MikroRNA u razvoju bubrega i bolesti Ⅲ

MiRNA u Wilmsovom tumoru

Wilmsov tumor,ilinefroblastom, je najčešće djetinjstvorak bubrega, sa incidencijom od 1 od 10,000 djece u Sjevernoj Americi (111). To je prvenstveno sporadična bolest, iako se porodični oblici javljaju u otprilike 1%-2% slučajeva (112, 113). Wilmsovi tumori nastaju iz aberantne nefrogeneze, gdje pluripotentni embrionalni bubrežni prekursori ne uspijevaju da se diferenciraju i perzistirajuabnormalno u postnatalni život(111, 114, 115). Ovi tumori histološki ličebubrezi u razvojusaporemećena morfologija(116) i mutacije gena uključenih u fetalnu nefrogenezu, uključujući WT1 (117-119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) i TP53 (123, 124), povezane su sa približno 40% Wilmsovi tumori (125). Nedavne studije koje su koristile sekvenciranje cijelog genoma i cijelog egzoma Wilmsovih tumora identificirale su nove mutacije u genima rizika od raka (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), genima koji kodiraju proteine ​​koji posreduju u modifikacijama histona tokom nefrogeneze (BCOR, MAP3K4) (126 ), i geni za obradu miRNA (121, 122, 128, 129).

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi KOD BOLESNIKA BUBREGA?

Među genima koji obrađuju miRNA, mutacije u DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 i XPO5 (kodiraju exportin 5) prijavljene su u Wilmsovim tumorima koji nisu bili naivni i neoadjuvantno tretirani kemoterapijom (Slika 3) (121, 122, 128). ). Oko 33% ispitanih Wilmsovih tumora pokazuje štetne mutacije u genima miRNA-procesiranja (128). Ponavljajuća mutacija žarišta (E1147K) u met al-vezujućem (Mg2+) ostatku RNase IIIb domene DROSHA, za koju se čini da je jedinstvena za Wilmsov tumor, ukida katalitičku aktivnost ove domene, što rezultira nepotpunim cijepanje pri-miRNA i smanjeno sazrijevanje miRNA (128). Somatske žarišne mutacije koje utječu na RNase IIIb domenu DICER1 ometaju obradu 5p miRNA (one izvedene iz 5′-kraka pre-miRNA ukosnice) (129) i često se nalaze kao mutacije "drugog udara" koje djeluju u tandemu s DICER1 mutacije zametne linije koje induciraju Wilmsovu tumorigenezu kod DICER1 sindroma (poremećaj koji povećava osjetljivost na razne tumore) (130-132). Ostaje nejasno zašto poremećena funkcija DICER1 kod Wilmsovih tumora dovodi do perzistentne i aberantne nefrogeneze, za razliku od gubitka Dicer1 u progenitorima mišjeg nefrona, što uzrokuje povećanu apoptozu i prerano prestanak nefrogeneze (72-75). Neke potencijalne mogućnosti uključuju da aktivnost doziranja gena može biti ključna u određivanju preživljavanja ćelija ili da mutacije u domeni RNaze IIIb mogu uticati na specifičnost vezivanja miRNA od strane DICER1.

Mutacije u genima za obradu miRNA su povezane sa smanjenjem regulacije važnih miRNA, uključujući članove miR-200 (121) i let{3}} porodica (slika 3) (121, 129). Neka -7 miRNA i RNA-vezujući protein Lin28 funkcionišu zajedno kako bi kontrolirali vrijeme prestanka mišje nefrogeneze, moguće putem regulacije gena Igf2 koji potiče rast (133). Prekomjerna ekspresija Lin28 tokom razvoja bubrega uzrokuje ekspanziju nefrogenih progenitora, inhibirajući njihov konačni talas diferencijacije, što kulminira neoplastičnom transformacijom koja u velikoj mjeri podsjeća na humani Wilmsov tumor (134). Povećani broj kopija DNK LIN28B i gubitak kopije DNK let-7a uočeni su u 25% i 46% humanih uzoraka Wilmsovog tumora, respektivno (126). U skladu sa ovim zapažanjima, mutacije zametne linije u ljudskom genu DISL3L2, koji kodira egzoribonukleazu odgovornu za razgradnju prethodno procesiranih oblika let-7, uzrokuju Perlmanov sindrom i predispoziciju za Wilmsov tumor (135, 136). Perlmanov sindrom je urođeni sindrom prekomjernog rasta koji karakteriziraju makrozomija, polihidramnion, facijalna dismorfologija, bubrežna displazija i nefroblastomatoza (prekursorska lezija za Wilmsov tumor) (137). Među novorođenčadi sa Perlmanovim sindromom koja prežive nakon neonatalnog perioda, 64% razvije Wilmsov tumor (138). Zanimljivo je da su potpune ili djelomične delecije DISL3L2 pronađene u oko 30% sporadičnih pregledanih Wilmsovih tumora (136).

Nedavna studija ojačala je značaj regulatorne mreže miRNA u etiologiji Wilmsovog tumora. Autori su otkrili da je gen pleiomorfnog adenoma 1 (PLAG1) jedan od gena sa najkonzistentnijom regulacijom u Wilmsovim tumorima s mutacijama u genima koji obrađuju miRNA (125). Ektopična ekspresija PLAG1 u bubregu miša u razvoju uzrokuje neoplaziju, koja je praćena transaktivacijom njegovog ciljnog gena, Wilmsovog tumorskog onkogena IGF2. miR-16 i miR-34, koji su smanjeni u Wilmsovim tumorima, identifikovani su kao potencijalni regulatori ekspresije PLAG1 (125). Tabela 2 sumira druge studije koje su prijavile aberantnu ekspresiju specifičnih miRNA povezanih s etiologijom Wilmsovog tumora. Zanimljivo je da ove miRNA mogu funkcionirati kao onkogeni (nazvani oncomiR) ili tumorski supresori u okruženju razvoja Wilmsovog tumora, ovisno o prirodi njihovih meta.

MiRNA kao potencijalni biomarkeri i terapeutski agensi

Osim svoje intracelularne lokacije, miRNA su prisutne u značajnim količinama u biološkim tekućinama, uključujući krv, plazmu, urin, majčino mlijeko i pljuvačku (139). Ove cirkulirajuće miRNA pronađene su upakovane u mikročestice (egzozomi, mikrovezikule i apoptotska tijela) (140, 141), konjugirane s AGO (142) ili nukleofosminom 1 (143) ili učitane u HDL (144), što ih čini izvanrednim. stabilan čak i pod nepovoljnim uslovima, kao što su ključanje, ekstremne varijacije pH vrednosti, produženo skladištenje i višestruki ciklusi zamrzavanja-odmrzavanja (145, 146). Dakle, miRNA potpisi u biološkim tečnostima mogu odražavati povezanost sa fiziološkim ili bolesnim stanjima (147). Zajedno, ove karakteristike čine cirkulirajuće miRNA atraktivnim za upotrebu kao neinvazivni biomarkeri za dijagnozu i prognozu bolesti.

Cirkulirajuće miRNA se mogu ekstrahovati direktno iz nefrakcionisanih bioloških tečnosti ili ekstracelularnih preparata larnih vezikula korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta za ekstrakciju (148) ili TRIzola (149). Nakon izolacije, miRNA se mogu čuvati na -70 stepeni i ostati stabilne do 1 godine (148). Postoji nekoliko dostupnih platformi za profilisanje miRNA, uključujući hibridizaciju mikromreža, qPCR i sekvenciranje sljedeće generacije (150). Microarray i qPCR su najčešće korištene metodologije za istraživanje ekspresije poznatih miRNA (151). Obje metode imaju prednosti što su jednostavne za korištenje, relativno brze od označavanja RNK do generiranja podataka i relativno isplative (152). Međutim, oni se oslanjaju na dostupnost i tačnu napomenu sekvenci miRNA u bazama podataka za dizajn sonde i prajmera (150). Iako skuplje, sekvenciranje nove generacije omogućava istovremeno otkrivanje i poznatih i novih vrsta miRNA i nudi visoku osjetljivost (153). Nadalje, jednonukleotidna rezolucija sekvenciranja sljedeće generacije omogućava identifikaciju izomiR-a, koji su zrele miRNA izoforme koje se razlikuju od kanonskih po dužini, sekvenci ili oboje (154, 155), koji mijenjaju specifičnost ciljanja miRNA ( 156).

Različite studije su istraživale potencijal cirkulirajućih miRNA kao biomarkera za pedijatrijske bubrežne bolesti (157–160). Na primjer, jedna studija je identificirala 14 miRNA koje su značajno povećane u serumu pacijenata s Wilmsovim tumorom. Zanimljivo je da bi potpis baziran na ekspresiji miR-100-5p i miR{4}}p mogao razlikovati ove pacijente od zdravih kontrola preciznošću, osjetljivošću i specifičnošću (159). Iako su nalazi iz ove studije i mnogih drugih studija pružili uvjerljivu motivaciju za istraživanje potencijala cirkulirajućih miRNA kao biomarkera, potrebno je prevladati nekoliko prepreka na terenu prije široke kliničke primjene. Prvo, postoji relativan nedostatak konsenzusa između studija vjerovatno zbog odsustva standardizirane metodologije za pročišćavanje (161) i analize uzoraka (npr. razlike u platformama za profiliranje miRNA, ref. 162, 163; ili razlike u smRNA-Seq biblioteci metode pripreme, ref. 164). Drugo, nedostatak studija velikog uzorka i detaljnih istraživanja o pojedinimbolesti.Drugi važan aspekt je da uticaj zbunjujućih varijabli kao što su starost, pol i vanjski faktori (npr. duhan, alkohol, itd.) na miRNA profile nije u potpunosti istražen (za detaljan pregled, pogledajte ref. 165).

Što se tiče terapeutske strane, nekoliko lijekova zasnovanih na miRNA je trenutno u kliničkim ispitivanjima, ali još uvijek nisu dobili odobrenje FDA (166, 167). Glavni pristupi miRNA terapiji uključuju obnavljanje nivoa miRNA uz pomoć imitacije miRNA ili inhibiciju specifičnih miRNA korištenjem antagomiR-a (168). Jedan od izazova povezanih s razvojem terapija zasnovanih na miRNA je identifikacija kandidata za miRNA za svaku bolest. Budući da je višestruke miRNA disregulirane u svakoj bolesti, treba izvršiti pažljivu analizu uzoraka pacijenata u kombinaciji s in vitro i in vivo testovima koji se bave patofiziološkim mehanizmima na koje utiču dotične miRNA kako bi se suzile miRNA kandidati za terapijsku intervenciju (168, 169). Drugi izazov uključuje razvoj strategija za poboljšanje stabilnosti in vivo i dostave lijeka specifičnog za lokaciju uz minimalnu toksičnost i efekte izvan cilja. Molekuli RNK su hemijski nestabilni zbog prisustva 2′-hidroksilne grupe na pentoznom prstenu. Kako bi osigurale veću stabilnost i zaštitu od nukleaza prisutnih u serumu ili endocitnom dijelu ćelija, biotehnološke kompanije su generirale RNA molekule s kemijskim modifikacijama (2′-O-metil grupa, fosforotioat ili zaključane nukleinske kiseline) u njihovoj kičmi (166). Što se tiče isporuke in vivo, tehnologije uključuju baziranu na lipidima (npr. lipidne nanočestice i neutralni liposom) i dendrimere konjugirane na ciljanu skupinu, među mnogim drugim strategijama. Glavni izazovi povezani sa sistemima isporuke miRNA su imunotoksičnost i ciljni afinitet prema mjestu bolesti (170). Strategije isporuke različitim metodama primjene (intraperitonealne, intravenske i potkožne injekcije) ili korištenjem vektora koji sadrže promotore specifične za bubrege i inducibilne promotore uspješno su korištene za selektivno ciljanje bubrega i izbjegavanje potencijalnih štetnih učinaka u drugim tkivima i organima (171, 172 ).

Tabela 2. Lista miRNA izmijenjenih u Wilmsovom tumoru

Lista miRNA, analiziranih uzoraka/uzoraka, nivoi miRNA uočeni u ovim uzorcima/uzorcima u poređenju sa odgovarajućim kontrolama, ciljnim genom, posljedicama promjena miRNA i referencama. CAMKK2, kalcijum/kalmodulin zavisna protein kinaza kinaza 2; CDC7, ciklus ćelijske diobe 7; CDH1, kadherin 1; CREB1, cAMP-response element-binding protein 1; EYA1, oči odsutan homolog 1; E2F3, E2F transkripcijski faktor 3; FRS2, supstrat FGF receptora 2; Glut1, transporter glukoze 1; IGF1R, IGF1 receptor; Jag1, nazubljen1; MET, mezenhimsko-epitelna tranzicija; MKNK1, MAPK-interagirajuća serin/treonin kinaza 1; PTEN, homolog fosfataze i tenzina; PUMA, p53-upregulirani modulator apoptoze; p73, tumorski protein p73; SIX1, sineoculis homeobox homolog 1; TGFBR1, TGF- receptor 1; WT, Wilmsov tumor.

Sažetak

Došlo je do eksplozije informacija u vezi biogeneze miRNA, regulacije ekspresije miRNA i funkcije miRNA od početnog otkrića miRNA 1993. (6, 7). Ovo je praćeno sve većim razumijevanjem kako miRNA funkcioniraju iu normalnoj fiziologiji iu patofiziologiji mnogih bolesti. Postalo je jasno da disregulacija ekspresije miRNA remeti rani razvoj bubrega i da je implicirana u patogenezi razvojnih bolesti bubrega, kao što su CAKUT i Wilmsov tumor. Sa nedavnim razvojem u upotrebi miRNA kao biomarkera i kao novih meta za lijekove, uvid u to kako miRNA reguliraju razvoj bubrega i bolesti od ključnog je značaja za razumijevanje kako se one mogu koristiti u novim dijagnostičkim i terapijskim pristupima ovim bolestima. Da bi se ti napori u potpunosti realizirali, kritične su buduće studije koje identificiraju funkciju specifičnih miRNA u razvoju bubrega, pored tehnologija za optimizaciju ciljanja malih oligonukleotidnih terapeutika na bubreg.

Priznanja

JH-ov laboratorij je podržan grantovima Nacionalnog instituta za dijabetes i bolesti probave i bubrega (R01DK125015 i R01DK102843). DMC je podržan od strane Nagrade za razvoj karijere Mreže za proučavanje nefrotskog sindroma i Postdoktorske stipendije Istraživačkog savjetodavnog vijeća Dječije bolnice u Pittsburghu. MT je podržao program ljetne istraživačke prakse Univerziteta u Pittsburghu (R25DK119180). Slike su kreirane sa BioRender.com. Adresa korespondencije sa: Jacqueline Ho, Odsjek za nefrologiju, Odsjek za pedijatriju, UPMC Children's Hospital u Pittsburghu, Rangos Research Center, 4401 Penn Ave., Pittsburgh, Pennsylvania 15224, SAD. Telefon: 412.692.9440; E-pošta: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A i dr. miRBase: od mikroRNA sekvenci do funkcije. Nukleinske kiseline Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. Većina mRNA sisara su konzervirane mete mikroRNA. Genome Res. 2009;19(1):92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Male RNK za utišavanje: svemir koji se širi. Nat Rev Genet. 2009;10(2):94–108.

4. Đuranović S, i dr. Utišavanje gena posredovano miRNA translacijskom represijom praćeno dedenilacijom i raspadom mRNA.

Nauka. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Utišavanje gena mikroRNA: doprinosi translacijskoj represiji i raspadu mRNA. Nat Rev Genet. 2011;12(2):99–110. 6. Lee RC, et al. Heterohronični gen C. elegans lin-4 kodira male RNK sa antisens komplementarnošću sa lin-14. Cell.