Novi antioksidativni sastojci iz nusproizvoda pivare za kozmetičke formulacije

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

sažetak:Svrha ovog rada bila je procijeniti ukupan sadržaj fenola i antioksidativno djelovanje različitih vrsta ručno rađenih piva (Ego, Alter, IFiat Lux, Triplo Malto, Ubi i Maior), kao i polaznih materijala (slada, hmelja i kvasac), međuproizvode i otpadne proizvode (potrošeni slad, hmelj i kvasac), s obzirom na njihovu upotrebu u inovativnim kozmetičkim formulacijama. Ekstrakcije iz početnih i istrošenih uzoraka uzete su iz vode ili alkohola od 70 stepeni. Ukupni sadržaj fenola (Folin Ciocalteau Essay) svih pivarskih proizvoda ovisio je o specifičnom proizvodu koji se ispituje. Najveće vrijednosti su utvrđene u početnom hmelju (u rasponu od približno 93 do 155 mg GAE/g, prema ekstrakcijskom otapalu), srednje vrijednosti u početnom sladu i početnom kvascu, a najniže vrijednosti u sladovini. Ukupni sadržaj fenola u finalnim pivima potiče od fenola koji su ekstrahovani iz različitih sastojaka, odnosno početnih sladova, hmelja i kvasca, ali su i dalje uočene nezanemarljive vrijednosti u istrošenim proizvodima. Metoda korišćena za procenu antioksidativne aktivnosti, Trolox ekvivalentnog antioksidativnog kapaciteta (LPPH), antioksidativnog parametra koji redukuje feriione (FRAP) i aktivnosti uklanjanja i redukcione moći radikala kationa (ABTS) snažno je uticala na rezultate. Općenito, rezultati su odražavali trend uočen za ukupni sadržaj fenola: da se piva progresivno obogaćuju fenolima koji potiču iz svih početnih sastojaka, te da istrošeni proizvodi i dalje posjeduju nezanemarljivo antioksidativno djelovanje.cistanche holesterolZanimljivo je primijetiti da je otpadni kvasac često pokazivao veće vrijednosti od vrijednosti polaznog materijala; može se zaključiti da je kvasac u stanju da apsorbuje fenole iz piva tokom kuvanja. Uzimajući u obzir interes za eksploataciju otpada nastalog od prerade hrane, biološka aktivnost otpadnih proizvoda Alter pivare je procijenjena na ćelijskoj kulturi keratinocita (istrošenih proizvoda slada, hmelja i kvasca). Provedeni su preliminarni in vitro testovi u keratinocitnim HaCaT ćelijama kako bi se procijenila potencijalna bioaktivnost istrošenih ekstrakata. Među potrošenim ekstraktima, istrošeni ekstrakti hmelja i kvasca pokazali su sposobnost poboljšanja mitohondrijalne aktivnosti i sprječavanja oksidativnog stresa u HaCaT stanicama, dvije karakteristike starenja kože. Zaključno, ova studija nudi dokaze da otpad iz ručno izrađenog piva može biti zanimljiv izvor fenola za pripremu kozmetike protiv starenja kože.

Ključne riječi:craft pivo; proizvodi za proizvodnju piva; ukupni sadržaj fenola; antioksidativna aktivnost; citotoksičnost;protiv starenja

1. Uvod

Craftbeer je postao sve popularniji u SAD-u i Evropi [1,2], sa važnim reperkusijama za ekonomiju [3]. Ovaj uspjeh potaknut je interesom potrošača za degustiranjem novih piva različitih okusa i aroma [2] i pažnjom na zdravstvene prednosti umjerene konzumacije piva [4].

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Za razliku od komercijalnih piva, craft piva su nefiltrirana i nepasterizirana, te stoga njihove senzorne karakteristike ostaju nepromijenjene u procesu kuhanja. Osim toga, tvari koje su korisne za zdravlje, kao što su antioksidansi, također mogu biti pošteđene.

