Norwogonin ublažava oksidativni stres i apoptozu izazvanu hipoksijom u PC12 ćelijama

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Abstract

Pozadina: Norwogonin je prirodni flavon sa tri fenolne hidroksilne grupe u skeletnoj strukturi i ima odličneantioksidativno djelovanje. Međutim, neuroprotektivni učinak norwogonina ostaje nejasan. Ovdje smo istraživali zaštitni kapacitet norwogonina protiv oksidativnog oštećenja izazvanog hipoksijom u PC12 stanicama. Metode: Vijabilnost ćelija i apoptoza su ispitani MTT testom i Aneksin V-FITC/PI bojenjem, respektivno. Sadržaj reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) mjeren je pomoću DCFH-DA testa. Laktat dehidrogenaza (LDH), malondialdehid (MDA) iantioksidativni enzimnivoi su određeni korišćenjem komercijalnih kompleta. Ekspresija srodnih gena i proteina mjerena je kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu i Western blotting-om, respektivno. Rezultati: Otkrili smo da norwogonin ublažava ozljede uzrokovane hipoksijom u PC12 stanicama povećavajući vitalnost stanica, smanjujući oslobađanje LDH i poboljšavajući promjene u morfologiji stanica. Norwogonin je takođe delovao kaoantioksidantuklanjanjem ROS, smanjenjem proizvodnje MDA, održavanjem aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GPx) i smanjenjem nivoa ekspresije HIF-1 i VEGF. Osim toga, wogonin je spriječio ćelijsku apoptozu inhibiranjem nivoa ekspresije kaspaze-3, citokroma c i Baxa uz povećanje nivoa ekspresije Bcl-2 i omjera Bcl-2/Bax. Zaključci: Norwogonin ublažava ozljede izazvane hipoksijom u PC12 stanicama tako što gasi ROS, održava aktivnosti antioksidativnih enzima i inhibira put mitohondrijalne apoptoze.

Ključne riječi: Norwogonin,Antioksidativna aktivnost, hipoksija, oksidativni stres,Apoptoza

Pozadina

Aerobnim organizmima je potreban kisik (O2) za proizvodnju energije. Hipoksija se definira kao nedovoljna opskrba O2 za održavanje ćelijske funkcije u tkivu i često se javlja u nekim fiziološkim situacijama kao što je velika nadmorska visina [1], te u mnogim patološkim situacijama kao što je moždani udar [2]. Mozak je posebno osjetljiv na ozljede uzrokovane hipoksijom zbog velike potrošnje kisika, bogate nezasićenim masnim kiselinama i niskeantioksidativni kapacitet[3]. Sve veći broj dokaza ukazuje da hipoksija može izazvati štetne efekte na mozak [4-6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia i Huiping Ma

Odjel za farmaciju, 940. bolnica združenih snaga logističke podrške PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Kina

Oksidativni stres i apoptoza se smatraju dvama faktorima koji doprinose povredi izazvanoj hipoksijom [7, 8]. Prijavljeno je da izloženost hipoksiji povećava proizvodnju intracelularnih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), što olakšava oksidativni stres. Prekomjerni ROS, kao što su superoksidni anion (O2-˙), vodikov peroksid (H2O2) i hidroksilni radikal (HO•), dovodi do strukturnih i funkcionalnih ćelijskih promjena napadajući lipide, membrane, proteine ​​i DNK, a zatim uzrokuje oštećenje stanica [ 9].

Kliknite za cistanche NZ za antioksidans

Istovremeno, prekomjerno proizvedeni ROS također olakšava otvaranje prelaznih pora mitohondrijalne permeabilnosti (mPTP) [10] i prijenos proteina pro-apoptoze na vanjsku mitohondrijsku membranu, što inducira depolarizaciju mitohondrijalnih membrana i oslobađanje citokroma c [11]. Ove promjene na kraju uzrokuju apoptozu zavisnu od mitohondrija [12]. Dakle, vjeruje se da antioksidansi sa sposobnošću inhibiranja ili eliminacije prekomjernog ROS-a mogu ispoljiti svoj zaštitni učinak putem slabljenja oksidativnog stresa i apoptoze izazvane hipoksijom. Mnoga istraživanja su dokazala da antioksidativni dodaci poput vitamina C [13], izoflavona [8] i radikala nitroksida [14] mogu ograničiti ozljede uzrokovane hipoksijom in vitro i in vivo. Flavonoidi su velika i raznolika klasa sveprisutnih biljnih sekundarnih metabolita. Uvijek se smatraju odličnim prirodnim antioksidansom sa sposobnošću uklanjanja slobodnih radikala i inhibiranja peroksidacije lipida.

