Istraživanje potencijala islandskih ekstrakata morskih algi proizvedenih vodenom pulsnom ekstrakcijom potpomognutom električnim poljima za kozmetičke primjene, 2. dio

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

2.4. Antioksidativni kapaciteti ekstrakta islandskih algi

A.esculenta je imala najjaču aktivnost uklanjanja DPPH među sirovim ekstraktima tri vrste algi (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). Očekivalo se da će PEF ekstrakti pokazati bolje antioksidativne vrijednosti od ekstrakata proizvedenih vrućom tradicionalnom ekstrakcijom jer su druge studije pokazale da zelene tehnike (kao što je ekstrakcija uz pomoć mikrovalne pećnice ili enzimska ekstrakcija) mogu učinkovito izbjeći razgradnju bioaktivnih jedinjenja, pokazujući veće antioksidativne aktivnosti [59,60].

Sposobnost ekstrakata morskih algi da redukuju feri (Fe8#) u fero (Fe2 plus )ion i sposobnost uklanjanja radikala ABTS također je proučavana, metodom FRAP, odnosno ABTS. Rezultati FRAP-a pokazali su slične trendove kao i DPPH, pokazujući da je A. esculenta imala najjaču sposobnost redukcije feri (Fe3 plus ) do željeznih (Fe2 plus ) jona među sirovim ekstraktima tri vrste algi (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), što ukazuje da ove vrste vjerovatno sadrže neka efikasna jedinjenja koja su odgovorna za njihovu aktivnost čišćenja.

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Općenito, poznato je da smeđe alge imaju veći antioksidativni potencijal u odnosu na crvene i zelene porodice [61]. Naši rezultati su takođe pokazali da vodeni ekstrakti iz A. esculenta pokazuju efikasne antioksidativne aktivnosti u pogledu uklanjanja slobodnih radikala i redukcione moći, što sugeriše da bi A. esculenta potencijalno mogao da bude izvor prirodnih antioksidanata. Visoka antioksidativna aktivnost uočena za ekstrakte A.esculenta može biti povezana s visokim sadržajem fenolnih spojeva utvrđenih u ekstraktima smeđih algi. U mnogim studijama, antioksidativna aktivnost ekstrakata algi pripisana je fenolnim jedinjenjima, pokazujući pozitivne korelacije između sadržaja fenola i kapaciteta čišćenja uglavnom sa DPPH[62,63]. Slični rezultati korelacije pronađeni su u trenutnoj studiji za ekstrakte A.esculenta (pogledajte bolju diskusiju u Odjeljku 2.6. Korelacije između hemijskih jedinjenja i bioaktivnih svojstava).

2.5. Enzumatske inhibitorne aktivnosti ekstrakta islandskih algi

Ekstrakti islandskih algi pokazali su pozitivne inhibitorne efekte na sve testirane enzime (Tablica 4), otvarajući nove puteve za eksploataciju prirodnih enzimskih inhibitora iz resursa algi. Koliko nam je poznato, ovo je prvi put da su testirane enzimske inhibitorne aktivnosti ekstrakta islandskih algi koje proizvodi PEF.

buy cistanche

2.5.1. Aktivnost inhibicije kolagenaze

Ekstrakti A.esculenta su pokazali pozitivnu inhibiciju kolagenaze u rasponu od 68 do 91 posto, dok su ekstrakti P. palmaria i U. Lactuca pokazali beznačajnu inhibicionu aktivnost protiv kolagenaze (Tabela 4). Ekstrakt tople vode A.esculenta pokazao je 71,1 posto aktivnost kolagenaze, što je u velikoj mjeri bilo umjereno u aktivnosti kolagenaze. viši od standardnog rastvora epigalokatehin-3-galata (EGCG) (63,2 posto) i uporediv sa pozitivnim standardom koji obezbjeđuje komercijalni enzimski komplet (74,9 posto). Važan nalaz je bio da su ekstrakti A.esculenta proizvedeni od strane PEF-a pokazali inhibiciju kolagenaze od 91 posto, pokazujući čak i veću aktivnost od inhibitora koji nudi komercijalni komplet. Treba naglasiti da je ova aktivnost uočena samo u vodenim ekstraktima proizvedenim od PEF-a, a ne u kombinaciji PEF-a i HW-a. Ovo ponašanje se može objasniti mogućnošću da bi proces tople vode mogao imati negativan učinak na spojeve odgovorne za inhibiciju aktivnosti kolagenaze. Međutim, potrebne su dodatne studije da bi se objasnili ovi rezultati zbog složenosti sirovih ekstrakata algi. Gore spomenuta istraživačka grupa trenutno radi na identifikaciji inhibicijskih molekula u ekstraktima A.esculenta kako bi bolje razumjela ove pozitivne efekte koje proizvodi PEF.

