BHK179 i BHK-InV osjetljivim na FMDV u poređenju sa ćelijskom linijom otpornom na FMDV BHK-2P (slika 5e).

cistanche može hraniti bubrege i poboljšati funkciju bubrega

4. Diskusija

Prilagodba stanica za rast u suspenziji i u mediju bez seruma je dugotrajan i postupan, ali neophodan proces u biotehnologiji za stvaranje ćelijskih linija visokog prinosa koje se koriste za proizvodnju antitijela, antigena vakcine ili drugih proteina [1, 8 ]. Zaista, ovaj proces je uvijek ispunjen rizikom da ćelije steknu neželjena svojstva u poređenju sa originalnim ćelijskim materijalom [7]. U slučaju proizvodnje antigena vakcine, osetljivost ćelijske linije na ciljni virus je od velike važnosti. Za virus slinavke i šapa (FMDV), dobro je poznat fenomen da su određene BHK ćelijske linije otporne na infekciju ili gube svoju osjetljivost tijekom ponovljene subkulture [20–22]. Osim toga, antigena svojstva virusa mogu varirati ovisno o stanici domaćinu [9].

Suspenzirane ćelije rastu nezavisno od površine i progutane su hranljivim medijima bogatim kiseonikom, omogućavajući im da brzo rastu. Brzo umnožavanje ćelija je neophodna karakteristika da se kultura lako i u kratkom vremenu poveća na velike količine. Uklanjanje seruma iz podloge je neophodno kako bi se smanjili troškovi, rizik od kontaminacije i pojednostavili procesi smanjenja veličine [23, 24].

Grupna analiza rasta različitih BHK suspenzijskih ćelijskih linija imala je za cilj da odredi da li je odabir prema brzorastućoj ćelijskoj populaciji u uvjetima bez seruma štetan za razmnožavanje FMDV. Zapravo, dvije od tri osjetljive ćelijske linije su rasle sporo, ali je utvrđeno da je njihova osjetljivost na FMDV nezavisna od njihovog metabolizma rasta. Vjerovatnije je da je osjetljivost na FMDV već izgubljena (ili zadržana) tokom početne adaptacije na rast u suspenziji. Odvajanje ćelija od površine i povlačenje seruma u sledećim koracima adaptacije na rast suspenzije dovodi do promene nivoa ekspresije površinskih proteina i proteina uključenih u citoskelet [7].

Integrini su važna porodica receptora na ćelijskoj površini koji su integrisani u ćelijsku membranu i posreduju u signalizaciji od ćelije do ćelije, kao i snažnu vezu između ćelije i površine kroz vezivanje komponenti ekstracelularnog matriksa (ECM) [10, 25 ]. Regulacija ćelijskog ciklusa, organizacija citoskeleta i translokacija novih receptorskih molekula u ćelijsku membranu zavise od integrina [25]. Za mnoge integrine, vezivanje ECM-a, kao i vezivanje liganada koji se dobijaju u ćelije dodatkom seruma u medijum kulture, posredovano je RGD motivom [6, 25] i verovatno će se promeniti kada stanica prelazi sa adherentnog na rast u suspenziji. Prepoznavanje RGD motiva od strane integrina također koristi FMDV za iniciranje receptorom posredovane endocitoze virusne čestice [26]. RGD motiv u VP1 FMDV je visoko očuvan [27], a integrini v 1, v 3, v 6 i v 8 su poznati receptori koje koristi FMDV in vivo i in vitro [28–31]. Budući da navodne razlike u proteomu ćelijske površine između adherentnih i suspenzijskih ćelija takođe mogu biti ključne za razlike u osetljivosti na infekciju FMDV-om, antitela koja se vezuju za integrin v 3 i v 8 korišćena su za bojenje adherentne BHK ćelijske linije, kao i osjetljiva i rezistentna suspenzija BHK ćelijske linije. Bojenje v 6 nije obavljeno jer je ranije pokazano da ovaj integrin nije eksprimiran na površini BHK ćelija [32], iako se ITGB6 mRNA može detektirati. Slično tome, uprkos visokom nivou ekspresije ITGB8 mRNA otkrivene u BHK179 i BHK-InV ćelijama, čini se da v 8 integrin uopšte nije prisutan na površini BHK ćelija. Integrin v 3 je u manjoj mjeri pronađen na adherentnoj ćelijskoj liniji, ali ne i na ćelijskim linijama suspenzije.

