MikroRNA u razvoju i bolesti bubrega Ⅱ

Razvoj bubrega

Thebubreg sisara(ili metanefros) je vitalni organ koji igra ključnu ulogu uizlučivanje metaboličkog otpada,regulacija zapremine ekstracelularne tečnosti, iodržavanje elektrolitaiacidobazne homeostaze. Štaviše, bubrezi proizvode važne hormone, kao npreritropoetin, kalcitriol,renin, iprostaglandini(48). Funkcionalni kapacitet bubrega korelira sa brojem funkcionalnih nefrona koji se formiraju tokom razvoja bubrega prije rođenja, koji se također naziva nefron obdarenost. Svaki ljudski bubreg sadrži u prosjeku 1,000,000 nefrona, iako ovaj broj značajno varira, sa procjenama u rasponu od 200,000 do 2,000,{{8 }} nefroni (49, 50). Withstarenje,gubitak funkcionalne rezerve nefronajavlja se tokom vremena (51, 52); stoga je niska obdarenost nefrona pri rođenju povezana sa povećanim rizikom od razvoja hipertenzije i hronične bubrežne bolesti (CKD) kasnije u životu (53–55). Štaviše, CAKUT, koji dovodi do smanjenog obima nefrona i funkcije nefrona, je vodeći uzrok zatajenja bubrega kod djece, što rezultira značajnim morbiditetom i mortalitetom povezanim s transplantacijom i dijalizom (56, 57). Stoga, bolje razumijevanje ćelijskih i molekularnih mehanizama koji su u osnovi uspostavljanja broja nefrona i normalnog formiranja nefrona pruža uvid u nove načine predviđanja, prevencije i liječenja bolesti bubrega u djetinjstvu.

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi KOD BOLESNIKA BUBREGA?

Razvoj metanefričnog bubregapočinje oko embrionalnog dana 10.5 (E10.5) kod miševa i oko pete nedelje gestacije kod ljudi (58). Kao odgovor na induktivne signale iz metanefričnog mezenhima, mokraćovodni pupoljak se proteže od kaudalnog kraja Wolffovog kanala i invazira u susjedni mezenhim (slika 2). Istovremeno, morfogeni koji izlaze iz ureternog pupoljka indukuju kondenzaciju metanefričnog mezenhima da bi se formirao mezenhim kapice (koji se naziva i progenitori nefrona) oko vrhova ureternog pupoljka. Kako nefrogeneza napreduje, mokraćovodni pupoljak prolazi kroz uzastopne krugove grananja, izduživanja i diferencijacije kako bi stvorio sabirne kanale bubrega. Subpopulacija progenitora nefrona prolazi kroz mezenhimsko-epitelnu tranziciju i formira bubrežne vezikule, koje nakon polarizacije i elongacije postaju tjelesne strukture u obliku zareza i S. Konačno, distalni dio tijela u obliku slova S spaja se sa sabirnim kanalom i formira funkcionalni nefron (59–61). Tijelo u obliku slova S prolazi kroz daljnju diferencijaciju kako bi se formirali zreli tipovi ćelija nefrona, osim sabirnog kanala. Foxd1+ stromalne progenitorne ćelije su susjedne s progenitorima nefrona u vanjskoj kortikalnoj ili nefrogenoj zoni bubrega u razvoju (Slika 2) (62). Smatra se da signali iz kortikalne strome inhibiraju ekspanziju progenitorskih ćelija nefrona i stimulišu njihovu diferencijaciju, jer ablacija bubrežne strome dovodi do poremećene diferencijacije nefrona progenitora (63). Foxd1+ progenitorske ćelije stvaraju sve stromalne ćelije u metanefričnom bubregu, uključujući intersticijalne ćelije bubrežne kore i medule, pericite, perivaskularne fibroblaste, mezangijalne ćelije i vaskularne glatke mišićne ćelije (64, 65). Perturbacije u bilo kojem koraku ovog procesa mogu dovesti do CAKUT-a, glavnog uzroka CKD-a u djetinjstvu (66, 67).