Trenutno se sve više pažnje poklanja ovoj klasi jedinjenja zbog njihovog blagotvornog dejstva na zdravlje ljudi. Pokazalo se da flavonoidi posjeduju širok spektar farmakoloških djelovanja, kao što su protuupalna, antinociceptivna i neuroprotektivna aktivnost, itd., što se sve može pripisati njihovom antioksidativnom djelovanju [15]. Mnoge studije su pokazale da flavonoidi pokazuju odlične zaštitne efekte na neuspjeh uzrokovan hipoksijom. Na primjer, rutin ima snažan neuroprotektivni učinak protiv smrti ganglijskih stanica retine uzrokovane hipoksijom [16]. Nedavna studija također pokazuje da rutin može ublažiti oštećenje hipoksije izazvano kobalt hloridom inhibiranjem oksidativnog stresa i apoptoze u ćelijama H9c2 [17]. Štaviše, Liu i saradnici sugeriraju da nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-heksametoksi flavon) ublažava I/R ozljedu miokarda aktivacijom Akt/GSK-3 puta u H9c2 ćeliji [18]. Osim toga, akacetin može zaštititi kardiomiocite štakora i H9C2 kardiomioblaste od ozljede izazvane hipoksijom/reoksigenacijom putem AMPK posredovane aktivacije Nrf2 signalnog puta [19].

Norwogonin (5,7,8-trihidroksi flavon, slika 1) je farmakološki aktivan flavon odvojen od korijena Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" na kineskom), tradicionalne kineske biljke koja se koristi za liječenje gripe i raka [20, 21]. Međutim, objavljene su ograničene studije o biološkim aktivnostima norwogonina zbog njegovih niskih razina u prirodnim biljkama. Kako bi se riješio ovaj problem, objavljeno je nekoliko metoda sinteze norwogonina [22, 23].

Naša prethodna studija takođe je utvrdila jednostavnu metodu za dobijanje norvogonina iz krizina u četiri koraka [24]. Ova istraživanja su pozitivno uticala na dalju evaluaciju bioloških aktivnosti norwogonina. Studije su otkrile da norwogonin posjeduje antioksidativno [25], antikancerogeno [26, 27], antivirusno [28] i antimikrobno djelovanje [29], kao i da inhibira cijanidom stimuliranu proizvodnju ROS [30]. Međutim, ostaje nepoznato da li norwogonin ima zaštitne kapacitete protiv povreda izazvanih hipoksijom. Cilj ove studije bio je istražiti zaštitne efekte norwogonina protiv oksidativnog stresa izazvanog hipoksijom i apoptoze u PC12 stanicama.

Metode

Materijali i reagensi

Norwogonin (čistoća veća ili jednaka 98 posto) je sintetiziran prema našoj prethodno objavljenoj metodi [24]. Rutin (čistoća veća ili jednaka 96 posto) je kupljen od Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Kina). Norwogonin i rutin su rastvoreni u sterilnom dimetil sulfoksidu (DMSO), čuvani na -20 stepeni i razblaženi u medijumu ćelijske kulture neposredno pre upotrebe. Dulbecco-ov modifikovani Eagleov medijum (DMEM), fetalni goveđi serum (FBS), streptomicin i penicilin kupljeni su od Solarbio co., Ltd. (Peking, Kina).

Kompleti malondialdehida (MDA), laktat dehidrogenaze (LDH), superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT) i glutation peroksidaze (GPx) nabavljeni su od Instituta za bioinženjering u Nanjing Jiancheng (Jiangsu, Kina). 2′,7′-dihlorid-hidrofluorescein diacetat (DCFH-DA) i (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazolijum bromid) tetrazolijum (MTT) je dobijen od Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, SAD). Primarna antitijela za faktor koji izaziva hipoksiju-1 (HIF-1), vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), B ćelijski limfom-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} povezani X protein (Bax), kaspaza-3, citokrom C i -aktin su svi kupljeni od Abcam-a (Cambridge, UK). Sekundarna antitela su dobijena od kompanije ZsBio (Peking, Kina).

Komplet za analizu apoptoze nabavljen je od Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Kina). Sve hemikalije i rastvarači su bili analitičkog kvaliteta i nabavljeni su od komercijalnog dobavljača u Kini. Ćelijska kultura PC12 ćelije su kupljene od Banke ćelija Kineske akademije nauka (TCR 9, Šangaj, Kina) i održavane u DMEM sa 10 procenata (v/v) FBS, 100 U/mL penicilina i 100 U/mL streptomicina na 37 stepeni u vlažnom inkubatoru koji sadrži 5 posto CO2. Za procjenu citotoksičnosti norwogonina, PC12 ćelije (pasaž 4 ~ 6) su prethodno inkubirane s različitim koncentracijama (10−8, 10−7, 10−6, 10−5, 10−4 mol/L) nor wogonina za 1 h, a zatim kultivisan 24 h. Izloženost hipoksiji Da bi se indukovao model oštećenja hipoksije ćelije, PC12 ćelije su bile podvrgnute okruženju hipoksije (1 procenat O2, 5 procenata CO2 i 94 procenata N2) na 37 stepeni tokom 24 sata u vlažnoj komori. Normoksične kontrolne ćelije su uzgajane na 37 stepeni u inkubatoru sa 5% CO2 tokom 24 h.

Za procjenu zaštitnog efekta norwogonina od oštećenja uzrokovanih hipoksijom, PC12 ćelije su prethodno inkubirane s različitim koncentracijama (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) norwogonina 1 h prije tretmana hipoksije. Vijabilnost ćelija Vijabilnost ćelija je merena MTT testom kao što je prethodno opisano [31]. Ukratko, PC12 ćelije (1 × 105 ćelija/mL) su zasejane u ploče za kulturu sa 96 jažica. Zatim su u jažice dodane različite koncentracije norwogonina. Jednaka zapremina DMSO je dodata u kontrolne jažice. Konačna koncentracija DMSO u mediju stanične kulture je 0,1 posto. Nakon inkubacije u normoksičnim ili hipoksičnim uslovima, 10 μL MTT (5,0 mg/mL) je dodato u svaku jažicu, nakon čega je usledila inkubacija na 37 stepeni tokom 4 h. Zatim je supernatant sa MTT uklonjen i produkt formazana je otopljen u 100 μL DMSO. Apsorbancija je izmjerena na SpectraMax i3 čitaču mikroploča (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornija, SAD) na 570 nm. Rezultati su izraženi kao relativni procenat kontrolne grupe. PC12 ćelije koje su obojene hematoksilinom i eozinom (HE) zasijane na staklenim pokrovnim staklima inkubirane su 24 sata prije nego što su tretirane norwogoninom na isti način kao što je gore opisano.

Medijum je uklonjen i staklena pokrovna stakla su isprana hladnim PBS, nakon čega je usledila fiksacija metanolom 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim isprana hladnim PBS tri puta po 5 minuta. Na kraju, ćelije su obojene prema HE protokolu bojenja [32]. Analize ćelije su rađene na mikroskopu OLYMPUS IX73 (100×) u cilju verifikacije morfoloških promena ćelije. Digitalne slike su dobijene pomoću digitalnog fotoaparata DXM 1200 C (Nikon) povezanog sa mikroskopom. Sadržaj ROS-a Intracelularni nivo ROS-a u PC12 ćelijama određen je pomoću DCFH-DA testa [33]. Ukratko, PC12 ćelije (1 × 105 ćelija/mL) su zasijane u 6-ploče sa bunarima. Nakon tretmana hipoksije, PC12 ćelije su isprane sa PBS, a zatim su inkubirane u medijumu kulture koji sadrži 10 μM DCFH-DA tokom 30 minuta u mraku na 37 stepeni. Ćelije su posmatrane Olympus invertovanim fluorescentnim mikroskopom (Tokio, Japan) i analizirane Becton Dickinson FACScan protočnim citometrom (BD Biosciences, Kalifornija, SAD) sa talasnom dužinom ekscitacije od 488 nm i talasnom dužinom emisije od 525 nm. Nivo ROS-a je izražen kao relativni procenat kontrole. Curenje LDH, sadržaj MDA i aktivnost antioksidativnog enzima PC12 ćelije (1 × 105 ćelija/mL) zasijane su u posudu od 90 mm. Nakon tretmana hipoksije kao što je gore opisano, sakupljeno je 50 μL supernatanta kulture iz svake posude, a aktivnost LDH u mediju je otkrivena korištenjem komercijalnih kompleta za analizu (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kina) i izražena je kao U/mL. PC12 ćelije su sakupljene i homogenizovane nakon dva puta ispiranja sa hladnim PBS. Koncentracija ukupnog proteina izmjerena je kompletom za analizu BCA proteina. Sadržaj MDA i aktivnost antioksidativnog enzima određeni su korištenjem komercijalnih kompleta za analizu (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Kina).