Osim integrina, vezivanje liganda, događaji internalizacije i intracelularna signalizacija mogu biti posredovani proteoglikanima heparan sulfata (HS) [33], a akvizicija HS kao sekundarnog receptora se često opaža nakon ponovljenog pasiranja FMDV u kulturi [34]. Bojenje specifičnim antitijelima otkrilo je obilje HS na obje ćelijske linije suspenzije iu manjoj mjeri i na adherentnim BHK ćelijama. Poznato je da mutacije u genomu FMDV-a, koje dovode do promjena u virusnim kapsidnim proteinima kako bi se omogućilo korištenje HS kao receptora, atenuiraju virus u prirodnom domaćinu [35]. Dostupnost HS bi stoga mogla biti ključni faktor za promijenjenu antigenost nezavisnosti FMDV stanične linije na koju je virus prilagođen.

Budući da je odvajanje ćelija povezano s promjenama u kontraktilnom mehanizmu aktin-miozin [7], a kultiviranje stanica u suspenziji donosi različite zahtjeve za preživljavanje, npr. otpornost na visoki smični stres zbog agitacije tečnosti kulture [6], aktinski skelet je bio od velikog interesa za ovu studiju. Mikroskopskom analizom otkriveno je konformaciono preuređenje citoskeleta od retikularne distribucije u adherentnim rastućim ćelijama do guste sferične strukture u uslovima suspenzije. Ovo bi mogao biti mehanizam prilagođavanja gore spomenutom velikom naprezanju smicanja, a poznato je i da se javlja u CHO ćelijama u istim uvjetima [6]. Ali također je vrijedno napomenuti da iako nije bilo značajne razlike u ekspresiji većine aktinskih gena između BHK-InV i BHK-2P ćelija na nivou mRNA, značajno više filamentoznog aktinskog proteina je otkriveno u BHK osjetljivom na FMDV. -InV nego u BHK-2P. Ovo može biti povezano s različitim brzinama polimerizacije globularnog aktina u filamentni aktin.

Barem u adherentnim ćelijama, ulazak FMDV zavisi od dinamike aktina. Ulazak virusa izaziva nabore aktina i poremećaj mreže aktinskih filamenata kroz konverziju filamentoznog aktina u globularni aktin opisan je u ranoj fazi infekcije [36-38]. Sudeći po citopatskom efektu (CPE) koji se vidi u adherentnim BHK ćelijama kada je inficiran FMDV, citoskelet prolazi kroz intenzivne rearanžmane u mnogim svojim komponentama [38]. Takav CPE se ne vidi u ćelijama suspenzije zbog njihovog već sfernog oblika, ali povišen sadržaj aktina može dati određenu prednost virusu. Zbog razlika u aktinskom citoskeletu, eksperimenti transfekcije su sprovedeni kako bi se uporedila efikasnost transfekcije između suspenzije i adherentnog BHK-a i utvrdilo da li gusti citoskelet ćelija suspenzije ometa prezentaciju proteina na površini ćelije. Opšte je poznato da se suspenzijske ćelijske linije vrlo teško transfektuju, što je uzrokovano smanjenim vezivanjem transfekcionog kompleksa za ćelijsku membranu i posljedično smanjenim unosom DNK korisnog opterećenja [39]. To su potvrdili i naši eksperimenti. Ali iako je efikasnost transfekcije smanjena u BHK-2P ćelijama u poređenju sa adherentnom BHK ćelijskom linijom, nije bilo razlike u sposobnosti prikazivanja transficiranog VSV G proteina na ćelijskoj površini. Uočena je razlika u procentu obojenih ćelija između ekspresijskih plazmida pEGFP-N1 i pVSV-G u BHK-2P ćelijama. Ovo nije dalje istraživano, ali može biti uzrokovano različitim granicama detekcije između imunofluorescentnog bojenja korištenog za vizualizaciju VSV-G i urođene fluorescencije EGFP-a.