Cistanche može protiv starenja

Rezultati u pogledu inhibicije kolagenaze ekstraktima A.esculenta su u skladu sa prethodnim podacima u kojima se A.esculenta koristi u komercijalnim ekstraktima zbog svog antiaging efekta. Do razgradnje kolagena dolazi sa starenjem zbog aktivnosti kolagenaze, što rezultira borama na koži. Inhibicija kolagenaze prirodnim spojevima je zanimljiva prilika za proizvode protiv starenja. Na primjer, SEPPIC, dobavljač sastojaka za kozmetičku industriju, nudi lipofilni ekstrakt A.esculenta (Kalpariane AD) [64].

2.5.2. Aktivnost inhibicije elastaze

Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). U poređenju sa rastvorima kvercetina, dobro poznatog inhibitora elastaze koji je pokazao 100 posto inhibiciju pri 1 mM i 58,7 posto pri 0,5 mM, učinak ekstrakata iz A. esculenta bio je visok.

Elastaza je enzim proteinaza koji može smanjiti elastin razbijanjem specifičnih peptidnih veza. Posljedično, inhibicija aktivnosti elastaze u sloju dermisa može se koristiti za održavanje elastičnosti kože [65]. Mnogi biljni ekstrakti su identificirani kao inhibitori elastaze [17]; međutim, provedeno je nekoliko istraživanja o inhibiciji elastaze iz izvora algi. Prema literaturnim podacima, poznato je da su polifenoli ekstrahovani iz biljaka jaki inhibitori elastaze i hijaluronidaze [66]. Nedavna studija je objavila da florotanini, vrsta tanina u smeđim algama, ekstrakti morske alge Eisenia bicycles i smeđe alge Ecklonia cava, pomažu koži značajno smanjujući aktivnost elastaze [67]. Ekstrakti A.esculenta proizvedeni u ovoj studiji pokazali su najveće TPC i TFC vrijednosti u odnosu na druge proučavane vrste (Tabela 4), pa bi to mogao biti razlog zašto vodeni ekstrakti iz P. palmaria i U. Lactuca nisu pokazali anti- aktivnosti elastaze. Da bi se potvrdila ova hipoteza, sprovedena je Pearsonova korelacioni analiza, sugerišući da antienzimske aktivnosti pozitivno koreliraju sa sadržajem fenolnih supstanci (videti dalju raspravu u Odeljku 2.6. Korelacije između hemijskih jedinjenja i bioaktivnih svojstava).

2.5.3. Aktivnost inhibicije tirozinaze

Ekstrakti A.esculenta su pokazali pozitivnu inhibiciju tirozinaze veću od 90 procenata za sve korišćene metode ekstrakcije, dok ekstrakti P.palmaria i U. Lactuca nisu pokazivali inhibitorne efekte tirozinaze (Tabela 4). Međutim, antitirozinazne aktivnosti ekstrakta A.esculenta nisu se razlikovale (str<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">

cistanche แอ ม เว ย์

Tirozinaza igra važnu ulogu u biosintezi pigmenta melanina u koži. Melanin je odgovoran za zaštitu od štetnog ultraljubičastog zračenja, koje može uzrokovati nekoliko patoloških stanja [71]. Osim toga, može stvoriti estetske probleme kada se melanin nakuplja kao hiperpigmentirane mrlje [72]. Stoga, uključivanje inhibitora tirozinaze u kozmetičke proizvode može biti privlačno zbog efekata izbjeljivanja i/ili posvjetljivanja.

2.5.4. Aktivnost inhibicije hijaluronidaze

Svi ekstrakti morskih algi su pokazali značajno visoku antihijaluronidaznu aktivnost (Tabela 4), pokazujući rezultate uporedive sa rastvorima taninske kiseline (poznati inhibitor hijaluronidaze). Konkretno, ekstrakti A.esculenta su pokazali 100 posto inhibicije za sve testirane metode. Štaviše, ekstrakti U. Lactuca pokazali su aktivnosti veće od 90 posto inhibicije, pri čemu je inhibicija ekstrakata proizvedenih od PEF (96,8 posto o) i kombinacije PEF plus HW (97,3 posto) bila veća od inhibicije koju proizvodi tradicionalni vrući vodena metoda 93,4 posto )(str<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">

Drugi autori su također opisali antihijaluronidaznu aktivnost različitih ekstrakata morskih algi, posebno ekstrakata bogatih florotaninima iz smeđih algi [73,74]. Međutim, koliko nam je poznato, ovo je prvi put da su zabilježene aktivnosti inhibitora hijaluronidaze ekstrakta P.palmata i U. Lactuca koje proizvodi PEF.