Sadržaj MDA je predstavljen kao nmol/mg proteina. Aktivnosti SOD, CAT i GPx predstavljene su kao U/mg proteina. Apoptoza ćelija (Aneksin-V/PI bojenje) Nakon tretmana hipoksije, PC12 ćelije su sakupljene, isprane dva puta hladnim PBS, a zatim suspendovane puferom za vezivanje. Ćelije su tretirane rastvorom Annexin V-FITC i PI prema protokolu proizvođača (Beyotime, Šangaj, Kina). Prikupljanje podataka obavljeno je pomoću protočnog citometra Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Kvantitativna PCR analiza u realnom vremenu Ukupna RNK ćelija PC12 ekstrahirana je pomoću Trizol reagensa (Takara, Dalian, Kina) i pretvorena u cDNK korištenjem PrimeScript TM RT kompleta reagensa (AK4301,

Takara, Dalian, Kina). cDNK koji kodira HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, kaspazu-3, citokrom C i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) gen je umnožen kvantitativnim realnim vremenski PCR koristeći 7300 sistem za detekciju u realnom vremenu (Applied Biosystems, CA, SAD). Korišćeni prajmeri su prikazani u tabeli 1. Uslovi ciklusa PCR-a bili su 95 stepeni tokom 30 s, nakon čega je usledilo 40 ciklusa od 95 stepeni tokom 5 s i 60 stepeni tokom 31 s. Nivoi mRNA su izračunati korištenjem 2-ΔΔCt metode i normalizirani na GAPDH, koji je referentni gen. Western blot PC12 ćelije su sakupljene i homogenizovane u RIPA agensima. Koncentracija ukupnih proteina je kvantificirana korištenjem kompleta za analizu proteina BCA. 30 ug uzoraka je razdvojeno na 12% SDS-PAGE elektroforezi i zatim prebačeno na membrane od poliviniliden fluorida (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, SAD).

Membrane su blokirane sa 5% nemasnog suhog mlijeka u TBST puferu 1 h na sobnoj temperaturi i inkubirane sa primarnim antitijelima: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), anti kaspaza-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), anti citokrom C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) i anti- -aktin (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) na 4 stepena preko noći. Zatim su membrane isprane i inkubirane sa sekundarnim antitelima (1:2000, ZsBio, Peking, Kina;) 1 h na sobnoj temperaturi. Imunoreaktivne trake su vizualizirane korištenjem reagensa poboljšane hemiluminiscencije (ECL). Relativni intenziteti traka su normalizovani na internu kontrolu -aktina i analizirani korišćenjem Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, SAD).

Statistička analiza

Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost ± SD izvedena iz najmanje tri nezavisna eksperimenta. Razlika između grupa analizirana je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) nakon čega je uslijedio post hoc test Student–Newman–Keuls. P-vrijednost < 0.05="" smatrana="" je="" statistički="">

Rezultati

Norwogonin zaštitne PC12 ćelije protiv povreda izazvanih hipoksijom

Prvo, da bi se spriječila proliferativna aktivnost norwogonina, određena je njegova citotoksičnost na normalne PC12 ćelije korištenjem MTT testa. Kao što se vidi na slici 2a, ćelijska proliferacija nije značajno promijenjena nakon tretmana norwogoninom u koncentracijama od 1 × 10− 8 -1 × 10− 5 mol/L (P > 0,05 ). Međutim, vitalnost ćelija se značajno smanjila kada je koncentracija norwogonina povećana na 1 × 10-4 mol/L (P < 0,05).="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" norwogonin="" nije="" pokazao="" toksičnost="" ili="" proliferativnu="" aktivnost="" na="" pc12="" ćelijama="" u="" koncentracijama="" od="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Zatim smo ispitali zaštitni efekat norwogonina protiv oštećenja PC12 ćelija izazvanih hipoksijom. Kao što je prikazano na slici 2b, u poređenju sa kontrolnom grupom, vitalnost ćelija u grupi sa hipoksijom je smanjena na 58,71 posto (P < 0.01).="" u="" poređenju="" sa="" tretmanom="" hipoksije,="" prethodno="" tretiran="" sa="" 1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" i="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" norwogonin="" dozno="" zaštićen="" pc12="" ćelije="" protiv="" povrede="" izazvane="" hipoksijom,="" obnavljajući="" vitalnost="" ćelija="" sa="" 58,71="" na="" 62,79="" procenata="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" procenata="" (p="">< 0,01)="" i="" 69,88="" procenata="" (p="">< 0,01),="" respektivno.="" prethodni="" tretman="" sa="" 1="" ×="" 10−6="" mol/l="" rutina="" je="" takođe="" pokazao="" zaštitni="" efekat,="" značajno="" povećavajući="" vitalnost="" ćelija="" na="" 63,78="" procenata="" u="" poređenju="" sa="" tretmanom="" hipoksije.="" vijabilnost="" prethodno="" tretirana="" sa="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" norwogonina="" smanjena="" je="" na="" 63,43="" posto,="" što="" je="" još="" uvijek="" značajno="" više="" od="" one="" u="" grupi="" hipoksije="" (p="">< 0,05).="" ovi="" rezultati="" su="" pokazali="" da="" je="" norwogonin="" pokazao="" značajnu="" citoprotekciju="" u="" koncentracijama="" od="" 1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l,="" a="" najefikasnija="" koncentracija="" je="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" zatim="" je="" ova="" doza="" korištena="" kao="" optimalna="" doza="" u="" sljedećim="">

Zaštitni kapacitet norwogonina je također potvrđen morfološkim promjenama. Kao što je prikazano na slici 2c, PC12 ćelije bez tretmana hipoksije dobro su rasle pravilnih oblika (fusiform), ujednačene veličine. Nakon izlaganja hipoksiji, PC12 ćelije su pokazale skupljanje, zaobljen oblik, deskvamaciju i smanjenu gustinu ćelija. Ćelije koje su prethodno tretirane norwogoninom ili rutinom prije izlaganja hipoksiji su bolje rasle, smanjio se broj ćelija deskvamacije, a oblik ćelije se normalno oporavio. Osim toga, zaštitna sposobnost norwogonina potvrđena je curenjem LDH, što je povezano sa gubitkom integriteta ćelijske membrane. Kao što je prikazano na slici 2d, aktivnost LDH u mediju kulture je značajno povećana nakon izlaganja hipoksiji (P <>

Predtretman norwogoninom ili rutinom dramatično je smanjio curenje LDH, što sugerira da su norwogonin i rutin obnovili integritet ćelijske membrane. Norwogonin inhibira oksidativni stres izazvan hipoksijom u PC12 ćelijama ROS i MDA su dva važna indikatora ćelijskog oksidativnog stresa izazvanog hipoksijom. Kao što je prikazano na slikama 3a i b, značajno povećan sadržaj ROS i MDA je uočen u PC12 ćelijama nakon izlaganja hipoksiji. Predtretman norvogoninom ili rutinom značajno je inhibirao proizvodnju ROS i MDA.

Antioksidativni enzimi, kao što su SOD, CAT i GPx, smatraju se glavnim odbrambenim sistemom protiv oksidativnog stresa u ćelijama. Kao što je prikazano na slici 3c-e, izloženost hipoksiji značajno je inhibirala aktivnosti SOD, CAT i GPx u PC12 ćelijama. Tretman norwogoninom ili rutinom preokrenuo je ove promjene i obnovio aktivnosti antioksidativnih enzima. Svi ovi rezultati su pokazali da norwogonin štiti ćelije PC12 od oksidativnog stresa izazvanog hipoksijom.