Zreli nefron se sastoji od glomerula koji djeluje kao filtracijska jedinica i tubularnog stražnjeg sorpcionog odjeljka koji je podijeljen na proksimalni uvijeni tubul, Henleovu petlju, distalni uvijeni tubul i sabirni kanal (slika 2). Filtracijska barijera glomerula (koja se sastoji od fenestriranog endotela, glomerularne bazalne membrane, stopala i prorezanih dijafragmi podocita) omogućava filtraciju plazme i malih otopljenih tvari, dok selektivno zadržava proteine ​​poput albumina i imunoglobulina u krvi (68, 69). U međuvremenu, tubularni odjel za reapsorpciju odgovoran je za održavanje homeostaze vode, reapsorpciju otopljenih tvari (uključujući natrij, kalij, kalcij, fosfor, magnezij, glukozu i mnoge druge) i izlučivanje kiseline i drugih otpada.

MiRNA u bubregu u razvoju

U studijama na uslovnim transgenim miševima, miRNA su se pojavile kao kritični regulatori morfogeneze bubrega u više ćelijskih linija. Početne studije koje su procjenjivale funkcionalnu ulogu miRNA u razvoju bubrega koristile su uslovnu deleciju Dicera (70) u različitim renalnim linijama. Međutim, poznato je i da Dicer ima uloge nezavisne od miRNA (71), što je zakomplikovalo tumačenje ovih modela. Uslovna delecija Dicera u ranom metanefričkom mezenhimu ili progenitorima nefrona rezultira povećanom apoptozom progenitora nefrona, povišenim nivoima proapoptotičkog proteina Bim i preranim prekidom nefrogeneze (72-75) (Tabela 1). Zanimljivo je da gubitak Bim ekspresije u progenitorima nefrona s nedostatkom Dicer-a smanjuje apoptozu i djelomično obnavlja formiranje nefrona. Dvije miRNA eksprimirane u progenitorima nefrona, miR-17 i miR-106, identificirane su kao supresori BIM ekspresije (76). Zajedno, ovi nalazi ukazuju da miRNA kontroliraju ravnotežu između preživljavanja i apoptoze u progenitorima nefrona kako bi se osiguralo formiranje ispravnog broja nefrona tijekom nefrogeneze.

Slika 2. Šematski prikaz faza razvoja metanefričnog bubrega. Signali iz ureternog pupoljka pokreću kondenzaciju metanefričnog mezenhima kako bi se formirala kapa od progenitora nefrona (cap mesenchyme) oko vrhova mokraćovodnog pupoljka. Mezenhim kapice prolazi kroz mezenhimsko-epitelnu tranziciju i formira bubrežne vezikule, koje se uzastopno razvijaju u tijela u obliku zareza i S. Ove strukture se povezuju sa stabljikom mokraćovoda, što dovodi do sabirnog kanala. Ćelije u proksimalnoj domeni tijela u obliku slova S diferenciraju se u specijalizirane epitelne stanice zrelog bubrežnog tjelešca (tj. podocite i stanice Bowmanove kapsule), dok se stanice u srednjem i distalnom dijelu diferenciraju u tubularne segmente nefrona (proksimalni tubuli , Henleove petlje i distalni tubuli). Kreirano sa BioRender.com.

Uslovno brisanje Dicera u liniji pupoljaka uretera rezultira spektrom abnormalnosti koje jako liče na CAKUT, uključujući displaziju bubrega i razvoj cista sabirnih kanala (73, 77, 78). Prevremeni prekid morfogeneze grananja (kao odgovor na smanjenu ekspresiju Wnt11 i c-Ret iz ureternog pupoljka) je vjerovatno glavni faktor koji doprinosi bubrežnoj displaziji (73). Početak formiranja ciste javlja se na oko E15.5 i povezan je sa defektima u dužini primarnih cilija, povećanom apoptotičnom smrću ćelija i prekomernom proliferacijom ćelija (73). Kako Dicer ima važne uloge nezavisne od miRNA u ćeliji, uvjetno brisanje Dgcr8 je korišteno da se potvrdi da su fenotipovi uočeni u modelima uslovnih Dicer-nockout modela zaista rezultat gubitka miRNA. Životinje s delecijom Dgcr8 u distalnom nefronu i derivatima sabirnog kanala razvijaju hidronefrozu i ciste sabirnih kanala (79), fenotip sličan CAKUT-u koji nalikuje gubitku aktivnosti Dicera u liniji pupoljaka uretera.

Studije iz dvije nezavisne grupe pokazale su da ablacija Dicera iz linije renalne strome Foxd1+ i njegovih derivata rezultira spektrom bubrežnih anomalija, sa konzistentnim nalazima u vezi sa hipoplastičnim bubrezima, smanjenim brojem glomerula, abnormalnim sazrijevanjem glomerula i defektnim vaskularnim uzorkovanje (80, 81). Iako su obje grupe opisale uglavnom podudarne fenotipove koristeći slične modele miša, uočene su dvije različite razlike. Nakagawa et al. uočen nedostatak unutrašnje moždine i papile, kao i smanjenje nefrogene zone (80). Nasuprot tome, Phua et al. pokazala ekspanziju populacije progenitor nefrona i očuvanu bubrežnu papilu (81). Nakagawa et al. sugerira da su ovi defekti povezani s poremećajem signalizacije Wnt puta, što rezultira promjenama u migraciji i proliferaciji stromalnih stanica, zbog smanjenja regulacije miRNA stromalnih stanica, miR-214, miR-199a{{7 }}p, i miR-199a-3p (80). Studija Phua et al. sugerira da promjene u apoptotičkim programima (uključujući povećanu ekspresiju Bim i p53 efektorskih gena) doprinose fenotipskim defektima (81). Moguće je da genetske pozadinske razlike i/ili efikasnost rekombinacije posredovane Cre-om mogu biti odgovorne za razlike koje ove studije opisuju. Ipak, opisani fenotipovi su u skladu s poznatim višestrukim ulogama bubrežne strome u razvoju bubrega, a mehanizmi koji leže u osnovi ovih fenotipova su vjerovatno složeni s obzirom na prirodu Dicer delecije. Potrebne su daljnje studije koje ispituju specifične miRNA u različitim stromalnim subpopulacijama kako bi se bolje definirali regulatorni mehanizmi u igri.

Noviji rad bavio se pitanjem funkcije specifičnih miRNA u razvoju bubrega i nefrona. Koristeći model ljudskih embrionalnih matičnih stanica, Bantounas et al. pokazali su da inhibicija klastera miR-199a~214 dovodi do dismorfnih glomerula, aberantnih proksimalnih tubula, smanjene ekspresije WT1 i povećanih intersticijskih kapilara u organoidima sličnim bubrezima (82). Zanimljivo je da globalna delecija miR-210 koja reaguje na hipoksiju rezultira deficitom nefrona specifičnim za muškarce (83). Na primjer, uslovno brisanje klastera miR-17~92 u progenitorima nefrona i njihovim derivatima kod miševa narušava proliferaciju progenitornih ćelija i smanjuje broj nefrona u razvoju. Kao rezultat toga, mutantni miševi razvijaju proteinuriju, renalnu fibrozu i oštećenu funkciju bubrega (84). Disregulisani nivoi ciljnog gena miR-17~92, CFTR, uključeni su u defektnu proliferaciju progenitornih ćelija i smanjenu količinu nefrona u ovom mišjem modelu (85).

Sekvencioniranje male RNK (smRNA-Seq) se sve više koristi za profiliranje obrazaca ekspresije miRNA i za otkrivanje novih vrsta miRNA. smRNA-Seq nefrogenih mezenhimskih ćelija E15.5 identificirala je 162 označene miRNA koje su različito eksprimirane u ovoj ćelijskoj populaciji u poređenju sa cijelim bubrezima i 49 novih vrsta miRNA (86). Zanimljivo je da su nivoi miRNK porodice miR-200 značajno smanjeni u progenitorima nefrona. S obzirom da su članovi porodice miR-200 ključni regulatori mezenhimsko-epitelne tranzicije u sabirnom kanalu (87), nagađamo da bi njihova ekspresija mogla biti strogo regulirana kako bi se osigurala normalna epitelna diferencijacija progenitora nefrona tokom razvoja bubrega.

MiRNA funkcija u zrelom nefronu

Osim što su im potrebni tokom razvoja bubrega, miRNA regulišu brojne biološke procese u glavnim ćelijskim linijama koje formiraju zreli nefron (69, 88–91). U skladu s tim, opisana je specifična ekspresija miRNA duž nefrona, uključujući miR-143 i miR-195a u glomerulu, miR-107 i miR{{7} }a u proksimalnom tubulu, miR-193 i miR-378a u debelom uzlaznom ekstremitetu, miR-874 i miR-155 u distalnom zavijenom tubulu i miR{{ 12}}c u sabirnom kanalu (87). Štaviše, funkcionalne studije u odjeljcima zrelog nefrona podržavaju različite uloge miRNA.

Miševi kojima nedostaje Dicer ili Drosha u podocitima pokazuju izraženu proteinuriju, glomerulosklerozu i brzu progresiju do zatajenja bubrega, što je sekundarno zbog narušavanja barijere glomerularne filtracije (90-93). In silico analize su otkrile da različiti visokoregulisani transkripti u mutantnim glomerulima sadrže ciljne sekvence za članove porodice miR-30. Kao i sva četiri člana porodice miR-30 (miR-30c-1, miR-30b, miR-30d i miR-30c{ {9}}) su normalno visoko eksprimirane u podocitima, te miRNA mogu biti odgovorne za abnormalnosti podocita i poremećaj barijere glomerularne filtracije kod mutantnih miševa (91).

Pomalo iznenađujuće, brisanje Dicera iz postnatalnih proksimalnih tubula sisara ne utječe na razvoj bubrega, histologiju ili funkciju, ali štiti od ishemije bubrega/reperfuzijske ozljede. Mutantni miševi pokazuju bolju funkciju bubrega, smanjenu ozljedu bubrega, nižu tubularnu apoptozu i poboljšano preživljavanje u usporedbi sa svojim WT leglima (94). Ovo vjerovatno odražava "zbir" efekta delecije višestrukih miRNA u proksimalnom tubulu, jer su drugi radovi od tada pokazali da ekspresija specifičnih miRNA ima zaštitnu ulogu u bubrežnoj ishemiji/reperfuziji (npr. miR-16 i miR{2}} ref. 95, 96); dok su drugi štetni (npr. miR-182; ref. 97).

Iako se čini da su miRNA neophodne za funkciju proksimalnih tubula, one su neophodne za distalne nefrone i homeostazu sabirnih kanala (79, 88, 98). Inaktivacija Dicer-a i drugih kritičnih gena povezanih s biogenezom miRNA (uključujući Dgcr8, Ago1, 2, 3 i 4) uzrokuje zatajenje bubrega kod odraslih miševa zbog progresivne tubulointersticijske fibroze i intersticijske upale (88). Ovome prethodi djelimična epitelno-mezenhimalna tranzicija (EMT) ćelija sabirnih kanala i smanjenje regulacije članova porodice miR-200, koji inhibiraju EMT (88). Slično, ablacija ili Dicera ili Dgcr8 iz derivata distalnog nefrona i ureternog pupoljka, respektivno, dovodi do abnormalnosti bubrega i zatajenja bubrega (78, 98), koji su u konačnici povezani sa smanjenjem regulacije miR-200 članova porodice (98). Povećana ekspresija miR-200 ciljnog gena Pkd1 kod ovih mutantnih miševa remeti tubulogenezu i proizvodi strukture slične cistama (98). Ove razlike u potrebi za funkcionalnim miRNA u proksimalnim tubulima i distalnom nefronu/sabirnom kanalu mogu se objasniti segmentalnom distribucijom miRNA duž dužine nefrona i sabirnog kanala u WT bubrezima (88).

Brisanje Dicera u ćelijama koje luče renin u jukstaglomerularnom aparatu rezultira deficitom jukstaglomerularnih ćelija, smanjenim nivoom renina u cirkulaciji sa posljedičnim smanjenjem arterijskog krvnog pritiska, smanjenom funkcijom bubrega, prugastim uzorkom intersticijalne fibroze i vaskularnim abnormalnostima (89). Smanjenje jukstaglomerularnih ćelija ukazuje na potrebu za zrelim miRNA u održavanju njihovog fenotipa. Kasnije su miR-330 i miR-125b-5p identifikovani kao potencijalni kandidati koji ili inhibiraju ili promovišu, respektivno, fenotip glatkih mišića jukstaglomerularnih ćelija (99).

Ostala aktivna područja istraživanja miRNA kod akutne ozljede bubrega (8-10), policistične bolesti bubrega (11) i transplantacije bubrega (10), sveobuhvatno su obrađena u drugim nedavnim pregledima.

MiRNA u pedijatrijskim bubrežnim bolestima U ovom odeljku dajemo pregled uloge miRNA u razvojnim bolestima bubrega, uključujući CAKUT i Wilmsove tumore. CAKUT su među najčešćim oblicima malformacija pri rođenju, koji pogađaju otprilike 3-7 od 1000 živorođenih (100). Poremećaj razvoja bubrega i donjeg urinarnog trakta dovodi do širokog spektra kliničkih manifestacija uočenih kod CAKUT-a, uključujući bubrežne anomalije (tj. bubrežnu agenezu, bubrežnu hipoplaziju i displaziju i multicistične displastične bubrege), ureteropelvične anomalije (tj. opstrukciju ureteropelvice), duplex sabirni sistem i anomalije mokraćne bešike i uretre (101–103). Ova fenotipska heterogenost je vjerovatno posljedica složenih interakcija između genetskih, epigenetskih i/ili prenatalnih faktora okoline koji utiču na razvoj bubrega i donjeg urinarnog trakta, što rezultira CAKUT-om (101). Većina našeg trenutnog znanja o patogenezi CAKUT-a proizašla je iz mišjih modela i sindromskih oblika CAKUT-a. Ove studije su dovele do identifikacije nekoliko CAKUT gena, od kojih su mnogi uključeni u rani razvoj bubrega, uključujući PAX2, SALL1, HNF1B, EYA1, GATA3, RET, WNT4, GDNF, SIX1, SIX2 i druge (101, 104, 105). Međutim, pojedinačne mutacije ili varijante broja kopija u genima koji kodiraju protein ne objašnjavaju većinu slučajeva CAKUT-a (~80%) (101, 106).

Kao što je gore spomenuto, iscrpljivanje zrelih miRNA iz različitih ćelijskih linija bubrega u razvoju u modelima miša rezultira bubrežnim abnormalnostima koje oponašaju ljudski CAKUT (73, 74, 78, 79). Osim toga, delecije zametne linije MIR17HG, koji kodira miR-17~92 klaster, uzrokuju Feingoldov sindrom tipa 2 kod ljudi (107). Iako fenotip bubrega kod pacijenata sa Feingoldovim sindromom tipa 2 sa mutacijama MIR17HG ostaje nedefinisan, prijavljena je incidencija CAKUT-a od 18% u slučajevima Feingoldovog sindroma povezanim sa MYCN mutacijama (108, 109). Zajedno, ova zapažanja sugeriraju da mutacije u miRNA izražene tokom razvoja bubrega mogu uzrokovati CAKUT kod ljudi, posebno jer su mnoge miRNA visoko konzervirane između miševa i ljudi.

Da bi se testirala ova hipoteza, jedna studija je istraživala 1248 pacijenata sa nesindromskim CAKUT-om iz 980 porodica i tražila mutacije u 96 regiona petlje stabla 73 miRNA gena za razvoj bubrega (106). Unutar ove kohorte identificirana je 31 osoba sa 17 različitih pojedinačnih varijanti nukleotida koje utječu na 16 različitih gena miRNA. Među njima, dvije nove varijante miRNA su otkrivene kao potencijalno patogene. MIR19B1 (član klastera miR-17~92) je bio povezan sa prisustvom ageneze desnog bubrega, a MIR99A je bio povezan sa teškim vezikoureteralnim refluksom i ptozom bubrega. Ovaj iznenađujuće mali broj kandidata za patogene varijante dijelom je posljedica ograničenja ove studije, jer je analiza uzela u obzir samo mutacije u genima miRNA koje su bile uključene u pristup gena kandidata i nisu otkrile varijacije u broju kopija i velike preraspodjele DNK (106) .

U alternativnom pristupu, segmenti uretera pacijenata sa različitim CAKUT-om analizirani su na diferencijalnu ekspresiju transkripta putem mikromreža, na prisustvo bioinformatički predviđenih miRNA ciljeva i zrelih miRNA putem qPCR (110). Koristeći ovaj višestruki pristup, identificirano je sedam miRNA sa potencijalnom ulogom u CAKUT-u, a među njima, has-miR-144 je značajno povećan kod pacijenata sa CAKUT-om. Analiza ontologije gena je pokazala da predviđeni has-miR-144 ciljni geni doprinose biološkim procesima uključenim u razvoj CAKUT-a, uključujući razvoj cijevi (22 ciljna gena), razvoj urogenitalnog sistema (18 ciljnih gena), razvoj bubrega (14 ciljnih gena) i razvoj embrionalnih organa (18 ciljnih gena) (110).

Potrebne su daljnje studije kako bi se definirali molekularni mehanizmi koji su u osnovi patogenih uloga miRNA u CAKUT-u. Nalazi ovakvih studija bit će kritični u poboljšanju njege pacijenata sa CAKUT-om i sprečavanju njihove progresije u CKD, pružanju odgovarajućeg genetskog savjetovanja za pacijente i njihove porodice i razvoju novih terapijskih strategija.