Hijaluronska kiselina je glavna komponenta dermisa, gdje je uključena u obnavljanje tkiva, razgrađuje se sa starenjem, izazivajući bore i gubitak čvrstoće kože. U tom smislu, inhibitori hijaluronidaze povećavaju nivo hijaluronske kiseline dermalnog ekstracelularnog matriksa za poboljšanje izgleda kože lica koja stari [13].cistanchStoga bi rezultati ove studije mogli otvoriti nove puteve za eksploataciju prirodnih inhibitora hijaluronidaze iz resursa algi s potencijalnom primjenom u kozmetičkim proizvodima.

Ukratko, prikupljeni podaci su nam omogućili da zaključimo da ekstrakti A.esculenta pokazuju sveukupno bolje inhibitorno djelovanje od P.palmaria i U.lactuca prema ispitivanim enzimima. Dakle, kao najperspektivnija vrsta morske alge sa odličnim antienzimskim djelovanjem i stoga je odabrana za daljnja istraživanja u našoj laboratoriji. Iako se čini da su sirovi ekstrakti iz A. esculenta dobri kandidati za in vitro eksperimente, potrebno je provesti daljnje studije kako bi se razjasnio identitet metabolita odgovornih za ove biološke efekte.

2.6. Korelacije između hemijskih spojeva i bioaktivnih svojstava

Rezultati analize glavnih komponenti (PCA) pokazali su da je glavno razdvajanje grupa bilo definisano PC1 i PC2, koji su činili 71,9 posto i 14,5 posto varijanse u podacima, respektivno (Slika 2). Ekstrakti A.esculenta su se odlikovali višim sadržajem flavonoida i fenolnih jedinjenja, inhibitornim efektima na enzime (kolagenaza, tirozinaza i elastaza), te vrijednostima DPPH i FRAP od ostalih vrsta, P. palmata i U.lactuca. S druge strane, A.esculenta je imala niži sadržaj ugljikohidrata, posebno u odnosu na P. palmitate (koji se nalazio na suprotnoj strani PC1). Varijacije u podacima duž PC2 uglavnom su se odnosile na ABTS i inhibiciju hijaluronidaze. Kao što pokazuje lokacija na parceli, P. palmitate je imao jaču korelaciju sa ABTS, dok je U.lactuca više bio povezan sa efektima inhibicije hijaluronidaze, u poređenju sa ove dve vrste.

Visoka i značajna pozitivna korelacija između TPC, TFC, DPPH, FRAP i inhibitornih efekata na kolagenazu, elastazu i tirozinazu pokazala je Pearsonova korelaciona analiza (Tabela 5).

koliko cistanche uzeti

Ovo je bilo u skladu s prethodnim studijama, koje su izvještavale da su fenolna jedinjenja (uključujući flavonoide) glavni doprinositelj antioksidativnoj aktivnosti različitih morskih algi [75-77]. Visoka antioksidativna aktivnost ekstrakata iz smeđih makroalgi povezana je sa specifičnom grupom polifenola, florotanina i njihovom jedinstvenom molekularnom strukturom. Izvještava se da florotanis iz smeđih algi ima do osam međusobno povezanih fenolnih prstenova koji djeluju kao zamke elektrona [78,79]. Očekivalo se da će ABT korelirati sa TPC i drugim antioksidativnim parametrima. Mogući razlozi mogu biti da se metode zasnivaju na različitim reakcionim uslovima i da se reaktivnost razlikuje i po vremenu i po opsegu komponenti. Na primjer, ABTSreagens reagira sa širim rasponom antioksidansa od DPPH radikala [80]. S druge strane, jedno od ograničenja spomenutih za ABTS je duga reakcija i općenito vrijeme reakcije možda neće omogućiti postizanje krajnje tačke.