Konačno, izvršena je analiza transkriptoma kako bi se dalo više informacija o transkripcijskim razlikama između adherentnih i suspenzijskih BHK ćelija s jedne strane i između BHK ćelijskih linija osjetljivih na FMDV i otpornih na FMDV s druge strane. Naši rezultati su u skladu sa drugim studijama transkriptomskih promena u CHO, MDCK ili HEK ćelijama tokom prelaska sa adherentnog na rast u suspenziji. Općenito, većina promjena je povezana sa strukturom citoskeleta, ćelijskim metabolizmom i interakcijama komponenti ECM-a i pojačano je regulirana za ćelije suspenzije [7, 40, 41]. Iznenađujuće, FMDV rezistentna BHK-2P ćelija suspenzije pokazala je smanjenje ovih genskih skupova, što bi takođe moglo objasniti smanjene nivoe aktina u BHK-2P u poređenju sa BHK-InV ćelijama. Specifična analiza ekspresije integrinske podjedinice otkrila je slične nivoe transkripata integrinske podjedinice V u sve tri ćelijske linije. Najveća ekspresija u svim ćelijskim linijama pronađena je za integrinsku podjedinicu 1. Važno je napomenuti da integrin 1 može formirati heterodimere sa deset različitih lanaca i da je konstitutivno eksprimiran u većini ćelija sisara [6, 42]. Slično, V podjedinica je u stanju da formira heterodimer sa pet različitih lanaca, ali 6 i 8 su samo prisutni na površini ćelije u kombinaciji sa V [42]. Ovo se tačno odražava u uočenom obilju transkripata pojedinačnih integrinskih podjedinica. Povišena transkripcija 3 u adherentnim ćelijama takođe dobro korelira sa višim signalom za integrin v 3 u eksperimentima bojenja antitijela. S druge strane, uočene razlike u nivoima ITGB3 i ITGB8 mRNA između BHK-2P i BHK-InV nisu se odrazile na površinsko bojenje. Nismo bili u mogućnosti da riješimo da li je to samo zbog različite osjetljivosti između metoda kvantifikacije mRNA i proteina ili je pokazatelj post-transkripcionog bloka ekspresije proteina ili površinske prezentacije [43]. Sve u svemu, ćelijske linije suspenzije BHK-2P i BHK-InV su eksprimirale značajno manje ITGB1, ITGB3 i ITGB6 mRNA u poređenju sa adherentnom ćelijskom linijom.

5. ZaključciIn

U zaključku, od kritične je važnosti u pripremi ćelija suspenzije da se koristi roditeljski klon ćelije sa dobro poznatim karakteristikama i da se rezultujuća ćelijska populacija pažljivo pregleda tokom procesa adaptacije kako bi se osiguralo da ćelijska linija zadrži bitne karakteristike, u ovom slučaju , osjetljivost na FMDV. Pored toga, moderne metode kao što su FACS analiza i transkriptomika treba da se koriste za dalju karakterizaciju proizvodnih ćelijskih linija.

cistanche može hraniti bubrege i poboljšati funkciju bubrega

Priznanja

Zahvaljujemo Patricku Zitzowu na odličnoj tehničkoj podršci.

Prilozi autora

Konceptualizacija:Veronika Dill, Michael Eschbaumer.

Formalna analiza:Veronika Dill, Florian Pfaff.

Finansijska akvizicija:Aline Zimmer, Martin Beer.

istraga:Veronika Dill.

metodologija:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Administracija projekta:Martin Beer. Resursi: Aline Zimmer.

nadzor:Michael Eschbaumer.

Vizualizacija:Veronika Dill, Florian Pfaff, Michael Eschbaumer.

Pisanje – originalna verzija:Veronika Dill.

Pisanje – pregled i uređivanje:Veronika Dill, Florian Pfaff, Aline Zimmer, Martin Beer, Michael Eschbaumer.

Reference

1. Merten OW. Napredak u kulturi ćelija: zavisnost od sidrenja. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.2015; 370(1661):20140040.

2. Dingermann T. Rekombinantni terapeutski proteini: proizvodne platforme i izazovi. Biotechnol J.2008; 3(1):90–7.

3. Hernandez R, Brown DT. Rast i održavanje ćelija bubrega hrčka (BHK). Curr ProtocMicrobiol. 2010; Poglavlje 4: Dodatak 4H. mca04hs17 PMID: 20440683

4. Cruz HJ, Moreira JL, Stacey G, Dias EM, Hayes K, Looby D, et al. Adaptacija BHK ćelija koje proizvode rekombinantni protein na medij bez seruma i medij bez proteina. Citotehnologija. 1998; 26(1):59–64.

5. Guskey LE, Jenkin HM. Adaptacija BHK-21 ćelija na rast u šejker kulturi i naknadni izazov virusom japanskog encefalitisa. Appl Microbiol. 1975; 30(3):433–8. https://doi.org/10.1128/am. 30.3.433-438.1975 PMID: 1237269

6. Walther CG, Whitfield R, James DC. Važnost interakcije između citoskeleta integrina i aktina u adaptaciji suspenzije CHO ćelija. Appl Biochem Biotechnol. 2016; 178(7):1286–302.

7. Kluge S, Benndorf D, Genzel Y, Scharfenberg K, Rapp E, Reichl U. Praćenje promjena u proteomu tokom postupne adaptacije MDCK ćelijske linije od adherencije do rasta u suspenziji. Vakcina. 2015; 33(35):4269–80.

8. Costa AR, Withers J, Rodrigues ME, McLoughlin N, Henriques M, Oliveira R, et al. Utjecaj adaptacije stanica na uvjete bez seruma na profil glikozilacije monoklonskog antitijela proizvedenog od stanica jajnika kineskog hrčka. N Biotechnol. 2013; 30(5):563–72. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2012.12. 002 PMID:23247406

9. Bolwell C, Brown AL, Barnett PV, Campbell RO, Clarke BE, Parry NR, et al. Selekcija ćelije domaćina antigenskih varijanti virusa slinavke i šapa. J Gen Virol. 1989; 70 (Pt 1): 45–57.

10. Wiesner S, Legate KR, Fassler R. Interakcije integrin-aktin. Cell Mol Life Sci. 2005; 62(10):1081–99.

11. O'Donnell V, Pacheco JM, Gregg D, Baxt B. Analiza ekspresije integrinskog receptora virusa slinavke i šapa u tkivima naivnih i inficiranih goveda. J Comp Pathol. 2009; 141(2–3):98–112. PMID: 19515380

12. Dill V, Hoffmann B, Zimmer A, Beer M, Eschbaumer M. Adaptacija FMDV Azije-1 na kulturu suspenzije: ćelijska rezistencija je prevaziđena promjenama kapsida virusa. Virusi. 2017; 9(8). https://doi.org/10. 3390/v9080231 PMID:28820470

13. Macpherson I, Stoker M. Transformacija polioma klonova ćelija hrčka – istraživanje genetskih faktora koji utiču na ćelijsku kompetenciju. Virology. 1962; 16:147–51.

14. Rourou S, van der Ark A, van der Velden T, Kallel H. Proces ćelijske kulture mikronosača za razmnožavanje virusa bjesnila u Vero ćelijama uzgojenim u bioreaktoru s miješanjem u uvjetima potpuno bez životinjskih komponenti. Vakcina. 2007; 25(19):3879–89.

15. Martin M. Cutadapt uklanja sekvence adaptera iz sekvencioniranja visoke propusnosti. EMBnetjournal. 2011; 17:10–2.

16. Patro R, Duggal G, Love MI, Irizarry RA, Kingsford C. Salmon pruža brzu kvantifikaciju ekspresije transkripta svjestan pristranosti. Nat Methods. 2017; 14(4):417–9.

17. Srivastava A, Malik L, Sarkar H, Zakeri M, Almodaresi F, Soneson C, et al. Metodologija poravnanja i mapiranja utječe na procjenu obilja transkripta. Genome Biol. 2020; 21(1):239.

18. Love MI, Huber W, Anders S. Umjerena procjena promjene nabora i disperzije za RNA-seq podatke sa DESeq2. Genome Biol. 2014; 15(12):550.

19. Zhu A, Ibrahim JG, Love MI. Prethodne distribucije s teškim repom za podatke o brojanju sekvenci: uklanjanje šuma i očuvanje velikih razlika. Bioinformatika. 2019; 35(12):2084–92.

20. Clarke JB, Spier RE. Varijacije u osjetljivosti BHK populacija i kloniranih ćelijskih linija na tri soja virusa slinavke i šapa. Arch Virol. 1980; 63(1):1–9.