Neuroprotektivni efekat ekstrakta Bu-Shen-Huo-Xue protiv apoptoze izazvane visokom glukozom u PC12 ćelijama

Za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1 Istraživački studio integracije tradicionalne i zapadne medicine, Prva bolnica, Univerzitet u Pekingu, Peking, Kina.

2Državna ključna laboratorija prirodnih i biomimetičkih lijekova, Fakultet farmaceutskih nauka, Univerzitet u Pekingu, Peking, Kina.

Highlights

Neurotoksičnost izazvana visokom glukozom (HG) je uključena u patologijudijabetičarencefalopatija (DE). U našoj studiji, ekstrakt Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polibiljna formula, pokazujeneuroprotektivniaktivnost na HG-indukovanim PC12 ćelijama i mogući mehanizmi mogu biti povezani sa supresijom stvaranja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), kao i mitohondrijski posredovane kaspaze i JNK/p38 MAPK signalnih puteva. Ova studija pruža obećavajuće sredstvo za liječenje DE u kliničkim primjenama.

Kliknite da biste koristili ekstrakt cistanche i Cistanche za bubrege

Cistancheje dobro poznata tonik biljka koja može hraniti i štititibubrezi. U teoriji tradicionalne kineske medicine,Cistancheje najbolja biljka zabubrezi.Cistancheje bogat ehinakozidom, akteozidom i flavonoidima. Ovi efikasni sastojci uCistanchemože smanjitibubregćelijska apoptoza i povećanjebubregćelijska proliferacija. stoga,Cistanchejeprirodni dodatak za bubrege.

Abstract

Cilj: Istražiti neuroprotektivni učinak ekstrakta Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polibiljne formule, protiv neurotoksičnosti izazvane visokom glukozom (HG) u PC12 stanicama. Metode: Urađeni su test vitalnosti ćelije, analiza laktat dehidrogenaze (LDH), detekcija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), Hoechst 33258, dvostruko bojenje akridin narandže (AO)/etidijev bromid (EB) i test potencijala mitohondrijske membrane (MMP). Osim toga, Western blot-om su otkrivene Bax, Bcl-2, kaspaza-3, cijepana kaspaza-3, PARP, cijepani PARP, citokrom c i protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK). Rezultati: Ekstrakt BSHX povećao je vitalnost ćelija i smanjio curenje LDH na način ovisan o koncentraciji u PC12 ćelijama izazvanim HG. Štaviše, BSHX ekstrakt je smanjio nivo intracelularnog ROS, povećao potencijal mitohondrijalne membrane, regulisao ekspresiju Bax i Bcl-2 i inhibirao oslobađanje citokroma c iz mitohondrija. Nadalje, BSHX ekstrakt je oslabio aktivaciju kaspaze-3 i PARP i inhibirao fosforilacije c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) i p38 MAPK. Zaključak: BSHX ekstrakt je pokazao značajan neuroprotektivni efekat na apoptozu izazvanu HG u PC12 ćelijama. Ovaj efekat može biti povezan sa supresijom generisanja ROS-a, kao i mitohondrijskim posredovanjem kaspaze i JNK/p38 MAPK signalnih puteva.

Ključne riječi:dijabetička encefalopatija, tradicionalna kineska medicina, ekstrakt Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotektivni, visoka glukoza

Skraćenica: AO: akridin narandža; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Dijabetička encefalopatija; DM: dijabetes melitus; DMSO: dimetil sulfoksid; EB: Etidijev bromid; ERK: Ekstracelularno regulisane proteinske kinaze; HG: Visoka glukoza; JNK: c-Jun N-terminalna kinaza; LDH: laktat dehidrogenaza; MAPK: Protein kinaze aktivirane mitogenom; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong Prescription; MTT: 3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolijum bromid; PBS: fiziološki rastvor fosfatnog pufera; PBST: fiziološka otopina puferirana fosfatom, 0.1 posto Tween 20; ROS: Reaktivne vrste kiseonika; T2DM: dijabetes melitus tipa 2; TCM: Tradicionalna kineska medicina

Pozadina

Poslednjih godina, dijabetička encefalopatija (DE), komplikacija dijabetes melitusa (DM) koja se javlja u centralnom nervnom sistemu (CNS), dobila je široku pažnju. DE može biti povezan s nekoliko faktora rizika kao što su starost, trajanje i kontrola glikemije dijabetesa [1, 2]. Kliničke manifestacije DE su morfološke i fiziološke promjene u mozgu i rezultirajuća kognitivna disfunkcija. Hiperglikemija, oksidativni stres i kronična upala mogu biti važni patogeni uzroci DE [3]. Iako je sve veći broj eksperimenata pokazao da dugotrajna hiperglikemija može ubrzati starenje mozga, precizna patogeneza DE nije istražena.

Apoptoza je programirana ćelijska smrt koju kontroliraju geni kako bi se održala stabilnost mikrookruženja. Proteini uključeni u apoptozu uključuju porodicu Bcl-2, kaspaze, p53, itd. Porodica Bcl-2 je podijeljena u dvije kategorije, jedna koja promoviše ćelijsku smrt, kao što je Bax, a druga se opire apoptozi, kao što je Bcl-2. Oni mogu regulisati apoptozu putem kaspaznog signalnog puta, koji je kaskadna reakcija amplifikacije ireverzibilnog konačnog hidroliznog supstrata kaspaze [4-6]. Osim toga, studije su pokazale da je apoptoza izazvana visokom glukozom (HG) povezana s mitohondrijalnom disfunkcijom, oštećenjem DNK i prekomjernom proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika (ROS) [7]. Studija na miševima sa dijabetesom pokazala je da protein kinaza (AMPK) aktivirana adenozin 5'-monofosfatom (AMP), intracelularni energetski i stresni receptor, može inhibirati apoptozu posredovanu ROS. Štaviše, sve veći broj dokaza pokazuje da bi inhibicija mitogenom aktiviranih protein kinaza (MAPK) mogla biti korisna za inhibiciju neuronske apoptoze. Drugi izvještaj je pokazao da c-Jun N-terminalna kinaza (JNK), ekstracelularno regulirane proteinske kinaze (ERK), p38 MAPK signalni putevi mogu potencijalno regulisati neuronsku apoptozu [8,9].

Na osnovu teorije tradicionalne kineske medicine,bubregnedostatak esencije i zastoj krvi smatraju se osnovnom patogenezom DE. Dakle, strategija ishranebubrezia aktivirajuća krv se obično koristi u kliničkim primjenama za DE. Prethodne studije su mogle potvrditi da je modificirani Wu-Zi-Yan-Zong recept (MWP), recept koji ima za cilj njegububrezi, može poboljšati kognitivna oštećenja i zaštititi neurone smanjenjem toksičnosti A [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) recept, u ​​koji se dodaje pijavica na osnovu MWP, posebno je formuliran zahranitibubrezii aktiviraju krv. Nedavne studije su pokazale da BSHX recept može poboljšati sindrom pogoršanja pamćenja pacijenata sa DM, što ukazuje na snažna neuroprotektivna svojstva [12]. Međutim, detaljan farmakološki mehanizam za BSHX ostaje nejasan. U ovoj studiji, cilj nam je da posmatramo zaštitni efekat ekstrakta BSHX na ćelije PC12 izazvane HG i istražimo potencijalne molekularne mehanizme.

Metode

Materijali i reagensi

Sve biljke su kupljene od Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Peking, Kina) i potvrđene od strane dr. PF Tu, farmakognosista, prema Kineskoj farmakopeji (The Pharmacopeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolijum bromid (MTT) je iz Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, SAD). Komplet za analizu laktat dehidrogenaze (LDH) kupljen je od Nanjing Jiancheng Bioinženjering instituta. (Nanjing, Jiangsu, Kina). Akridin narandžasta (AO)/Etidijum bromid (EB) komplet za dvostruko bojenje i Hoechst 33258 nabavljeni su od Solar Co., Ltd. (Peking, Kina). Komplet za analizu potencijala mitohondrijalne membrane sa JC-1, 2, 7-dihlorofluorescein diacetatom (DCFH-DA) kupljen je od Beyotime Instituta za biotehnologiju (Šangaj, Kina). Primarna antitijela za kaspazu-3, rascijepljenu kaspazu-3, PARP, rascijepljenu PARP, citokrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK i -tubulin su dobijeni od Cell signaling Technology (Boston, MA, SAD).

Priprema BSHX ekstrakta

BSHX se sastoji od sedam medicinskih komponenti (Tabela 1). Za pripremu ekstrakta BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) i Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) pomiješani su u omjeru 8:8:4:1:2:1:8 i uronjeni u ukupnu zapreminu od 10 puta (v/w) destilovane vode na 30 min. , zatim kuvati 1 h i ponovo kuvati 1 h u ukupnoj zapremini 5 puta (v/w) destilovane vode. Supernatanti su spojeni i osušeni liofilizacijom. Konačni osušeni ekstrakt iznosio je 25 posto (w/w) težine sirovog bilja, a uzorak vaučera je deponovan u Moderni istraživački centar za tradicionalnu kinesku medicinu, Pekinški univerzitetski zdravstveni naučni centar, Peking, Kina.

Ćelijska kultura

Ćelijske linije feohromocitoma štakora (PC12 ćelije) su dobijene iz Peking Union Medical College Bank Cell Bank (Peking, Kina) i uzgajane u Dulbecco-ovom modifikovanom medijumu orla (DMEM) (Macgene, Peking, Kina) sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (Biowest, Francuska ) i 1 posto penicilin-streptomicina (100×, Macgene, Peking, Kina) u vlažnom inkubatoru koji sadrži 95 posto zraka i 5 posto CO2 na 37 stepeni.

Tretman uzorkom

U preliminarnom testu, PC12 ćelije su tretirane samo BSHX ekstraktom (20, 50, 100 mg/L) tokom 48 sati da bi se procenila citotoksičnost. Za analizu neuroprotektivnog efekta ekstrakta BSHX protiv neurotoksičnosti izazvane visokom glukozom (HG), PC12 ćelije su tretirane zajedno sa BSHX ekstraktom (20, 50, 100 mg/L) i HG (75 mM) tokom 48 sati, nakon čega je uslijedio MTT test za vitalnost ćelija. Svi ostali testovi su rađeni pod istim uslovima sa opsegom koncentracije BSHX ekstrakta od 20 do 100 mg/L.

Test vitalnosti ćelija

PC12 ćelije su posađene u 96-ploče sa gustinom od 3,5 × 103 ćelije po jažici. Nakon inkubacije sa BSHX ekstraktom (sa ili bez HG) tokom 48 h, supernatant je uklonjen i dodan je MTT rastvor (0,5 mg/mL). Nakon inkubacije na 37 stepeni tokom 4 h, rastvor MTT je uklonjen i ćelije su rastvorene u dimetil sulfoksidu (DMSO) uz mućkanje 5 minuta. Optička gustina (OD) je izmjerena na 570 nm pomoću čitača mikroploče. Vijabilnost ćelije ( posto )=[OD (tretman) – OD (prazno)]/ [OD (netretirana kontrola) – OD (prazno)] × 100 posto.

LDH test

PC12 ćelije su kultivisane i stimulisane na tretman HG i BSHX ekstraktom kao što je prethodno opisano. Zatim je LDH oslobođen iz ćelija detektovan korišćenjem komercijalnog LDH kompleta prema uputstvima proizvođača. Apsorpcija je izmjerena na 450 nm. LDH (U/L)=[OD (tretman) – OD (prazno)] / [OD (standard) – OD (prazno)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Bojenje Hoechst 33258 i AO/EB bojenje

Za Hoechst 33258 bojenje, ćelije su fiksirane sa 4 posto paraformaldehida tokom 30 minuta. Zatim su ćelije isprane fiziološkim rastvorom fosfatnog pufera (PBS) 3 puta i inkubirane sa radnim rastvorom Hoechst 33258 (1 ug/mL) u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Slike su snimljene pomoću fluorescentnog mikroskopa (IX73, Olympus, Japan) pri talasnoj dužini ekscitacije 352 nm/emisionoj talasnoj dužini 461 nm. Za AO/EB bojenje, uklonite medij sa 96-jažica i dodajte AO/EB mješavinu (100 ug/mL AO i 100 ug/mL EB pomiješano) 5 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Zatim su ćelije isprane sa PBS 3 puta. Ćelije su vizualizovane pomoću fluorescentnog mikroskopa pod talasnom dužinom ekscitacije 490 nm/valnom dužinom emisije 530 nm za AO bojenje i talasnom dužinom ekscitacije 520 nm/valnom dužinom emisije 590 nm za EB bojenje.

Intracelularna detekcija ROS-a

Za intracelularnu detekciju ROS-a, PC12 ćelije su posađene u 6-ploče sa gustinom od 5×105 i podvrgnute tretmanu HG i BSHX ekstraktom tokom 24 h. Nakon 24 h inkubacije, PC12 ćelije su 3 puta isprane Dulbeccovim modificiranim medijumom orla bez seruma i dodane u 10 μΜ 2', 7'-dihlorofluorescein diacetat (DCF-DA), koji je oksidiran u fluorescentni 2', 7'-influorescein diacetat (DCF) hidroperoksidima, na 37 stepeni 30 minuta u mraku. Zatim su ćelije isprane hladnim PBS 3 puta i resuspendovane u PBS. Intracelularni nivo ROS detektovan je merenjem srednjeg intenziteta fluorescencije protočnom citometrijom (BD FACSCaliburTM, SAD). Talasne dužine ekscitacije/emisije bile su na 488 / 525 nm. Najmanje 10,000 događaja je izbrojano po uzorku. Vrijednosti su izražene kao srednja apsorbanca normalizirana na postotak kontrolne vrijednosti.

Test potencijala mitohondrijske membrane

Mitohondrijalna depolarizacija je procijenjena korištenjem komercijalnog JC-1 kompleta za analizu. Nakon tretiranja ekstraktom HG i BSHX, ćelije su inkubirane sa JC-1 radnim rastvorom (1 ×) na 37 stepeni 15 minuta u mraku. Zatim uklonite supernatant i operite ćelije 2 puta sa JC-1 puferskom otopinom (1 ×). Ćelije su vizualizovane pomoću fluorescentnog mikroskopa pod talasnom dužinom ekscitacije 460 nm/valnom dužinom emisije 530 nm za JC-1 monomer (detektovano u ćelijama sa depolarizovanim mitohondrijama), i talasnom dužinom ekscitacije 520 nm/emisionom talasnom dužinom 1{10{101 za JC-1 }} polimer (prisutan u polarizovanim mitohondrijama). Smatralo se da ćelije sa zelenom (monomernom) fluorescencijom imaju depolarizovane mitohondrije; smatralo se da ćelije sa crvenom (polimernom) fluorescencijom imaju normalne mitohondrije.

Western blot analiza

PC12 ćelije su sakupljene i lizirane u hladnom RIPA puferu sa 1x koktel inhibitorom proteaze. Supernatant je sakupljen centrifugiranjem velikom brzinom na 12,000 o/min u trajanju od 10 min na 4 stepena. Koncentracije proteina određene su Bradfordovim testom. Citosol i frakcije obogaćene mitohondrijama izolovane su sa kompletom za izolaciju mitohondrija (Pierce, Rockford, SAD) za analizu citokroma c. Za ostale proteine, ukupni ćelijski lizati su razdvojeni pomoću SDS-PAGE (10 posto -15 posto) i prebačeni na membrane od poliviniliden fluorida (PVDF). Membrane od poliviniliden fluorida su zatim blokirane sa 5 posto nemasnog mlijeka i inkubirane sa naznačenim primarnim antitelima na 4 stepena preko noći. Membrane su tri puta isprane sa PBST (fosfatnim puferom, 0,1 posto Tween 20) i inkubirane sa sekundarnim antitijelima na sobnoj temperaturi 2 h. Zatim su membrane isprane PBST još tri puta i vizualizirane korištenjem poboljšane hemiluminiscentne podloge, te skenirane Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, SAD).

Statistička analiza

Sve vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Značajnost razlika između srednjih vrijednosti određena je jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA) korištenjem Statističkog paketa za društvene nauke (SPSS 16.0 softver). P < 0.05="" u="" poređenju="" sa="" kontrolnom="" grupom="" smatra="" se="" statistički="">

Rezultati

BSHX ekstrakt štiti PC12 ćelije od oštećenja ćelija izazvanih HG

Da bismo istražili da li ekstrakt BSHX može zaštititi PC12 ćelije od HG insulta, tretirali smo PC12 ćelije rasponom koncentracija BSHX ekstrakta (20, 50 i 100 mg/L) tokom 48 sati pod HG (75 mM) uslovima. Procjena vitalnosti stanica korištenjem MTT testa pokazala je da je HG inzult uzrokovao značajno smanjenje vitalnosti PC12 ćelija (vijabilnost ćelija je bila približno 56,9 ± 6,7 posto) i da je tretman ekstraktom BSHX značajno spriječio smrt stanica na način ovisan o koncentraciji. Vijabilnost ćelija se povećala na 87,8 ± 9,2 procenata kada su ćelije istovremeno tretirane sa BSHX ekstraktom (100 mg/L) (Slika 1A). Laktat dehidrogenaza (LDH) se oslobađa iz oštećenih ćelija i stoga se može koristiti i kao indikator toksičnosti ćelije. U skladu s rezultatima MTT testa, otkrili smo da HG inzult značajno povećava oslobađanje LDH iz PC12 ćelija i da tretman ekstraktom BSHX sprječava oslobađanje LDH na način ovisan o koncentraciji (Slika 1B). Ovi rezultati sugeriraju da ekstrakt BSHX povećava vitalnost stanica u PC12 ćelijama izazvanim HG.

Ekstrakt BSHX inhibira apoptozu PC12 ćelija putem kaspaze-9/3-zavisnog puta

Da bismo odredili učinak ekstrakta BSHX na apoptozu stanica, koristili smo DNK boju Hoechst 33258 kao osjetljivi test za apoptozu. Jezgra normalnih ćelija obojena Hoechst-om 33258 pokazala su ujednačenu plavu fluorescenciju, dok su apoptotičke ćelije koje piknoza nuklearnog hromatinskog oblaka pokazale hiperhromatske i guste fluorescentne čestice. Procenat apoptoze je izračunat prema broju apoptotičkih ćelija u odnosu na ukupan broj ćelija. Naši podaci su otkrili da je HG (75 mM) inzult dramatično povećao udio apoptotičkih ćelija (51,7 ± 4,3 posto) i tretman ekstraktom BSHX značajno zaštićen od apoptoze izazvane HG u PC12 ćelijama (Slika 2A). Ovi rezultati su dodatno potkrijepljeni AO/EB analizom dvostrukog bojenja. AO ulazi u normalne i apoptotičke ćelije i emituje zelenu fluorescenciju, dok EB ulazi samo u apoptotičke ćelije i emituje crvenu fluorescenciju [13]. AO/EB test je pokazao da se procenat apoptotičkih ćelija značajno povećao nakon inzulta HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 procenata) i smanjen nakon tretmana ekstraktom BSHX u PC12 ćelijama (slika 2B), što sugeriše da bi ekstrakt BSHX mogao efikasno inhibiraju apoptozu PC12 ćelija izazvanu HG.

Zatim smo istražili efekat ekstrakta BSHX na put kaspaze-3/PARP, važan put za apoptozu povezanu sa mitohondrijama [14]. Western blot je otkrio da HG (75 mM) inzult značajno povećava ekspresiju aktivnih oblika kaspaze-3 i PARP i smanjuje ekspresiju ukupne kaspaze-3 i PARP u PC12 ćelijama, a ovaj efekat je značajno obrnut tretmanom BSHX ekstraktom (Slika 2C), što sugerira da ekstrakt BSHX efikasno štiti ćelije PC12 od apoptoze putem regulacije mitohondrijalno zavisne kaspaze-3/PARP puta.

Ekstrakt BSHX inhibira intracelularnu proizvodnju ROS-a u PC12 ćelijama izazvanim HG

Budući da HG može poboljšati formiranje intracelularnog ROS-a [15], testirali smo nivo intracelularnog ROS-a kako bismo utvrdili može li ekstrakt BSHX-a inhibirati stvaranje ROS-a. Uočeno je 323-struko povećanje srednjeg intenziteta fluorescencije u PC12 ćelijama koje su bile izložene 75 mM HG tokom 48 sati u poređenju sa kontrolom. Nasuprot tome, zajednički tretman sa BSHX ekstraktom značajno je smanjio srednji intenzitet fluorescencije na približno 0.76-, 0.{{10} i 0.{101} {12}} puta grupe modela, respektivno, što ukazuje da ekstrakt BSHX može inhibirati proizvodnju ROS izazvanu HG (Slike 3A, B).

BSHX ekstrakt održava mitohondrijalnu homeostazu u PC12 ćelijama izazvanim HG regulacijom ekspresije Bax i Bcl-2

Potencijal mitohondrijske membrane je važan parametar mitohondrijalne funkcije koji se koristi kao pokazatelj zdravlja ćelije. JC-1 je lipofilna, kationska boja koja može selektivno ući u mitohondrije i reverzibilno promijeniti boju iz zelene u crvenu kako se povećava membranski potencijal. U zdravim ćelijama sa visokim potencijalom mitohondrijske membrane, JC-1 spontano formira komplekse poznate kao J-agregati sa intenzivnom crvenom fluorescencijom. S druge strane, u apoptotičnim ćelijama sa niskim potencijalom mitohondrijalne membrane, JC-1 ostaje u monomernom obliku, koji pokazuje samo zelenu fluorescenciju [16, 17]. Odnos zelene fluorescencije i crvene fluorescencije stoga može odražavati depolarizaciju mitohondrija. U našoj studiji, broj ćelija sa depolarizovanim mitohondrijama (zelena fluorescencija) je značajno povećan nakon HG (75 mM) tokom 48 h, a ovo povećanje je poništeno tretmanom BSHX ekstraktom na način koji zavisi od koncentracije (Slika 4A).

Zatim smo otkrili mitohondrijsku i citoplazmatsku distribuciju citokroma c, ključnog igrača u putu apoptoze ovisno o aktivaciji kaspaze. Otkrili smo da je HG (75 mM) inzult u trajanju od 48 sati izazvao dramatičnu translokaciju citokroma c iz mitohondrija u citoplazmu, a ovo premještanje je značajno spriječeno tretmanom BSHX ekstraktom (slika 4B), što ukazuje da bi ekstrakt BSHX mogao inhibirati oslobađanje citokrom c iz mitohondrija.

Nadalje, proteini porodice Bcl-2 su važni regulatori različitih apoptotičkih puteva. Bcl-2 može inhibirati ćelijsku apoptozu uzrokovanu raznim citotoksičnim faktorima i inhibitor je oslobađanja citokroma c iz mitohondrija u citoplazmu. Međutim, Bax, kao član porodice Bcl-2, je faktor pro-apoptoze. Kada je indukovana apoptoza, Bax migrira iz citoplazme u mitohondrije i uništava integritet mitohondrija [5, 18]. U našoj studiji, nivo proteina Bcl-2 je bio smanjen, a Bax je bio povišen pod uticajem HG (75 mM) insulta tokom 48 h, ovaj efekat je zavisno od koncentracije poništen ekstraktom BSHX (Slika 4C). Svi ovi rezultati sugeriraju da ekstrakt BSHX štiti ćelije PC12 od HG-indukovane mitohondrijalne depolarizacije regulacijom ekspresije Bax i Bcl-2.

Utjecaj ekstrakta BSHX na apoptozu stanica putem JNK/p38 MAPK signalnih puteva

Neke studije su pokazale da je povećana proizvodnja ROS-a povezana s aktivacijom MAPK puteva, kako bi se pokrenula ćelijska apoptoza9 [19, 20]. Stoga smo istražili učinak ekstrakta BSHX na signalni put protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) kako bismo utvrdili da li ekstrakt BSHX može oslabiti apoptozu izazvanu HG. Kao što je prikazano na slici 5, inzult HG (75 mM) tokom 48 sati povećao je fosforilaciju c-Jun NH2-terminalne kinaze (JNK) i p38 u PC12 ćelijama, koje su bile značajno inhibirane ekstraktom BSHX u koncentraciji- zavisan način. Međutim, sličan rezultat nije primijećen kod ekstracelularno regulirane protein kinaze (ERK) MAPK. Rezultati sugeriraju da ekstrakt BSHX može inhibirati ćelijsku apoptozu izazvanu HG putem JNK/p38 MAPK signalnih puteva.

Diskusija

Dijabetička encefalopatija (DE) je česta komplikacija dijabetes melitusa tipa 2 (T2DM). Može uzrokovati kognitivno oštećenje mozga i važan je faktor rizika od smrtnosti i invaliditeta kod pacijenata sa dijabetesom mellitusom tipa 2 širom svijeta [3]. Stoga je kritično proučiti mehanizam DE, kao i strategije prevencije i liječenja.

U Kini se tradicionalni kineski lijekovi (TCM) već dugi niz godina koriste za liječenje DM i pokazali su ljekovito djelovanje. Neke kliničke studije sugeriraju da TCM bazirani na hranjenju bubrega i aktiviranju krvnih strategija mogu smanjiti razinu glukoze u krvi, potaknuti cirkulaciju i poboljšati kognitivnu disfunkciju mozga. BSHX recept je predstavnik ovih TCM-ova. Naša preliminarna klinička studija je pokazala da BSHX recept može efikasno poboljšati glukozu u krvi, homocistein (HCY) i visokoosjetljivi C-reaktivni protein (hs-CPR) u serumu, te poboljšati kognitivnu funkciju dijabetičara s blagim kognitivnim oštećenjem (MCI) [12]. Međutim, za sada nedostaju dokazi koji bi dokazali efikasnost i farmakološki mehanizam.

U ovoj studiji smo otkrili da ekstrakt BSHX može ublažiti smanjenje vitalnosti ćelija izazvano HG, što je izmjereno MTT, LDH testom. Da bismo dalje istražili zaštitni efekat ekstrakta BSHX na vitalnost ćelija, proučavali smo apoptozu pomoću Hoechst 33258 i AO/EB analize bojenja. Rezultati su pokazali da ekstrakt BSHX može značajno smanjiti apoptozu izazvanu HG. Kao marker apoptoze, kaspaza-3 i PARP su značajno povećani nakon tretmana s HG, ali je aktivacija ovih pro-apoptotičkih faktora inhibirana ekstraktom BSHX na način koji ovisi o koncentraciji. Gore navedeni rezultati su pokazali da ekstrakt BSHX ima zaštitni efekat na oštećenje PC12 ćelija izazvano HG.

ROS nastaje tokom procesa oksidativne fosforilacije ćelija, a njegovo povećanje proizvodnje ili oštećenje antioksidativnih sistema može dovesti do oksidativnog stresa u ćelijama [21]. Studije su pokazale da visoka glukoza može dovesti do akumulacije unutarćelijskih ROS i na kraju aktivnog apoptotičkog signalnog puta. A uobičajeni mehanizam dijabetičkih komplikacija je oksidativni stres [22, 23]. Naši rezultati su pokazali da visoka glukoza može dovesti do povećanja ROS-a u PC12 ćelijama, što je u skladu s prethodnim studijama [24]. Nagađa se da se toksičnost visoke glukoze za ćelije može postići apoptozom izazvanom ROS. Mitohondrije su glavna mjesta intracelularne proizvodnje ROS i glavni ciljni organ za ROS napad [25]. U patološkim stanjima, brzo povećanje ROS može dovesti do mitohondrijalne disfunkcije, kolapsa potencijala mitohondrijske membrane i na kraju dovesti do apoptoze ćelije [26]. Tako smo otkrili integritet mitohondrija. Naši rezultati su pokazali da visoka glukoza značajno smanjuje potencijal mitohondrijalne membrane, povećava omjer Bax/Bcl-2 koji kontrolira promjenu prelaznih pora mitohondrijske permeabilnosti (MPTP) i potiče curenje citokroma c, dok ekstrakt BSHX može preokrenuti ove promjene. Ovo sugerira da neuroprotektivni učinak BSHX ekstrakta protiv PC12 ćelija izazvanih HG može biti rezultat održavanja integriteta mitohondrija.

MAPK signalni put takođe igra važnu ulogu u apoptozi ćelije. JNK, ERK i p38 MAPK su najviše proučavani članovi porodice MAPK. Njihov glavni način djelovanja je fosforilacija njihovih specifičnih mjesta, čime se regulira apoptoza stanica [8, 27, 28]. Štaviše, studije su pokazale da prekomjerna proizvodnja ROS može pokrenuti fosforilaciju p38MAPK [29-31], a ROS može inducirati ili posredovati u aktivaciji MAPK puteva [32]. Nekoliko ćelijskih stimulansa koji induciraju proizvodnju ROS-a također paralelno mogu aktivirati MAPK puteve u više tipova ćelija [32, 33]. Potencijalni mehanizmi za aktivaciju MAPK pomoću ROS mogu uključivati ​​inaktivaciju i degradaciju MAPK fosfataza koje održavaju put u neaktivnom stanju [19]. S druge strane, da bi se dodatno potvrdilo da li su MAPK putevi aktivirani stvaranjem ROS-a, ćelije su prethodno tretirane antioksidansima (npr. NAC, čistač ROS-a) kako bi se spriječilo nakupljanje ROS-a. Rezultati su pokazali da je MAPK aktivacija bila gotovo inhibirana nakon stimulacije stanica ćelijskim stimulansima [32, 33], što ukazuje na uključenost ROS inaktivacije MAPK puteva. Osim toga, studije su pokazale da kada su ćelije tretirane specifičnim JNK inhibitorom SP600125, apoptoza indukovana kardiotoksinom III može biti blokirana [34]. Naša prethodna studija otkrila je da modificirani Wu-Zi-Yan-Zong recept (MWP) može inhibirati aktivaciju ERK/p38 MAPK u A-aktiviranoj BV2 mikrogiji [10]. Međutim, u ovoj studiji smo otkrili da ekstrakt BSHX može inhibirati fosforilaciju JNK i p38 MAPK i nismo postigli isti rezultat s p-ERK. Nagađamo da pijavice igraju drugačiju ulogu u ekstraktu BSHX. Rezultati sugeriraju da drugi zaštitni mehanizam BSHX ekstrakta protiv apoptoze u PC12 ćelijama izazvanim HG može biti kroz regulaciju JNK/p38 MAPK signalnih puteva.

Zaključak

Ekstrakt BSHX, polibiljna formula, pokazuje neuroprotektivne efekte na PC12 ćelije protiv HG insulta. Ekstrakt BSHX efikasno je inhibirao apoptozu PC12 ćelija izazvanu HG kroz smanjenje intracelularnog stvaranja ROS, održavanje integriteta mitohondrijalne membrane i blokiranje kaspaze-3 i JNK/p38 MAPK signalnih puteva (Slika 6). Kolektivno, naši nalazi sugeriraju da je ekstrakt BSHX obećavajuće sredstvo za liječenje DE u kliničkim primjenama.

Doprinosi autora

Osmislio i dizajnirao eksperimente: Zeng KW, Wang XM. Eksperiment je izvršio: Zhao SY. Analizirali podatke: Zhao SY, Zeng KW i Wang XM. Reagensi/materijali/alati za analizu: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW i Wang XM. Napisao otac: Zhao SY.

Reference

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Mozak i spoznaja dijabetičara. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Povreda mozga sa dijabetes melitusom: dokazi, mehanizmi i implikacije lečenja. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Teorija "metaboličkog pamćenja" i rani tretman hiperglikemije u prevenciji dijabetičkih komplikacija. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Potencijal mitohondrijske membrane (Δψm) u apoptozi; ažuriranje. Apoptoza 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Povezivanje mitohondrijalne dinamike i događaja života ili smrti putem proteina porodice Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitohondrije i ćelijska smrt. Mehanistički aspekti i metodološka pitanja. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1,25-(OH)2D3 inhibira apoptozu izazvanu visokom glukozom i proizvodnju ROS u ljudskim peritonealnim mezotelnim ćelijama putem MAPK/P38 puta. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Predtretman faktorom rasta nerava smanjuje aktivaciju c-Jun amino-terminalne kinaze 1 i kinaze p38 i p38 izazvane deprivacijom kiseonika i glukoze i stresom aktiviranih kinaza i daje neuroprotekciju u modelu feohromocitoma PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Učešće kaspaze-3 i p38 mitogen-aktivirane protein kinaze u apoptozi izazvanoj kobalt hloridom u PC12 ćelijama. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Antineuroinflamatorni efekti modificiranog Wu-Zi-Yan-Zong recepta u BV2 mikroglije stimuliranoj amiloidom putem NF-κB i ERK/p38 MAPK signalnih puteva. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Modificirani Wu-Zi-Yan-Zong recept, tradicionalna kineska polibiljna formula, suzbija neuroinflamatorne procese izazvane lipopolisaharidima u astrocitima pacova putem NF-κB i JNK/p38 MAPK signalnih puteva. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Učinak recepta Bushen Huoxue na liječenje blagog kognitivnog oštećenja dijabetesa tipa 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Analiza apoptoze izazvane cikloheksimidom u ljudskim leukocitima: Fluorescentna mikroskopija korištenjem aneksina V/propidijum jodida nasuprot akridin narandže/etidij bromida. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Kaspaze povezuju signalizaciju smrti ćelije sa homeostazom organizma. Imunitet 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Dušikov oksid: ključni faktor koji stoji iza disfunkcionalnosti endotelnih progenitor ćelija kod dijabetes melitusa tipa-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Alternativne talasne dužine ekscitacije olakšavaju citometriju potencijala mitohondrijalne membrane. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Sonde za potencijal mitohondrijalne membrane i protonski gradijent: praktični vodič za upotrebu. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green DR. Kako BCL-2 proteini indukuju permeabilizaciju vanjske membrane mitohondrija? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Proteinske kinaze aktivirane mitogenom i reaktivne vrste kiseonika: kako ROS može aktivirati MAPK puteve? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Aromatični heterociklični estri podofilotoksina ispoljavaju anti-MDR aktivnost u ćelijama humane leukemije K562/ADR putem ROS/MAPK signalnog puta. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Usmjeravanje glikogen sintaze kinaze-3 za terapeutsku korist protiv oksidativnog stresa kod Alchajmerove bolesti: uključivanje Nrf2-ARE puta. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babižajev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Uloga oksidativnog stresa u dijabetičkoj neuropatiji: stvaranje vrsta slobodnih radikala u reakciji glikacije i polimorfizmi gena koji kodiraju antioksidativne enzime na genetsku osjetljivost na dijabetičku neuropatiju u populaciji pacijenata sa dijabetesom tipa I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Stanična smrt, reaktivne vrste kiseonika (ROS) i komplikacije dijabetesa. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Ginkgolid B inhibira apoptozu u endotelnim ćelijama ljudske pupčane vene stimulisane visokom glukozom. Kineski farmakološki bilten 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Štetna uloga superoksid dismutaze u mitohondrijskom intermembranskom prostoru. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Proteinske kinaze aktivirane mitogenom: novi signalni putevi koji funkcionišu u ćelijskim odgovorima na stres iz okoline. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR-125b djeluje kao onkogen u ćelijama glioblastoma i inhibira ćelijsku apoptozu putem puteva nezavisnih od p53 i p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Napredni krajnji proizvodi glikacije indukuju apoptozu epitelnih ćelija ljudske rožnjače kroz stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika i aktivaciju JNK i p38 MAPK puteva. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Grelin inhibira apoptozu u neuronskim ćelijama hipotalamusa tokom deprivacije kiseonika i glukoze. Endokrinologija 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A mijenja regulatorne proteine ​​ćelijskog ciklusa i inducira apoptozu kroz aktivaciju p38MAPK zavisne od reaktivnih vrsta kiseonika u ćelijskoj liniji raka dojke kod ljudi MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. ROS-indukovana oksidativna povreda uključena u patogenezu gljivičnog keratitisa putem p38 MAPK aktivacije. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Aktivacija signalnih puteva MAP kinaze izazvana reaktivnim vrstama kiseonika. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox signalizacija i putevi MAP kinaze. Biofaktori 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoksin III inducira apoptozu zavisnu od c-jun N-terminalne kinaze u HL-60 ljudskim ćelijama leukemije. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.