Rezultati pokazuju da postoji visoka pozitivna korelacija između TPC i TFC sa inhibitornom aktivnošću kolagenaze, elastaze i tirozinaze ({{0}}.93-0.99), dok je odnos prema inhibiciji hijaluronidaze nije bila tako jaka (r=0.42 i 0.54, respektivno). To ukazuje da su druge komponente mogle doprinijeti inhibitornom učinku ekstrakata. Druge studije su objavile da polisaharidi imaju aktivnost inhibicije hijaluronidaze, na primjer, alginska kiselina u smeđim algama [81,82]. Potrebna su dalja istraživanja o hemijskom sastavu vrsta makroalgi za efekte izolovanih jedinjenja na enzim da bi se procenio doprinos svake hemijske komponente jer je u ovoj studiji fokus bio na sirovim ekstraktima. Nalazi su bili u skladu s prethodnim studijama, navodeći da hemijski sastav i nivoi bioaktivnosti ekstrakata značajno variraju između tri loze (crvene, zelene i smeđe alge) i između različitih vrsta koje pripadaju istom tipu i da su pod utjecajem starosti. i tip tkiva. Nadalje, sastav i karakteristike zavise od mnogih faktora okoliša koji utiču na distribuciju i rast makroalgi. Na primjer, svjetlost (UV-zračenje), temperatura, dostupnost nutrijenata, izloženost zraku, kretanje vode, izloženost valovima i salinitet. Temperatura je opisana kao faktor koji ima najjače efekte na formiranje pigmenta i koncentraciju nutrijenata, salinitet i UV zračenje kao faktore koji utiču na koncentraciju TPC [83].

Rasprostranjenost različitih vrsta makroalgi varira s dubinom vode. Položaji više uz obalu u međuplimnoj ili litoralnoj zoni su stresniji jer vrste koje tamo rastu, moraju izdržati višestruke promjene abiotskih faktora zbog promjena plime i oseke. Na primjer, efekat sušenja zraka, velika sunčeva zračenja (u vrijeme oseke), promjene u salinitetu i temperaturi i, u uvjetima niskih temperatura zraka, uključujući smrzavanje. Ispod oznake niske vode, povećanje dubine dovodi do vrlo brzog smanjenja intenziteta svjetlosti i manje izloženosti zračenju.

šta je cistanche

Alge koje rastu u području plime i oseke imaju manju osjetljivost na UV zračenje i brže se oporavljaju od sunčevog stresa. Dok su alge koje rastu u sublitoralnoj zoni osjetljivije na UV zračenje i imaju manji oporavak od sunčevog stresa [84]. U isto vrijeme, vodeni stupac pruža zaštitu. U ovoj studiji, izloženost sunčevoj svetlosti je verovatno bila jača za P. palmitate u poređenju sa drugim vrstama. Druge studije su pokazale da je stvaranje MAA direktno povezano sa sunčevom svjetlošću [85], štiteći organizme od UV-A i UV-B zračenja. Štaviše, pokazalo se da se specifična količina MAA smanjuje sa povećanjem dubine sakupljanja. Poznato je da alge kao što je A.esculenta rastu u gornjoj sublitoralnoj zoni, ali se takođe protežu u najniže međuplime, neposredno iznad oznake niske vode. Što znači da je vodeni stub pružao jaču zaštitu nego za P. palmitate. Osim toga, morfološke karakteristike su različite, oštrice A.esculenta su deblje u odnosu na druge dvije vrste. UI. lactuca, koja raste uglavnom u interplitoru i sublitoralu, sposobna je fotosintetizirati i rasti pod vrlo niskim ozračivanjem. Izloženost UVB svjetlosti je navedeno da ubrzava oporavak fotosintetskih parametara U.lactuca od negativnih efekata UVA svjetlosti. Manji je, jednostavnije strukture i kraćeg vijeka (3 mjeseca) od A.esculenta (5-7 godina) i P. palmata koji svake godine ima novi rast.

Ukratko, mogu se izvući pretpostavke da su glavne razlike u svojstvima ekstrakata varijacije u životnom veku, morfološkim karakteristikama i uslovima rasta vrsta algi.

3. Materijali i metode

3.1. Materijali

Islandske alge U.lactuca (zelene alge), A.esculenta (smeđe alge) i P. palmitate (crvene alge) osigurale su islandske plave dagnje i morske alge, koje su sakupljale morske trave u Breidafjorduru (Zapadni Island). Nakon berbe. morske alge su osušene (do otprilike 90 posto suvog materijala), mljevene i isporučene u vakuumu. Uzorci su čuvani na suvom i tamnom mestu na sobnoj temperaturi do upotrebe.

Tirozinaza iz gljive, L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA), elastaza iz svinjskog pankreasa, askorbinska kiselina, N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAPVN), hijaluronidaza iz goveđi testisi, kvercetin, a-tokoferol, taninska kiselina,2,2-difenil-1-pikrilhidrazil(DPPH),2.4,6-Tripiridil-s-triazin (TPTZ), Trolox, Folin- Ciocalteu reagens, galna kiselina i komplet za kolorimetrijsku analizu aktivnosti kolagenaze (MAK293) kupljeni su od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, SAD). Natrijumova so hijaluronske kiseline kupljena je od kompanije MakingCosmetics (Redmond, WA, SAD). Sve ostale korišćene hemikalije i reagensi su analitičke čistoće i dobijeni su od VWR International, LLC. Za ekstrakciju i pripremu rastvora na bazi vode korišćena je dejonizovana voda (Elix Essential, Merck, Darmstadt, Nemačka).

3.2. Eksperimentalni dizajn

Faktorski dizajn je korišten za procjenu efekata islandskih vrsta morskih algi (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) i tretmana ekstrakcije (ekstrakcija vrućom vodom (HW, 95 stepeni), ekstrakcija uz pomoć PEF-a (PEF) i kombinacija obje tehnike (PEF plus HW), o sastavu ekstrakta i bioaktivnosti (Tabela 6.) Ekstrakcija je izvedena u tri primjerka za svaku grupu i svaka replika ekstrakta je analizirana u tri primjerka.

bioflavonoid

3.3. Ekstrakcija bioaktivnih tvari iz islandskih morskih algi

Eksploatacija biomase makroalgi na različitim nivoima motivisala je naučnike da istraže ekološki prihvatljivije, efikasnije i isplativije tehnike ekstrakcije, zasnovane na pristupima zelene ekstrakcije. U ovom radu je ekstrakcija uz pomoć PEF-a ocijenjena kao nova i zelena metoda za proizvodnju funkcionalnih ekstrakata, dok je za poređenje korištena tradicionalna ekstrakcija toplom vodom. Nadalje, proučavan je učinak kombinacije obje tehnike, PEF tretmana makroalgi, praćenog tradicionalnom ekstrakcijom toplom vodom, na bioaktivni oporavak. Zbog očekivane elektroporacije proizvedene u ćelijskim membranama nakon fizičkog tretmana, sljedeća ekstrakcija vrućom vodom mogla bi dodatno olakšati oslobađanje unutarćelijskog materijala [86], povećavajući polje ekstrakcije. Potrebno je vrijeme nakon tretmana da se materijali difundiraju iz ćelija [87,88], au ovom eksperimentu suspenzije su čekale preko noći dok se tečnost (ekstrakt) ne odvoji od pulpe.

Što se tiče medijuma za ekstrakciju, destilovana voda je korišćena za proizvodnju ekstrakata morskih algi kako bi se prevazišla ograničenja u pogledu upotrebe toksičnih i organskih rastvarača. Voda se pokazala kao dobar rastvarač za ekstrakciju nekoliko bioaktivnih jedinjenja iz morskih algi [46,89-91] i ekološki je prihvatljiva. Osim toga, voda se obično koristi za ekstrakciju uz pomoć PEF-a jer je dobar provodnik za električnu energiju.

3.3.1. Procedure ekstrakcije

Za svaku repliku u svakoj grupi, morske alge (15 g) su namočene preko noći na sobnoj temperaturi (22 stepena) u dejonizovanoj vodi (300 mL). Zatim je suspenzija tretirana PEF (PEF), zagrijana (HW), ili oboje PEF tretirana i zagrijana (PEF plus HW). Suspenzije su držane preko noći u frižideru, nakon čega je usledila filtracija sa grubim (20 um) filter papirom. Zatim su filtrati (ekstrakti) čuvani na 4 stepena do njihove analize.

Ekstrakcija uz pomoć impulsnog električnog polja izvedena je korištenjem generatora impulsa ugrađenog u kući. Imao je FuGHCK-200-2000 kondenzator (Fu.G.Elektronik GmbH, Rosenheim, Njemačka) i iskrište (18,5 kV OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, Njemačka). PEF oprema je generirala eksponencijalne impulse raspada širine 0.96 us i amplitude od 18 kV. Komora za obradu od pleksiglasa dimenzija (D×V׊) 20×8×2,5 cm, sa najkraćim rastojanjem između pločastih elektroda korišćena je za tretiranje suspenzija sa električnim poljem od 8 kV/cm na 1,2 Hz u trajanju od 10 min. . Ekstrakti HW su pripremljeni zagrevanjem suspenzije u čaši u termostatskom vodenom kupatilu i držani na 95 stepeni 45 min. Za kombinovani tretman impulsnim električnim poljem i zagrevanjem, suspenzije su tretirane PEF-om, a zatim stavljene u čašu, zagrejane u vodenom kupatilu i držane na 95 stepeni 45 minuta.

3.3.2. Mjerenja vodljivosti, pH i temperature

Električna provodljivost i pH suspenzije morskih algi mjereni su nakon namakanja i nakon tretmana ekstrakcije, na sobnoj temperaturi, pomoću pH metra (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) opremljenog senzorom provodljivosti i pH/ARC trioda kombinovana elektroda. Nadalje, zabilježene su promjene temperature uslijed tretmana.

3.4. Spektralni profili ekstrakata morskih algi

UV-VIS spektri apsorpcije različitih ekstrakata morskih algi mjereni su u rasponu od 200 do 450 nm pomoću dvostrukog snopa Thermo Scientific Evolution 350 UV-Vis spektrofotometra (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) sa 1 cm kvarca. Urađena su tri skeniranja za svaki ekstrakt morske alge.

3.5. Određivanje ukupnog sadržaja polifenola

Ukupni sadržaj fenola (TPC) u ekstraktima morskih algi određen je korištenjem Folin-Ciocalteu reagensa slijedeći malo modificiranu metodu koju je opisao Zhang [92] koristeći Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). 20 μL ekstrakta morske alge ili serijskog standardnog rastvora pomešano je sa 100 μL Folin-Ciocalteu reagensa (10 procenata u destilovanoj vodi) Nakon 5 minuta dodano je 80 μL 7,5 procenata (/w) rastvora natrijum karbonata. inkubirano na sobnoj temperaturi i tami 30 min. Apsorpcija je mjerena na talasnoj dužini od 760 nm. Destilovana voda je korištena kao slijepa proba. Standardna krivulja galne kiseline je korištena za određivanje ukupnog sadržaja fenola i izražena kao ug ekvivalenata galne kiseline（ GAE) po gramu suvog materijala (ug GAE/g do).

3.6. Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida

Ukupni sadržaj flavonoida (TFC) u ekstraktima morskih algi određen je metodom koju je opisao Kamtekar 【93】 i prilagođen 96-mikropločama. Ukratko, zapremina od 25 μL ekstrakta morske alge ili serijskog standardnog rastvora je pomešana sa 100 μL natrijum nitrita (0,375 procenata w/o). Nakon 5 minuta, 25 μL aluminijum hlorida (3 procenta w/o) je dodano u smjesu i inkubirano 6 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je u smjesu dodano 100 μL natrijum hidroksida (2 posto w/ø) i pomiješano. Odmah je izmjerena apsorpcija na talasnoj dužini od 510 nm. Destilovana voda i etanol korišteni su kao slijepi uzorci. Standardna kriva kvercetina (otopljenog u etanolu) korištena je za određivanje ukupnog sadržaja fenola i izražena kao ug kvercetinskih ekvivalenata (QE) po gramu suhog materijala (ug QE/g do). 3.7. Određivanje sadržaja ugljikohidrata

Sadržaj slobodnog šećera mjeren je metodom opisanom u [94], uz male modifikacije. 50 μL otopine fenola (4 posto) i 250 μL sumporne kiseline (96 posto) dodano je u 100 μL uzorka ili standardne otopine. Nakon 10 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, očitana je apsorbancija smjese na 490 nm. Standardna kriva glukoze korištena je za određivanje ukupnog sadržaja ugljikohidrata i izražena kao mg glukoznih ekvivalenata (GluE) po gramu suvog materijala (mg GluE/g do).

3.8. Antioksidativna svojstva ekstrakta morskih algi

3.8.1.2,2 Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) Test čišćenja slobodnih radikala

Antioksidativna aktivnost (DPPH) ekstrakata morskih algi određena je prema prethodno opisanoj metodologiji 【94】 uz neke modifikacije. Ukratko, 200 μL 10,825 × 10-5 M DPPH otopine je dodano na 100 uL uzorka (1:1 u metanolu) u pločicu 96- bunara. Ista zapremina DPPH pomešana je sa 50 μL standarda plus 50 μL metanola. Zatim su uzorci i standard inkubirani na tamnom mjestu na sobnoj temperaturi 30 min. Apsorbancija je mjerena na talasnoj dužini od 517 nm. Destilovana voda je korištena kao slijepa proba. Sposobnost uklanjanja DPPH radikala izračunata je pomoću sljedeće jednadžbe: gdje je kontrola apsorbancija kontrole (DPH rastvor bez uzorka), A uzorak je apsorbancija testnog uzorka (DPPH rastvor plus test uzorak), a A Slijepi uzorak je apsorbancija samo uzorka (uzorak bez otopine DPPH), a slijepa proba Ametanola je apsorpcija samo metanola. Kao pozitivne kontrole korišteni su komercijalni antioksidansi (askorbinska kiselina, galna kiselina i -tokoferol).

3.8.2. Test smanjenja antioksidativne moći (FRAP) željeznih jona

FRAP aktivnost je mjerena prema metodi Benzie and Strain [95]. Ukratko, acetatni pufer (300mM,pH3.6),2.4,6-tripiridil-s-triazin(TPTZ)10mM u 40mMHCl, i FeCl; 6H-O (20 mM) su pomešani u omjeru 10:1 da bi se dobio radni FRAP reagens. Reakciona smeša je inkubirana na 37 stepeni 10 minuta. Uzorak od 50 μL iz svakog ekstrakta je pomešan sa 150 μL radnog FRAP rastvora 8 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorbancija obojenog proizvoda, Ferrous-TPTZ je izmjerena na talasnoj dužini od 593 nm. FRAP vrijednosti ekstrakata morskih algi izražene su kao uM Trolox ekvivalenata (TE) po gramu suhog materijala.

3.8.3.2,2 Azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina)(ABTS) test

Analiza je izvedena korištenjem ABTS protokola za dekolorizaciju [76] uz određene modifikacije. Kation radikala ABTS (ABTS plus ) je proizveden reakcijom ABTS (66mg) sa 10 mL rastvora kalijum persulfata (2,45 mM). Smjesa je ostavljena u mraku na sobnoj temperaturi 12-16 h prije upotrebe. ABTS plus rastvor je razblažen vodom do apsorbancije od 0,700 na 734 nm. Reakciona smjesa (200 ul) je prebačena na mikroploču, dodano je 50 μL uzorka, a zatim 150 μL rastvora reagensa. Ploča je mućkana 10 s srednjom brzinom, a apsorbancija je izmjerena na 734 nm nakon 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi. Standardna kriva je pripremljena grafikom inhibicije A734nm Trolox standarda kao funkcije njihovih koncentracija. Vrijednost Trolox ekvivalentnog antioksidativnog kapaciteta (TEAC) uzoraka izračunata je korištenjem jednadžbe dobivene iz linearne regresije standardne krive zamijenjene vrijednosti A734nm za svaki uzorak:

3.9. Anti-enzimska aktivnost ekstrakata morskih algi

3.9.1. Test inhibicije kolagenaze

Kolorimetrijski set za analizu aktivnosti kolagenaze (MAK293), kupljen od Sigma-Aldrich, korišten je za određivanje inhibicije kolagenaze ekstrakta morskih algi. Komplet je mjerio aktivnost kolagenaze koristeći sintetički peptid (FALGPA) koji oponaša strukturu kolagena. Procedura je izvedena prema uputama u kompletu.

3.9.2. Test inhibicije elastaze

Inhibicija elastaze ekstrakata morskih algi ispitana je u TRIS pufer otopini modificiranom metodom kao što je ranije opisano 【96】. Ukratko, 100 μL 0,1 M rastvora TRISbufera (pH8,0), 25 μL elastaze (1 U/mL u TRIS puferu) i 25 μL ekstrakta uzoraka su pomešani i inkubirani 15 minuta na 30 C prije dodavanja supstrata za početak reakcije. Nakon vremena inkubacije, dodano je 50 μL 2 mM rastvora AAAPVN. Zatim je apsorbancija na 420 nm praćena tokom 20 minuta korišćenjem čitača mikroploče na konstantnoj temperaturi od 30 C. Konačno, inhibicija elastaze je izračunata u procentima korišćenjem jednačine: gde je kontrola Abs apsorbancija testa korišćenjem pufera umesto inhibitor(uzorak) i Absmple je apsorpcija ekstrakata uzorka. Kvercetin je korišten kao pozitivna kontrola. Tris pufer je korišten kao prazan.

3.9.3. Test inhibicije tirozinaze

Test inhibicije tirozinaze izveden je prema metodi koju je prethodno opisao 【66】 koristeći L-DOPA kao supstrat. 20 μL uzorka, 10 μL rastvora tirozinaze pečuraka (50 U/mL u fosfatnom puferu) i 80 μL fosfatnog pufera (pH=6.8) pomiješano je u mikroploči i prethodno inkubirano na 37C na 5 min. Zatim je dodano 90 uL L-DOPA (2 mg/mL). Stvaranje dopahroma je odmah praćeno tokom 20 minuta na 475 nm u čitaču mikroploča pod konstantnom temperaturom od 37 stepeni. Procenat inhibicije enzima tirozinaze izračunat je pomoću jednačine: gdje je Abs kontrola apsorbanca testa koji koristi pufer umjesto inhibitora(uzorka), a uzorak je apsorbanca ekstrakta uzorka. Kvercetin je korišten kao pozitivna kontrola. Fosfatni pufer je korišten kao slijepa proba.

3.9.4. Test inhibicije hijaluronidaze

Inhibicijska aktivnost hijaluronidaze mjerena je kao što je prethodno opisano u [66] uz nekoliko modifikacija. Volumen od 100 ulofa tipa-1-hijaluronidaze goveđih testisa (2100 U/mL) rastvoren u 0.1 M acetatni pufer (pH 3,5) je pomešan sa 100 μL ekstrakta i inkubiran na 37 stepeni 20 minuta. Zapremina od 200 μL 6 mM kalcijum hlorida je dodata u reakcionu smešu, a zatim je smeša inkubirana na 37 stepeni C tokom 20 minuta. Ova Ca2 plus aktivirana hijaluronidaza je tretirana sa 250 uL natrijum hijaluronata (1,2 mg/mL) rastvorenog u 0,1 M acetatnom puferu (pH 3,5) i zatim inkubirana u vodenom kupatilu na 37 stepeni tokom 40 minuta. 50 μL 0,9 M natrijum hidroksida i 100 μL 0,2 M natrijum borata dodano je u reakcionu smešu i zatim inkubirano u ključaloj vodenoj kupelji 5 minuta. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, 250 uL otopine p-dimetilaminobenzaldehida (DAMB) dodano je u reakcionu smjesu. Rastvor DAMB pripremljen je otapanjem 0,25 g DAMB u 21,88 mL 100% sirćetne kiseline i 3,12 ml 10N hlorovodonične kiseline. Kontrolna grupa je tretirana sa 100 μL 5 posto vode umjesto ekstrakta. Apsorbancija je izmjerena na talasnoj dužini od 585 nm nakon 45 min. Procenat inhibicije enzima je izračunat korišćenjem sledeće jednačine: gde je Abs kontrola apsorbanca testa koji koristi pufer umesto inhibitora (uzorak), a Abs uzorak je apsorpcija ekstrakta uzorka. Taninska kiselina se koristi kao referentni standard.

3.10.Statistička analiza

Prosjek trostruke analize svakog ekstrakta je izračunat i korišten za pronalaženje srednjih vrijednosti i standardnih devijacija za svaku grupu (n=3). Opći linearni modeli (GLM) za fiksne faktore primijenjeni su za procjenu glavnih efekata i dvosmjernih interakcija eksperimentalnih faktora (vrste i metode ekstrakcije) na mjerene varijable. Nadalje, ANOVA i Tukey-Kramerov test korišteni su za identifikaciju značajnih (str<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">

4. Zaključak

Rezultati ovog prvog skrining eksperimenta pokazali su potencijal tri islandske vrste morskih algi pružajući učinkovite korisne efekte na nekoliko puteva. Zeleni pristup razvijen korištenjem vodenih impulsnih električnih polja pokazao je slične rezultate kao i tradicionalna ekstrakcija tople vode, pokazujući nekoliko prednosti kao što su njegova netermalna priroda i kraće vrijeme ekstrakcije (10 min naspram 45 min). Među tri vrste algi, smeđa makroalga A.esculenta pokazala je najveći sadržaj TPC i TFC i pokazala najveći antioksidativni kapacitet Štaviše, vodeni ekstrakti A.esculenta su pokazali bolje inhibitorne aktivnosti od P. palmaria i U. Lactuca prema kolagenazi, elastazi, tirozinaza i hijaluronidaza su najperspektivnije vrste morskih algi s odličnim anti-enzimskim djelovanjem za njihovu upotrebu u izbjeljivanju kože, protiv starenja i zdravlju kože. Zanimljivo je da su ekstrakti A.esculenta proizvedeni PEF metodom pokazali inhibiciju kolagenaze od 91 posto, veću od aktivnosti inhibicije koju pokazuje tradicionalna ekstrakcija toplom vodom, pa čak i veću od inhibitora koji se nalazi u komercijalnom kompletu. Zaključno, naša preliminarna studija sugerira da su ekstrakti islandskih algi, posebno ekstrakti smeđih makroalgi A. esculenta, proizvedeni ekstrakcijom potpomognutom vodenim pulsnim električnim poljima, potencijalni funkcionalni sastojci koji se mogu koristiti kao aktivni spojevi za kozmetičke i kozmetičke formulacije u bliskoj budućnosti.

Ovaj članak je preuzet iz Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs