Aktivnost ksantin oksidoreduktaze u plazmi siromašnoj i bogatoj trombocitima kao indikator oksidativnog stresa kod pacijenata kojima je potrebna nadomjesna bubrežna terapija

Apstraktna pozadina: Ksantin oksidoreduktaza(XOR) je enzim hidroksilaze koji je uključen u metabolizam purina. XOR aktivnost može varirati: homodimerni protein se može pretvoriti u dvije različite izoforme XD (antioksidans) i XO (prooksidans). Oksidativni stres i upale koje pratehronična bolest bubrega(CKD), dijaliza i transplantacija bubrega, rezultirali su aktivacijom trombocita. Cilj ove studije bio je da se utvrdi uticaj primenjene bubrežne nadomjesne terapije na ksantin oksidoreduktazu i njenu aktivnost izoforme.

Materijali i metode: Studijsku grupu činilo je 117 pacijenata, podijeljenih u 4 grupe: pacijenti na hemodijalizi - 30, pacijenti na peritonealnoj dijalizi - 30, pacijenti sa transplantacijom bubrega - 27 i konzervativno liječenje {{5} } pacijenata. Kontrolnu grupu činilo je 30 zdravih dobrovoljaca. Rezultati: Nađene su značajne razlike u XOR aktivnosti u plazmi siromašnoj trombocitima (PPP) unutar ispitivanih grupa (p=0.001). Postojala je veza između vrste bubrežne nadomjesne terapije svih izoformi oksidoreduktaze u PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Theuzrok hronične bolesti bubregase takođe ogleda u razlikama u XD i XO aktivnosti u PPP.

Zaključci: Vrsta bubrežne nadomjesne terapije koja se primjenjuje u bolesnika s CKD, starost pacijenata, trajanje dijalize, uzroci CKD i stupanj progresije značajno utiču na aktivnost XOR-a i njegovih izoforma.

Ključne riječi: ksantin oksidoreduktaza, trombociti, bubrežna nadomjesna terapija,Hronična bolest bubrega, Antioksidativni enzimi

KOLIKO JE TREBA DA CISTANCHE proradi?

Pozadina

Ksantin oksidoreduktaza (XOR) je enzim hidroksilaze uključen u metabolizam purina. Katalizuje oksidaciju hipoksantina u ksantin i ksantina u mokraćnu kiselinu (UA). XOR aktivnost može varirati: homodimerni protein se može pretvoriti u dvije različite izoforme. Ksantin dehidrogenaza (XD) je izražena pretežno u zdravom tkivu, a ksantin oksidaza (XO) nastaje posttranslacionom XD modifikacijom, oksidacionim ostacima cisteina kao i ograničenom proteolizom, igrajući dominantnu ulogu u ćelijama i tkivima tokom povreda [1-3 ]. Aktivnosti navedenih izoforma su suprotne jedna drugoj [4]. XOR djeluje u prisustvu NAD+ kao dehidrogenaza, a s molekularnim kisikom kao oksidaza. Sposobnost XOR-a da se brzo pretvori iz antioksidansa u oksidans, u različitim vrstama oštećenja tkiva, bitan je element za brzi urođeni imunološki odgovor, koristan kod, na primjer, bakterijske ili gljivične infekcije [5].

Intermedijeri reakcije ksantin dehidrogenaze (XDO) i kisika mogu reagirati i sa NAD+ i sa O2, ali imaju veći afinitet za NAD+ [6]. Ova međuizoforma nije izolirana, ali određivanje njene aktivnosti olakšava praćenje transformacije XD u XO [7].

Aktivnost serumskog XOR-a kod raznih bolesti je široko istražena. Razlog interesovanja za ovaj enzim je dualizam njegovog djelovanja: sposobnost proizvodnje antioksidansa, a s druge strane stvaranje reaktivnih kisikovih vrsta. Povećanje aktivnosti XOR javlja se kod patoloških stanja kao što su virusni hepatitis, infektivna mononukleoza, autoimune bolesti, pneumonija, šizofrenija i dijabetes tipa II. Povećanje aktivnosti XOR-a je također uočeno u serumu pacijenata nakon transplantacije bubrega ili jetre [8]. Pokazalo se da gen koji kodira XOR može biti odgovoran za sazrijevanje bubrega i adipogenezu u bubrezima, te može spriječiti transformaciju epitelnih stanica u mezenhimsko tkivo [9]. Međutim, zbog našeg najboljeg znanja, ne postoje objavljeni izvještaji koji istražuju aktivnost XOR u plazmi siromašnoj trombocitima (PPP) i plazmi bogatoj trombocitima (PRP) kod pacijenata koji su podvrgnuti terapiji zamjene bubrega. Važnost aktivnosti XOR-a u ovoj grupi pacijenata povezana je sa povećanom aktivacijom trombocita, koja je uzrokovana oksidativnim stresom i infamacijom koja prati kroničnu bubrežnu bolest (CKD), dijalizu i transplantaciju bubrega. Osim toga, tokom dijalize i transplantacije organa dolazi do oštećenja tkiva i krvnih sudova, a trombociti su prve ćelije koje dospevaju do mesta oštećenja tkiva, aktivno učestvujući u početnim fazama upalnog procesa i zarastanja [10].

PRP i PPP su frakcije krvne plazme s različitim koncentracijama trombocita. Sadržaj trombocita u PRP i PPP je trombociti/ml, odnosno trombociti/ml. PPP i PRP se dobivaju višekratnim centrifugiranjem i ispiranjem pune krvi ljudi različitim centrifugalnim brzinama [11, 12].

PPP, kao nusprodukt centrifugiranja antikoagulirane krvi, ima nižu koncentraciju trombocita od normalne krvi. Glavne komponente PPP su fibrinogen, fibronektin i trombin. Biološki efekti PPP-a su učešće u hemostazi i koagulaciji, djelujući kao vektor vezivanja stanica i promoviraju mitozu fibroblasta i epitelnih stanica [13]. Iako PPP nije tako koncentriran u trombocitima kao PRP, pokazano je da PPP također može održati rast i preživljavanje stanica. PPP potiče ćelijske funkcije povezane sa zarastanjem rana i ubrzava migraciju ćelija i proliferaciju fibroblasta [14, 15]. Plazma bogata trombocitima ima više koncentrisanih trombocita od normalne plazme (približno 150-400×103 ćelija/dL). To je jedna od najčešćih definicija PRP-a u literaturi [16]. Do danas, ograničene studije karakterizirale su XOR i njegovu aktivnost izoforme u plazmi bogatoj ili siromašnoj trombocitima kod pacijenata koji boluju od kronične bolesti bubrega. Tan et al. pokazalo da ćelije oštećene reaktivnim vrstama kiseonika (ROS) (u slučaju hronične bubrežne nadomjesne terapije) „cure“ XOR izoforme, što dovodi do povećanja nivoa enzima u plazmi [17]. Ovaj mehanizam objašnjava nižu aktivnost XOR-a i njegovih izoformi u trombocitima u odnosu na PPP. Stoga je aktivnost oksidoreduktaza u PPP i PRP od velikog interesa, jer bi mogle pomoći u otkrivanju ćelijskih procesa koji se dešavaju svakodnevno, sis. Ovakva istraživanja bi također mogla indirektno ukazati na težinu oksidativnog stresa u ovoj grupi pacijenata.

Berry et al. opisuju i da se ksantin oksidoreduktaza distribuira u jetri, tankom crijevu, mliječnoj žlijezdi i endotelnim stanicama. Metode subcelularne lokalizacije su pokazale prisustvo ksantin oksidoreduktaze kako u citoplazmi tako i na ćelijskim membranama. Oni također ukazuju na to da ksantin oksidoreduktaza u plazmi može biti posljedica zasjenjenja ksantin oksidoreduktaze sa ćelijskih membrana ili curenja iz citoplazme. Ovo je jedan od razloga zašto testiramo aktivnost XOR u PPP i PRP kako bismo razlikovali aktivnost enzima u trombocitima i drugim krvnim stanicama sadržanim u plazmi [18]. Na osnovu aktivnosti antioksidativnih enzima možemo odrediti i za koji tip bubrežne nadomjesne terapije je manja vjerovatnoća da će pacijenta izložiti oksidativnom stresu. Zbog dualne prirode XOR-a, razumijevanje odnosa između vrste bubrežne nadomjesne terapije i aktivnosti XOR izoformi može biti vrlo zanimljivo i od pomoći u odabiru vrste bubrežne zamjenske terapije.

materijali i metode

Etičko odobrenje i pristanak

Bioetička komisija Pomeranskog medicinskog univerziteta u Ščećinu odobrila je sprovedeno istraživanje (br. KB−0012/36/11). Svi sudionici, uključujući i zdrave dobrovoljce u kontrolnoj grupi, upoznati su sa svrhom i obimom istraživanja i dali su saglasnost za doniranje uzoraka i objavu dobijenih podataka.

Studijska grupa

Učestvovalo je 147 učesnika: kontrolna grupa od 30 zdravih dobrovoljaca (NK) i 117 pacijenata sa hroničnom bolešću bubrega (CKD) koji su pohađali Kliniku za nefrologiju, transplanetologiju i unutrašnje bolesti Pomeranskog medicinskog univerziteta u Ščećinu. Pacijenti su podijeljeni u 4 grupe prema tretmanu koji su primili: 30 pacijenata prije i poslije hemodijalize (HD A i HD B): 30 pacijenata je primilo peritonealnu dijalizu (PD); 27 pacijenata prije i poslije transplantacije bubrega (5-7 dana nakon operacije) (TE, TE A); 30 pacijenata je primilo konzervativno liječenje (CT) (KBB stadijum 2–5). Spol, dob, trajanje dijalize, uzrok i stadij kronične bubrežne bolesti, te koncentracija kreatinina u ispitivanoj i kontrolnoj grupi dati su u tabelama 1. i 2.

Uzorci

Uzorci krvi (K2EDTA (8 ml), 3,8% trinatrijum citrat (9:1; v/v) i serum (8 ml)) uzeti su od svih učesnika studije. Hemodijaliziranom pacijentu uzeta je krv iz arteriovenske fistule; Kod svih ostalih učesnika korišćena je periferna venepunkcija. Uzorci su uzeti od pacijenata na hemodijalizi prije (HD A) i oko 10 minuta nakon zaustavljanja pumpe (HD B). Krv transplantiranog pacijenta uzeta je prije transplantacije (TE) i 5-7 dana nakon operacije (TE A). Pacijenti regrutirani za TE grupu nisu pripadali grupi pacijenata na hemodijalizi ili peritonealnoj dijalizi u ovoj studiji. Radilo se o pacijentima kvalifikovanim za transplantaciju iz cijele Poljske. Velika većina pacijenata sa transplantacijom bubrega imala je prethodnu modalnu analizu. K2EDTA i uzorci zgrušane krvi centrifugirani su na 2600 rpm tokom 10 minuta na 20 stepeni da bi se dobila plazma, odnosno serum. Da bi se dobila plazma bogata trombocitima (PRP) i plazma siromašna trombocitima (PPP), krv sakupljena sa citratom je centrifugirana pod uslovima na 1100 rpm tokom 10 minuta na 20 stepeni. Dobijeni PRP je prebačen u novu epruvetu i centrifugiran na 6000 rpm tokom 10 minuta na 20 stepeni: plazma siromašna trombocitima (PPP) je prebačena u posebnu epruvetu; talog trombocita je dva puta ispran i suspendovan u Tyroda puferu (pH7,4). Plazma, serum, PPP i PRP su zamrznuti na -80 stepeni dok testovi nisu obavljeni. Kod pacijenata na hemodijalizi, krv je uzeta prije primjene heparina i nakon dijalize koja je u prosjeku trajala 4-5 h (poluvijek heparina - 4 h) kako bi se eliminirao svaki mogući utjecaj heparina na XOR aktivnost.

Aktivnost ksantin oksidoreduktaze u plazmi i trombocitima siromašnoj trombocitima

Određivanja su vršena Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P spektrofotometrom. Promjene ekstinkcije su zabilježene na 340 nm (XD) i 302 nm (XDO, XO) tokom 5 minuta na 30 stepeni. Enzimska aktivnost je mjerena kao stvaranje mokraćne kiseline i NADH (povećanje A340 i A302) i izražena u mU× mL−1 (milijedinice po mililitru). Enzimska aktivnost je izračunata, uzimajući u obzir početne brzine reakcije. Formiranje mokraćne kiseline je izmjereno na 302 nm (izoforme XDO i XO) jer je njena apsorpcija tamo još uvijek visoka, dok promjene u koncentraciji NAD+ ne doprinose. Koeficijent ekstinkcije za NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1] korišćen je za izračunavanje aktivnosti izoforma ksantin oksidoreduktaze NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1 ] [7, 19–22].

Tabela 1 Opće karakteristike pacijenata na hemodijalizi (HD), konzervativno liječenih peritonealnom dijalizom (PD), transplantacije bubrega (TE) i kontrolne grupe (C) koja je učestvovala u studiji (srednja vrijednost±SD)

P * - statistička značajnost za razlike između HD, PD i CKD grupa, TE i C egzaktni Fisherov test za kvalitativne varijable; za kvantitativne varijable - jednosmjerna ANOVA i; P ** - statistička značajnost za razlike između HD, PD i CKD grupa i TE egzaktni Fisherov test za kvalitativne varijable za kvantitativne varijable jednosmjerna ANOVA ili; DM - dijabetička nefropatija; HA - hipertenzija; GIK - glomerularna infamacija bubrega; ADPKD - policistična bolest bubrega naslijeđena autosomno dominantna; NS - nema statistički značajnih razlika.

Tabela 2. Opće karakteristike bolesnika na hemodijalizi (B - prije HD, A - poslije), konzervativno liječenih na peritonealnoj dijalizi (PD) prije i nakon transplantacije bubrega (TE B i TE A) i kontrolne grupe (NK) koji su učestvovali u studija (srednja vrijednost±SD)

P * - statistička značajnost za razlike između HD A, HD B, PD i CKD grupa, TE i C za kvantitativne varijable - Kruskal Wallis ANOVA, jednosmjerna ANOVA ili Studentov t-test P ** - statistička značajnost za razlike između HD A , HD B, PD i CKD i TE grupe za Kruskal Wallisove ANOVA kvantitativne varijable ili ANOVA jednosmjernu analizu Kt / V - indeks dijalize (volumenski udio V pročišćen klirensom K u vrijeme t) NS nisu pronađene statistički značajne veze

Statistička analiza Za procjenu raspodjela korišten je KS test (Kolmogorov-Smirnov), koji je u slučaju nekih varijabli (aktivnost XD i XDO izoformi u PRP) pokazao nenormalnu raspodjelu parametara. Za analizu kvantitativnih podataka korišteni su egzaktni Fisher i Hi-kvadrat test. Koristeći Studentov t-test i ANOVA analizu za univarijantne sisteme, evaluirane su razlike između pridruženih (uparenih) i nepovezanih (nesparenih) varijabli u slučaju varijabli sa normalnom distribucijom. U slučaju varijabli sa nenormalnim distribucijama, Kruskal-Wallisova ANOVA analiza je izvršena za procjenu razlika između parametara, kao i Mann-Whitney U neparametarski test za neuparene podatke ili Wilcoxon za uparene podatke. Linearni model višestruke regresije korišten je za određivanje multifaktorske procjene odnosa između proučavanih parametara. Statistička analiza rezultata izvršena je pomoću Statistica 12 (StatSoft).