Komercijalna piva i njihovi otpadni proizvodi već su procijenjeni zbog svojih antioksidativnih svojstava. Zhao et al. [5] utvrdili su profile fenola i odgovarajuće antioksidativne aktivnosti 34 komercijalna piva i pronašli značajne razlike u ukupnom i pojedinačnom sadržaju fenola i antioksidativnom djelovanju. Najzastupljenija fenolna jedinjenja bile su galna i ferulna kiselina. U istom periodu, Ribeiro Tafulo et al. [6] utvrdio je antioksidativnu aktivnost 27 drugih komercijalnih piva, koristeći nekoliko spektrofotometrijskih metoda. Iste godine, Piazzon et al., 2010 [7] procijenili su antioksidativnu aktivnost i sadržaj fenola u različitim vrstama komercijalnih piva (abbey, ale, bock, pšenično, lager, pilsner i dealkoholizirano) i otkrili veliku raznolikost među njima. U studiji o domaćim pivima, Farcas et al. [8] određivao je ukupan sadržaj polifenola i antioksidativnu aktivnost tokom čitavog procesa proizvodnje, počevši od sirovina (slad i hmelj) pa do oporavljenog otpada. Pokazali su da je početni veći sadržaj ukupnog polifenola i antioksidativna aktivnost u sirovinama posljedica prisustva slada te da se ukupni sadržaj polifenola snažno smanjio pri prelasku u pivo i istrošenog slada u finalnom pivskom proizvodu i u istrošenom sladu. Kvasac nije analiziran.

Cistanche može protiv starenja

Činjenicu antioksidativnih spojeva dobivenih iz slada dokazali su Zhao i saradnici [9], koji su pokazali antioksidativno djelovanje i ukupni sadržaj fenola u nekoliko sorti pivarskog ječma. Drugi autori su identifikovali četrdeset sedam jedinjenja fenola iz četiri vrste komercijalnog piva, koristeći tečnu hromatografiju u kombinaciji sa elektrosprej jonizacionom hibridnom linearnom kvadrupolnom orbitrap tehnikom masene spektrometrije [10]. Nedavno je HPLC-ESI-MS/MS analizama postignuta identifikacija niskomolekularnih fenolnih i dušikovih spojeva u craft pivu [11]. Autori su pokušali razlikovati vrste piva, kao što su IPA, Lager i Weiss, prema fenolnim i dušičnim spojevima, ali nisu pronašli značajne razlike u tim spojevima među različitim vrstama piva.

Nedavno [12], 20 fenolnih jedinjenja, na primjer, galna kiselina, katehin, kafeinska kiselina, kvercetin, ksantohumol i humulon, odabrano je i kvantificirano u različitim zanatskim pivima, sladovini, početnim sastojcima za pivarstvo (ječmeni slad, hmelj i kvasac ) i nusproizvode (ječmena ljuska, istrošeni hmelj i istrošeni kvasac). Iz ovog istraživanja utvrđeno je da postoje značajne razlike među svim uzorcima i da sastav piva zavisi od prijema i procesa kuhanja. Fenolna jedinjenja piva uglavnom potiču iz ječmenog slada, a zanimljivo je da je kvasac bio u stanju da apsorbuje fenolna jedinjenja iz drugih izvora.

Stoga, procjena antioksidansa u otpadnim proizvodima proizvodnje piva može biti od velike važnosti ako se uzme u obzir brzi rast tržišta zanatskog piva u svijetu.

Eksploatacija pivarskih nusproizvoda za razvoj zdravstvenih proizvoda kao što su kozmetika i/ili suplementi pomogla bi povećanju održivosti proizvodnje piva. Ova studija ima više ciljeva: procijeniti ukupan sadržaj fenola i antioksidativno djelovanje različitih vrsta talijanskih zanatskih piva (lager, amber, trostruki slad, crveni i crni), te ocijeniti njihov međuproizvodni proizvod, kao i otpadne proizvode. Tako je procijenjena biološka aktivnost otpadnih ekstrakata iz Alter pivare na ljudskim keratinocitima. Ovo otvara nove i zanimljive mogućnosti za iskorištavanje novih sastojaka iz pivarskih nusproizvoda za koSmetičke formulacije.

2. Eksperimentalno

2.1. Materijali

11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine (TPTZ), (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX), 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(98%TLC)(ABTS), gallic acid, sodium carbonate monohydrate ACS reagent, sodium acetate and ethanol(ethanol absolute grade) were purchased from Sigma-Aldrich(Steinheim, Germany). Manganese (IV)oxidize activated(>90 posto) i Folin-Ciocalteuov fenol reagens kupljen je od Fluke (Buchs, Švicarska). Bezvodni natrijum acetat i bezvodni gvožđe (III)hlorid su kupljeni od JT Baker (Center Valley, PA, SAD), a bezvodni natrijum karbonat je kupljen od Carlo Erba (Milano, Italija). Svi rastvarači i reagensi su bili analitičke čistoće. Ultra čistu vodu proizvodi Gradient Milli-Q (Millipore, Molsheim, Francuska). Polazne materijale, ručna piva, sladovine i njihove otpadne proizvode ljubazno je isporučio Birrificio Collesi (Apecchio, Italija).

Detaljne karakteristike piva ispitanih u ovoj studiji date su u tabeli 1. Tip početnog slada i hmelja odredili su glavne razlike među svim pivima. Može se koristiti pet različitih početnih sladova, često u mješavinama i u različitim omjerima. Hmelj Perle i Saaz koriste se u različitim omjerima zbog različitih aroma. Isti kvasac, Saccharomyces Cerevisiae, korišten je za sva piva, koja su bila visokofermentirajuća. Različite kombinacije daju različite vrste piva (lager, amber, trostruki slad, crveno i crno) sa sadržajem alkohola u rasponu od 6.0 do 9.0 posto V/V.

2.2. Priprema uzorka

Prije analiza, polazni materijali (slad, hmelj i kvasac), piva, sladovine i otpad (istrošeni slad, hmelj i kvasac) podvrgnuti su različitim procesima prema svom fizičkom stanju, koji su mogli biti sušeni u čvrstom, vlažnom stanju. čvrsta ili mutna tečnost (tabela 2).

Vlažne čvrste materije i tečnosti su prvo podvrgnute liofilizaciji na temperaturi od {{0}} stepena i pritisku od 0,03 bara (FreeZone 1 Litre Benchtop Series 77400 zamrzivač za sušenje, LABCONCO, Kansans City, MO, SAD). Osušeni čvrsti materijali su podvrgnuti mljevenju u glodalici. Zatim su svi uzorci podvrgnuti ekstrakciji. Količina uzorka je pažljivo izmjerena i dispergirana u 100 mL rastvarača (voda ili etanol od 70 stupnjeva). Dobivena tečnost je stavljena u Erlenmajerovu tikvicu, koja je zatim pažljivo zatvorena. Uzorci su magnetski miješani 24 h na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirani na 12,000 o/min na 20 stepeni 10 minuta da bi se uklonile neotopljene čestice (Zetalab CNZ{13}}HE, Padova, Italija). Uzorci su liofilizirani i pohranjeni na -20 stepenu u polietilenskim bočicama od 50 mL sa poklopcem na navoj (BD Falcon TM, BD Biosciences, Bedford, MA, SAD) kako bi se osigurali optimalni uslovi skladištenja.

2.3. Određivanje ukupnog sadržaja fenola

Ukupni sadržaj fenola (TPC) u uzorcima određen je Folin-Ciocalteu spektrofotometrijskom metodom [13] uz određene modifikacije [14]. Ukratko, svi liofilizirani proizvodi korišteni su za pripremu bistrih otopina u koncentraciji od 10 mg mL-1. Alikvot od 50 μL ovog rastvora je dodat u 150 μL Folin-Ciocalteuovog fenolnog reagensa, razblaženog vodom 1:4. Zatim je dodano 50 uL zasićenog rastvora Na, CO3. Nakon inkubacije na sobnoj temperaturi od 10 minuta, apsorbancija svake jažice je određena na 765 nm pomoću čitača mikroploče (FLUOstar Omega, BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Njemačka). Mjerenje je upoređeno sa kalibracijskim standardnim rastvorom galne kiseline (GA), a rezultati su izraženi u miligramima ekvivalenata galne kiseline (GAE) po gramu nusproizvoda (mg GAE/g).

2.4. Procjena antioksidativne aktivnosti

Antioksidativna aktivnost zanatskog piva i nusproizvoda procijenjena je mjerenjem aktivnosti uklanjanja radikala 11-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH"), 2,2'-Azino-bis(3- etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS*) kapacitet uklanjanja radikala kationa i antioksidativni kapacitet za smanjenje željeza (FRAP).cistanche dosage redditTrolox (6-Hydroxy-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina) je korišten kao standard za kalibraciju. Vrijednosti su izražene kao mmol Trolox ekvivalent/g uzorka kao funkcija IC50, definirane kao koncentracija testiranog materijala potrebna da izazove 50 posto smanjenje početnog DPPH, ABTS ili koncentracije željeza.

2.5. Procjena Trolox ekvivalentnog antioksidativnog kapaciteta (DPPH)

Aktivnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH procijenjena je analitičkim testom na mikroploči prema ranije objavljenim metodama[15] uz neke modifikacije [16]. Ukratko, alikvot od 50 μL uzorka (koncentracija od 10 mg mL-') i standard je dodan u 150 μL DPPH u apsolutnom etanolu u 96- mikrotitarskoj ploči (BD FalconTM) nakon inkubacije na 37 stepena tokom 20 minuta, apsorbancija svake jažice je određena na 517 nm pomoću čitača mikroploče. Antioksidativna aktivnost je izračunata i izražena u odnosu na količinu Troloxa prema jednačini (1)[17] gdje su Ag i A apsorbancije rastvora DPPH● radikala na 517 nm u prisustvu kontrolnog uzorka i uzoraka ekstrakta, respektivno.

2.6. Aktivnost uklanjanja radikala i smanjenja snage (ABTS)

ABTS analiza je izvedena slijedeći prethodne procedure [18] i primijenjena na mikrolitarsku ploču sa 96-jažicom. ABTS* plus rastvor (5 mM) pripremljen je oksidacijom ABTS sa MnO, u vodi 30 minuta u mraku. Alikvot od 50 μL različitih koncentracija uzorka i standarda (Trolox) je dodan u 150 μL ABTS* rastvora u 96- mikrotitarskoj ploči (BD FalconTM).prednosti ekstrakta cistancheNakon inkubacije na sobnoj temperaturi od 10 minuta, apsorbancija svake jažice je određena na 734 nm pomoću čitača mikroploče. Vrijednosti su izračunate i izražene u odnosu na količinu Troloxa prema jednačini (2) [17] gdje su Ag i A apsorbancije otopine radikala OHe na 734 nm u prisustvu kontrolnog uzorka i uzorka ekstrakta, respektivno.

2.7. Parametar antioksidansa koji dugo smanjuje željezo (FRAP)

FRAP vrijednosti zanatskog piva/nusproizvoda određene su prema prethodno objavljenoj metodi [19], uz određene modifikacije [20]. FRAP reagens je pripremljen miješanjem sljedeća tri rastvora:

1. 50mL0,3M acetatnog pufera pH3,6(1,23g natrijum acetata u 50mL vode koja zakiseljuje

sa sirćetnom kiselinom);

2. 5 mLofstock rastvora 5mMTPTZ(2,4,6-Tripiridil-s-triazina)(15,6mg) u 40 mM HCl;3. 5 mL 5 mM FeCl3:6 H2O (16,2 mg) u 40 mM HCl.

FRAP reagens je zagrejan na 37 stepeni C pre upotrebe. Alikvoti uzorka od 25 μL (rastvori u koncentraciji od 10 mg mL-1) dodani su u tri primjerka u jažice 96-ploče s bunarčićima (BD Falcone). Test je započeo dodavanjem 175 μL FRAP reagensa u svaku jažicu. Ploča je odmah protresena u FLUOstar Omega čitaču ploča u trajanju od 30 sekundi i reakcija je ostavljena da teče 10 minuta nakon čega je ploča očitana na čitaču ploča (593 nm). Referentna otopina Troloxa je pokrenuta istovremeno i korištena za generiranje kalibracijske krive linearnom regresijom. Standardna kriva bila je linearna između 25 i 800 μM Trolox (TE). Rezultati su izraženi u μM Trolox ekvivalentnom （TE） gI uzorku.

2.8. Cell Cultures

Ćelijska linija ljudskih keratinocita, HaCaT, rutinski je uzgajana u Dulbecco-ovom modificiranom Eagle's Medium-u (DMEM), dopunjenom sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 2 mM L-glutamina, 50 U/mL penicilina i 50 ug/mL streptomicina 37 vlažni inkubator sa 5 posto CO. Da bi se procijenila citotoksičnost, mitohondrijalna aktivnost i intracelularno formiranje ROS-a, HaCaT ćelije su posađene u 96- ploče sa 2 x 10* ćelija po jažici. Svi eksperimenti su izvedeni nakon 24 h inkubacije na 37 stepeni u 5% CO. Za eksperimente sa HaCaT ćelijama pripremljene su osnovne otopine istrošenih ekstrakata u vodi od 60 mg/mL. Osnovni rastvori su zatim razrijeđeni u kompletnom mediju da bi se dobile željene koncentracije istrošenih ekstrakata.

2.9. Citotoksičnost i mitohondrijska aktivnost

Vijabilnost ćelije je procijenjena smanjenjem {{{{10}}}}(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenila -2H-tetrazolijum bromid (MTT) do njegovog nerastvorljivog formazana, kao što je prethodno opisano 21]. Ukratko, HaCaT ćelije su tretirane 24 h različitim koncentracijama ekstrakta (0.003-3 mg/mL) na 37 stepeni u 5 posto CO. Nakon toga, medij za tretman je zamijenjen sa MTT u Hankovoj balansiranoj otopini soli ( HBSS) (0,5 mg/mL) tokom 2 h na 37 stepeni u 5% CO. Nakon ispiranja sa HBSS, kristali formazana su rastvoreni u izopropanolu. Nivoi formazana su izmjereni (570 nm, referentni filter 690 nm) pomoću čitača ploča sa više naljepnica VICTORTM X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Vijabilnost ćelija je izražena kao procenat kontrolnih ćelija.

Mitohondrijalnu aktivnost određivao je MTT, kao što je prethodno opisano, uz male modifikacije [22].nuspojave cistanche deserticolaUkratko, HaCaT ćelije su tretirane 4 h ili sa DMEM 10 posto FBS (hranjivi medij) ili Dulbecco-ovim fosfatnim puferom (fiziološki rastvor bez nutrijenata) u prisustvu 0,03 mg/mL ekstrakta na 37 stepeni u 5 procenat CO. Nakon toga, tretman je zamenjen sa MTT tokom 2 h na 37 stepeni u 5 procenata CO2. Nakon ispiranja sa HBSS, kristali formazana su rastvoreni u izopropanolu. Nivoi formazana koji su u korelaciji sa mitohondrijalnom aktivnošću su izmjereni (570 nm, referentni filter 690 nm) pomoću čitača ploča sa više oznaka VICTORTM X3 (PerkinElmer). Mitohondrijska aktivnost je izražena kao procenat kontrolnih ćelija.

2.10. Intracelularno formiranje ROS

Formiranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) je procenjeno pomoću fluorescentne sonde 2'-7'dihlorodihidrofluorescein diacetata (H2DCF-DA), kao što je prethodno opisano [23](HaCaT ćelije su tretirane 2 h sa 0.{101} {23}}3 mg/mL ekstrakta na 37Cin 5% CO2. Nakon toga, medij za tretman je uklonjen i 100 μL H2DCF-DA (10ug/mL) je dodato u svaku jažicu. Nakon 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, Rastvor H2DCF-DA je zamijenjen rastvorom H2O2 (100 μM) tokom 30 min Paralelni set HaCaT ćelija je tretiran sa H2O i 0,03 mg/mL ekstrakta tokom 30 minuta.cistanche genghis khanFormiranje ROS-a je mjereno u terminima proizvoljnih jedinica fluorescencije, AUF (ekscitacija na 485 nm i emisija na 535 nm), korištenjem čitača ploča sa više oznaka VICTORTM X3 (PerkinElmer). Podaci su izraženi kao višestruko povećanje u formiranju ROS u odnosu na netretirane ćelije (tj. AUF ćelija tretiranih sa H, O,/AUF netretiranih ćelija).

Ovaj članak je preuzet iz Cosmetics 2021, 8, 96. https://doi.org/10.3390/cosmetics8040096 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics