-Lipoična kiselina povećava sintezu i taloženje kolagena u bubrezima pacova kod nedijabetičara i dijabetičara

Nevena Grdović i dr

-Lipoična kiselina (ALA) se široko koristi kao dodatak ishrani i terapeutsko sredstvo u liječenju dijabetesa. Smatra se da su dobro utvrđeni antioksidativni i hipoglikemijski efekti ALA posebno važni u borbi protiv dijabetičkih komplikacija, uključujućibubrežnipovreda. Ova studija procijenila je potencijal ALA da utječe na profibrotske događaje ububregkoje bi mogle promijeniti njegovu strukturu i funkcioniranje. ALA je davana intraperitonealno (10 mg/kg) nedijabetičnim i streptozotocinom indukovanim dijabetičkim mužjacima Wistar štakora tokom 4 i 8 nedelja. Efekti ALA su procjenjivani počevši od strukturnih/morfoloških promjena preko promjena koje karakteriziraju profibrotske procese, do regulacije ekspresije gena kolagena ububreg. Ovdje smo pokazali da ALA poboljšava sistemski nivo glukoze i ureje, smanjuje stvaranjebubrežninapredni krajnji proizvodi glikacije (AGE) i očuvan strukturni integritet bubrega kod dijabetičkih štakora. Međutim, profibrotični događaji izazvani dijabetesom nisu bili ublaženi ALA jer su sinteza/taloženje kolagena i ekspresija transformirajućeg faktora rasta- 1 (TGF- 1) i -aktina glatkih mišića (-SMA) ostali povišeni u ALA- liječenih dijabetičkih štakora, posebno nakon 8 sedmica od početka dijabetesa. Štaviše, 8 nedelja lečenja pacova bez dijabetesa sa ALA je dovelo do razvoja profibroznih karakteristika koje se odražavaju na povećanu sintezu/taloženje kolagena. Osim signalizacije TGF- 1 nizvodno, dodatni mehanizam koji leži u osnovi regulacije kolagena IV kod nedijabetičkih pacova liječenih ALA uključuje smanjenu DNK metilaciju njegovog promotora koja bi mogla nastati zbog povećane ekspresije Tet1. Ovi nalazi naglašavaju terapijski oprez pri upotrebi ALA, posebno kod pacijenata sabubrežnidijabetičarkomplikacije.

Za više informacija: ali.ma@wecistanche.com

Click to Cistanche ekstrakt u prahu za bolesti bubrega

1. Uvod

DijabetičarbubregBolest (DKD) ili dijabetička nefropatija je jedna od mikrovaskularnih komplikacija sa incidencom od 20-40 posto među dijabetičarima, što je praćeno progresivnim strukturnim promjenama i gubitkom funkcije bubrega [1]. Patofiziološki mehanizam koji leži u osnovi DKD je složen i počinje s kroničnom hiperglikemijom koja zauzvrat izaziva oksidativni stres, formiranje krajnjih produkata uznapredovale glikacije (AGEs), aktivaciju MAPK/PKC signalnih puteva i naknadnu ekspresiju nekoliko proinflamatornih i profibrotičkih medijatora [2, 3]. Preslušavanje između ovih događaja rezultira akumulacijom proteina ekstracelularnog matriksa (ECM) u mezangumu i tubulointersticijumu sa klasičnim histopatološkim obrascembubrežnifibroza. Počinje sa strukturnim promjenama kao što su zadebljanje bazalne membrane i mezangijalna ekspanzija, postepeno napredujući u glomerulosklerozu i intersticijsku fibrozu koja na kraju kulminira ububrežnineuspjeh[4, 5].

Transformirajući faktor rasta- 1 (TGF- 1) nizvodno signaliziranje je dio procesa zacjeljivanja rana koji se, nakon trajne upale, hiperglikemije ili oksidativnog stresa koji karakteriziraju dijabetes, pretvara u patofiziološku fibrozu [6] . TGF- 1 je centralni medijator patogeneze DKD kao glavni regulator ekspresije ECM proteina kod pacijenata sa dijabetesom, vjerovatno kao rezultat hiperglikemijskog i poremećenog oksidativnog okruženja [7–10]. TGF- 1 indukuje akumulaciju ECM stimulacijom kolagena tipa I i IV, sintezom aktina glatkih mišića (-SMA), laminina i fibronektina, kao i inhibicijom enzima koji razgrađuju ECM [11].

Kolagen tip IV je najzastupljeniji sastojak bazalne membrane [12], koji se u fiziološkim uslovima izražava u bazalnim membranama glomerula i tubula [13]. Međutim, dijabetička nefropatija je praćena aberantnom ekspresijom kolagena tipa IV koja uključuje prekomjernu proizvodnju i nepravilnu distribuciju kroz intersticij i mezangijum [14–16]. Među šest izoforma kolagena tipa IV (1- 6), 1(IV) i 2(IV) su univerzalno prisutni u svim bazalnim membranama. Lanci kolagena 1(IV) i 2(IV) kodirani su genima Col4a1 i Col4a2 čija se regulacija transkripcije oslanja na dobro opisane cis-trans interakcije [17], ali nedavna otkrića ističu važnu ulogu epigenetskih mehanizama, uključujući metilaciju DNK, u regulacija njihove ekspresije [18–20].

S obzirom na patofiziološke mehanizme koji leže iza DKD, strategije liječenja su jednostavne i ciljaju na hiperglikemiju i oksidativni stres. Utvrđeno je da hipoglikemijski i antioksidativni potencijal ALA, koji je jedan od široko korištenih antioksidanata, poboljšavabubrežnipatološke promjene povezane s dijabetičkom nefropatijom [21–23]. Međutim, u vezi sa starenjem kože, prijavljeni su korisni efekti ALA kroz povećanu sintezu kolagena tipa I u ljudskim dermalnim fibroblastima [24]. S obzirom na patofiziologiju DKD, sličan efekat ALA može biti štetan za dijabetičare sabubrežnikomplikacije. Uz ovu pozadinu, ova studija je bila fokusirana na procjenu efekata ALA na strukturne/morfološke karakteristike bubrega i profibrotičke procese s naglaskom na ekspresiju gena kolagena tipa IV kod dijabetičkih i nedijabetičkih štakora.

2. Materijal i metode

2.1. Životinje, tretmani i eksperimentalna postavka.Svi eksperimenti su izvedeni na 25-mjesečnim mužjacima albino Wistar štakora, težine između 220 i 250 g. Svi postupci na životinjama koje je odobrila Etička komisija za korišćenje laboratorijskih životinja Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stan-ković“ Univerziteta u Beogradu bili su u skladu sa Direktivom 2010/63/EU o zaštiti životinja koje se koriste za eksperimente i u druge naučne svrhe. Životinje u ovoj studiji žrtvovane su fizičkom metodom eutanazije pomoću giljotine, prema svim preporukama smjernica za eutanaziju životinja. Smrt nastupa momentalno, a životinje nisu patile. Eutanazija je obavljena u operacijskoj sali, odvojenoj od prostorije za smještaj, jedna po jedna životinja (ostale životinje u eksperimentu držane su u eksperimentalnoj prostoriji koja je odvojena od operacijske sobe u kojoj je vršena eutanazija kako bi se izbjegao stres za drugu životinje). Eutanaziju su izvodile dobro obučene i iskusne osobe. Oprema koja je korišćena za dekapitaciju je bila u dobrom stanju (redovno se vrše servisi da bi se obezbedila oštrina oštrica).

Dijabetes je izazvan višestrukim niskim dozama (40 mg/kg) injekcijama streptozoticina (STZ) (MP Biomedicals) pet uzastopnih dana; kontrolnim pacovima je ubrizgan samo vehikulum (0,1 M natrijum citratni pufer, pH 4,5). Nivo glukoze u krvi mjeren je 24 h nakon posljednje injekcije STZ glukometrom u krvi Accu-Chek Active, a životinje su smatrane dijabetičarima kada je nivo glukoze u krvi natašte prelazio 20 mmol/l. Štakori su nasumično podijeljeni u četiri eksperimentalne grupe: kontrolnu (kontrolnu, n=8), kontrolnu tretiranu ALA (ALA, n=8), dijabetičare (STZ, n=10) i dijabetičarsku grupu liječenu ALA (STZ/ALA, n=10). ALA (Ivančić i sinovijalna, Beograd, Srbija) je davana intraperitonealno (10 mg/kg) svakog dana tokom 4 i 8 nedelja, počevši od poslednje STZ injekcije. Nakon žrtvovanja i uzimanja krvi, napravljen je abdominalni rez i obojebubrezisu uklonjeni. Jedanbubregje zamrznut u tečnom azotu, držan na -80 stepenu i korišten za izolaciju proteina, DNK i RNK, dok je drugi fiksiran u 10 posto puferiranom formalinu za histološka ispitivanja.

2.2.Biohemijska analiza.Pacovi su postili preko noći prije žrtvovanja. Krvni serum je sakupljen nakon zgrušavanja krvi i centrifugiranja na 2,000 g 10 min. Serum je korišćen za određivanje koncentracije glukoze sa komercijalnim kompletom (Gluco-quant Glucose/HK; Boehringer), nivo triglicerida u serumu metodom GPO-PAP pomoću enzimatskog kompleta (Randox Laboratories, UK), nivo uree pomoću Urea Assay Komplet (Abcam, SAD) i koncentracije kreatinina koristeći Cayman's Creatinine Assay prema uputama proizvođača.

2.3.Histološka analiza i imunobojenje.Formalin-fiksiranbubregtkiva su dehidrirana u opadajućem nizu ksilola i alkohola radi posteriornog uključivanja u parafinske blokove. Blokovi tkiva su sečeni na 5 μm na rotacionom mikrotomu (RM 2125RT; Leica Microsystem). Kako bi se uočile promjene u morfologiji bubrega, presjeci tkiva su obojeni metodom Periodic Acid-Schiff (PAS). Dalje, obojeni rezovi su analizirani korišćenjem Olympus mikroskopa (BX-51) opremljenog mikroaktuatorom, motorizovanim stepenom i kamerom, kontrolisanim novim CAST stereološkim softverskim paketom Visiopharm Integrator System. Područja cjevastog lumena dobijena su pri uvećanju objektiva 40x i izražena u postocima (procentima) po ispitivanom području. Frakcija mezangijalnog matriksa procenjena je kao površina pozitivnog PAS bojenja, izražena kao procenat po ukupnoj površini glomerula (objektivno uvećanje 100x).

Za detekciju kolagenih vlakana, preseci tkiva su obojeni Masson trihrom bojom. Nakon bojenja, preseci su posmatrani pod svetlosnim mikroskopom (DM RB Photomicroscope Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Nemačka, opremljen Leica DFC 320 CCD kamerom; uvećanje objektiva 40x). Analiza slike je urađena softverom ImageJ (verzija 1.52p, Nacionalni institut za zdravlje). Slike su konvertovane u RGB stekove i primenjeno je ručno podešavanje praga da bi se procenio udeo površine kolagena po površini tkiva.

Imunohistohemijska analiza izvedena je kako je opisano u [25] korištenjem poliklonskih antitijela podignutih protiv N(?)-(karboksimetil)lizina (CML) (razrjeđenje 1: 50) (Santa Cruz Biotechnology, CA, SAD) i sekundarnih antitijela peroksidaze hrena (1: 100) (Santa Cruz Biotechnology). Presjeci tkiva su obojeni 3,3′-diaminobenzidinom (DAB), obojeni hematoksilinom, te montirani i posmatrani pod svjetlosnim mikroskopom (Leica DM RB fotomikroskop; objektivno povećanje 40x). Analiza slike je urađena softverom ImageJ (verzija 1.52p, Nacionalni institut za zdravlje). Slike su obrađene dekonvolucijom boja sa H DAB vektorskom opcijom. CML signalizacija je izračunata kao srednji intenzitet sive boje DAB-a normalizovan na broj jezgara (dobijeno korišćenjem opcije Analyze Particles).

2.4.Western blot analiza.25 ug ofbubreghomogenati su odvojeni pomoću SDS-PAGE, prebačeni na poliviniliden difluoridne membrane i ispitani poliklonskim antitijelima protiv GAPDH (FL-335) i monoklonskim antitijelima protiv TGF- 1 pacova (3C11) i SMA (CGA7) svih iz Santa Cruz Biotechnology i sve razrijeđeno u omjeru 1:1,000. Detekcija je izvedena pomoću poboljšanog sistema detekcije hemiluminiscencije (Santa Cruz Biotechnology). Kvantifikacija imunoreaktivnih traka je izvršena pomoću softvera za elektroforezu TotalLab (Phoretix) (verzija 1.10) i normalizovana na GAPDH koji se koristi kao kontrola opterećenja.

2.5. Kvantitativni PCR u realnom vremenu (RT-qPCR).Ukupna RNK je izolovana izbubrezikoristeći RNeasy Mini Kit (Qiagen). Za sintezu cDNK, 1 ug ukupne RNK tretiran je sa DNazom I i reverzno transkribovan sa RevertAid First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Kanada) koristeći mješavinu nasumičnih heksamera i oligo (dT) prajmera. Nivoi mRNA su kvantifikovani korišćenjem 2x Maxima SYBR Green/- ROX qPCR Master Mix (Fermentas) na QuantStudio 3 PCR sistemu u realnom vremenu (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, SAD). Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) je korišten za dizajniranje prajmera (navedenih u dodatnoj tabeli S1) za procjenu Col4a1, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b i Ekspresije gena Tet1. Termički ciklusi su se sastojali od početne denaturacije na 95 stepeni /10 min i 40 ciklusa dvostepenog PCR na 95 stepeni /15 s i 60 stepeni /60 s. Nivoi ekspresije mRNA gena od interesa su normalizovani na nivo ekspresije mRNA Actb kao referentnog gena pomoću 2-dCT metode.

2.6. Izolacija genomske DNK i bisulfitna konverzija DNK.Genomska DNK je izolirana korištenjem pristupa Bio-On-Magnetic-Beads (BOMB) [26], prema protokolu za ekstrakciju DNK iz tkiva sisara (dostupno online na https://bomb.bio/protocols/). Genomska DNK je podvrgnuta protokolu konverzije BOMB bisulfita (dostupan na mreži na https://bomb.bio/protocols/) [26].

2.7. Mjerenje globalnog nivoa metilacije DNK.Globalni nivoi metilacije DNK mjereni su korištenjem 5-mC DNA ELISA kompleta (Zymo Research, Kalifornija, SAD) prema uputstvima proizvođača. Prečišćena genomska DNK (100 ng) izolirana izbubreziiz svih eksperimentalnih grupa, a svaki uzorak je analiziran u duplikatu. Statistička značajnost je procijenjena korištenjem jednosmjerne ANOVA sa blokiranjem, tretirajući svaku ELISA ploču kao blok.

2.8. PCR specifična za metilaciju (MSP).Parovi prajmera za MSP analizu, dizajnirani na promotorskom regionu Col4a1 koji obuhvata mesto početka transkripcije (TSS), dizajnirani su korišćenjem MethPrimer-a (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) (dodatna tabela S2 ). Položaji prajmera (u odnosu na TSS za Col4a1, označen kao plus 1) koji se koriste za MSP analizu su sljedeći: M fw (-35, -14), M rev ( plus 44, plus 64), U fw (-35, -14) i U rev ( plus 45, plus 69). Kako svaki prajmer pokriva 2 CpG-a, ukupno 4 CpG-a je testirano na status metilacije po paru prajmera. Reakciona smjesa za MSP je sadržavala Maxima SYBR Green/ROX qPCRqRT-PCR Master Mix (Fermentas), 20 ng bisulfitno konvertovane DNK i 0,5 μM svakog prajmera specifičnog za metiliranu (M) i nemetiliranu (U) DNK pri konačnoj zapremini od 10 μL. MSP je sproveden na QuantStudio 3 Real-Time PCR sistemu (Applied Biosystems). Uslovi ciklusa PCR-a bili su sledeći: početni koraci denaturacije na 95 stepeni /10 min i zatim 40 ciklusa denaturacije na 95 stepeni /15 s, i žarenje i elongacija na 58 stepeni /60 s. Relativni nivo metilirane DNK je izražen korištenjem indeksa metilacije definiranog kao 2 (demetilirani ciklus Ct) − (metilirani ciklus Ct) [27].

2.9.Statistička analiza.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD (standardna devijacija) za sve proučavane parametre. Studentov t-test je korišten za poređenje srednjih vrijednosti normalno raspoređenih varijabli između dvije grupe. Statističke razlike između grupa analizirane su jednosmjernom analizom varijanse (ANOVA), nakon čega je slijedio Tukey test višestrukog poređenja koristeći GraphPad Prism Software, ver. 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, SAD).

3. Rezultati

3.1.Utjecaj ALA na biohemijske indekse kod dijabetičkih pacova.Glukoza, trigliceridi, urea i kreatinin određivani su u serumu kontrolnih, dijabetičkih i dijabetičkih pacova koji su bili tretirani sa ALA (Slika 1). Dijabetičko stanje je praćeno 4 sedmice i 8 sedmica, kako bi se obuhvatio vremenski tok neophodan za ispoljavanje štetnih procesa. Obje grupe dijabetičkih štakora su bile okarakterisane hiperglikemijom, porastom nivoa triglicerida i kreatinina, ali bez statističke značajnosti, i značajno povišenim nivoima uree. Kod dijabetičkih štakora, 4 nedelje tretmana ALA rezultiralo je smanjenjem nivoa glukoze u serumu na kontrolnu vrednost, dok je nakon 8 nedelja nivo glukoze opao, ali je i dalje ostao značajno povišen u poređenju sa kontrolom. U obje grupe dijabetičara liječenih ALA, trigliceridi i kreatinin nisu bili značajno promijenjeni. Tretman ALA je značajno smanjio nivo uree kod dijabetičkih štakora nakon 4 sedmice, dok je nakon 8 sedmica nivo uree u serumu dijabetičkih pacova smanjen u poređenju sa kontrolnom populacijom dijabetičara, ali bez statističke značajnosti. Davanje ALA kontrolnim pacovima nije značajno uticalo na ispitivane biohemijske parametre.

3.2. Morfološka procjena bubrežne strukture i formiranja CML-a nakon tretmana ALA.PAS bojenje je istaklo karakteristične bubrežne histopatološke karakteristike povezane sa dijabetesom (Slika 2(a)). Zadebljanje bazalne membrane glomerula pojavilo se nakon 4 sedmice od početka dijabetesa, dok su ekspanzija mezangijalnog matriksa i tubuli sa proširenim lumenom uočeni nakon 8 sedmica od početka dijabetesa. Histološka analiza je otkrila da su tubularni lumen, glomerularni i mezangijalni matriks područja značajno povećani u 8 sedmica dijabetičkih štakora u odnosu na kontrolne i kontrolne pacove tretirane ALA. Međutim, nakon tretmana ALA, tubularna dilatacija i proširenje mezangijalnog matriksa značajno su se smanjili, ali su i dalje ostali iznad kontrolnih vrijednosti, dok je glomerularno područje potpuno vraćeno na kontrolne nivoe. Kod kontrolnih štakora tretiranih ALA, nađeno je da je frakcija mezangijalnog matriksa povećana što sugerira da bi dugotrajna upotreba ALA mogla utjecati na neke od strukturnih karakteristika ububrezi(Slika 2(a)).

AGE su patogeni faktori koji doprinose oštećenju bubrega kod dijabetesa. Kako bi se provjerilo da li ALA utječe na nakupljanje AGE proizvoda ububrezikod dijabetičkih pacova, CML bubrežni sadržaj je procijenjen imunohistohemijskim bojenjem u kontroli, dijabetičkim štakorima (4 i 8 sedmica) i kontrolnim pacovima tretiranim ALA i dijabetičkim pacovima (4 i 8 sedmica) (Slika 2(b)). Bojenje na CML je bilo pozitivno u obje grupe dijabetičkih štakora, otkrivajući da se CML akumulira uglavnom u tubulointersticijumu i u manjoj mjeri u glomerulima. Prema kvantificiranju sadržaja CML-a, ove promjene su bile statistički značajne u poređenju sa odgovarajućim kontrolama (Slika 2(b)). Nakon tretmana ALA dijabetičkih pacova (4 i 8 sedmica), i tubulointersticijalna i glomerularna CML imunoreaktivnost su se značajno smanjile, dok je kod kontrolnih pacova tretiranih ALA pozitivnost na CML ostala neotkrivena kao u kontrolama.

3.3. Učinak ALA na taloženje kolagena i ekspresiju gena Col4a1.Massonovo trihromno bojenje otkrilo je taloženje kolagena u tubulointersticijskim područjima i unutar glomerula, posebno u bazalnim membranama oba odjeljka kod dijabetičkih (4 i 8 sedmica) grupa pacova (Slika 3(a)). Tretman ALA (4 i 8 sedmica) nedijabetičkih pacova je također bio povezan sa povećanim taloženjem kolagena karakteriziranim glomerularnim i tubulointersticijskim područjima okupiranim matriksom obojenim kolagenom, ali bez statističke značajnosti. Kod dijabetičkih štakora liječenih ALA (4 i 8 sedmica), taloženje kolagena je uporno ostalo jer nije otkriveno značajno smanjenje u poređenju sa dijabetičkim štakorima. Da bi se potvrdilo povećanje sinteze kolagena, nivo ekspresije Col4a1 gena je procenjen pomoću RT-PCR (slika 3(b)). Utvrđeno je značajno povećanje ekspresije gena Col4a1 u bubrezima dijabetičkih štakora u obje vremenske tačke, kao iu bubrezima dijabetičkih i nedijabetičkih štakora liječenih ALA iz obje eksperimentalne grupe (4 i 8 tjedana), u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. .

3.4.Profibrotske promjene povezane s dijabetesom i liječenjem ALA.Western blot analiza je otkrila da nivo proteina TGF- 1 nije značajno varirao nakon 4 sedmice bez obzira na liječenje (Slika 4(a)). Međutim, statistički značajna indukcija TGF- 1 proteina je otkrivena nakon 8 sedmica dijabetesa, koja je blago smanjena tretmanom ALA, ali je ostala značajno povećana u poređenju sa kontrolom. Štaviše, slična indukcija TGF- 1 je uočena kod nedijabetičkih životinja tretiranih ALA (Slika 4(a)). Da bi se ispitalo da li je indukcija TGF- 1 bila praćena pojavom fibroznih markera, prisustvo SMA je analizirano korišćenjem Western blota (slika 4(b)). Dijabetičko stanje je pokrenulo ekspresiju SMA koja je otkrivena od četvrte sedmice nakon pojave dijabetesa pa nadalje. Tretman ALA dijabetičkih pacova smanjio je SMA na kontrolni nivo nakon 4 sedmice, ali je bio neefikasan nakon 8 sedmica. Tretman ALA nije uticao na SMA kod nedijabetičkih pacova nakon 4 sedmice, dok je nakon 8 sedmica doveo do povećane ekspresije SMA u odnosu na kontrolu, ali ovo povećanje nije bilo statistički značajno (Slika 4(b)).

Tretman pacova bez dijabetesa sa ALA je rezultirao sličnim otiscima u pogledu profibrotičkih karakteristika u poređenju sa dijabetičkim štakorima, što ukazuje na potrebu otkrivanja mehanizama koji leže u osnovi uočenih promjena sličnih fibrozi u bubrezima nedijabetičkih pacova liječenih ALA. Kako bi se istražila mogućnost da epigenetske modifikacije predstavljaju dodatne mehanizme uključene u uočeni ALA-indukovani profibrotički pejzaž kod nedijabetičkih štakora, u posebnom povećanju ekspresije Col4a1, bubrezi kontrolnih i nedijabetičkih štakora tretiranih ALA su dalje podvrgnuti analizi statusa metilacije DNK. .

3.5.Uticaj ALA na status metilacije DNK.Globalni nivo metilacije DNK i ekspresije gena glavnih igrača uključenih u metilaciju DNK (Dnmt1, Dnmt3a i Dnmt3b) i demetilaciju (Tet1) procijenjeni su u bubrezima nedijabetičkih kontrolnih i štakora tretiranih ALA tokom 4 i 8 sedmica (Slika 5. ). Samo nivo Tet1 mRNA pokazao je statistički značajno povećanje nakon 8 sedmica tretmana ALA, dok ekspresija Dnmts i globalni nivo metilacije DNK nisu pokazali značajnu razliku ni nakon 4 ili 8 sedmica tretmana ALA u odnosu na kontrolne skupine.

Sljedeći eksperiment je bio usmjeren na ispitivanje lokalnog nivoa DNK metilacije gena Col4a1. Glavni oblik kolagena IV sadrži dva 1(IV) lanca i jedan 2(IV) lanac, kodirani genima Col4a1 i Col4a2 koji su raspoređeni u orijentaciji glava-glava formirajući jedinstvenu transkripcionu jedinicu i transkribiraju se u različitim smjerovima od zajedničkih promoter [17]. Col4a1 je transkribovan iz intergenskog regiona dužine 130 bp koji sadrži dva mesta Sp1, CAAT i CTC kutije [17] (Slika 6(a)). Status metilacije DNK promotora Col4a1/Col4a2 procijenjen je pomoću MSP analize, a položaj prajmera je prikazan na slici 6(a). Oba para prajmera, specifična za metiliranu i nemetiliranu DNK, pokrivala su 2 CpG po prajmeru. Rezultati MSP-a su otkrili da ALA nije uticala na status metilacije Col4a1/Col4a2 promotora nakon 4-sedmičnog tretmana (Slika 6(b)). Međutim, statistički značajno smanjenje indeksa metilacije DNK uočeno je nakon 8 sedmica tretmana ALA (slika 6(b)), što ukazuje na potencijal ALA da modulira ekspresiju Col4a1 kroz promjenu obrasca metilacije DNK njegovog promotora.

4. Diskusija

Zbog epidemijskog udjela dijabetesa, DKD postaje najčešći uzrok završnog stadijuma bubrežne bolesti u svijetu i najindikativniji faktor za preranu smrtnost pacijenata sa dijabetesom [28, 29]. Incidencija DKD kod pacijenata sa dijabetesom nije smanjena u proteklim decenijama uprkos intenzivnom liječenju usmjerenom na kontrolu šećera u krvi [28, 30]. Među potencijalnim strategijama liječenja koje su pokazale korist protiv DKD je ciljanje oksidativnog stresa iu tom smislu je ustanovljeno da ALA može poboljšati funkciju bubrega kod dijabetesa [29, 31, 32]. Rezultati dobijeni u ovoj studiji potvrdili su hipoglikemijske efekte ALA, ali su ukazali na neefikasnost ALA protiv poremećenih nivoa uree kod dugotrajnog dijabetesa.

Povećanje glikemije sam ili u kombinaciji s oksidativnim stresom jedan je od mehanizama uključenih u formiranje AGE-a čija je akumulacija u glomerularnim i tubulointersticijskim odjeljcima u korelaciji sa stupnjem oštećenja bubrega u eksperimentalnom modelnom sistemu dijabetičke nefropatije [33, 34]. . CML je jedan od glavnih AGE in vivo [35] čiji se nivo povećava u cirkulaciji i organima uključujući bubrege dijabetičara [36], igrajući važnu ulogu u patogenezi dijabetičke nefropatije [37]. Naši rezultati su pokazali da se taloženje CML akumulira uglavnom u tubulointersticijalnom iu manjoj mjeri u glomerularnom odjeljku bubrega dijabetičkog pacova, što se značajno smanjilo nakon tretmana ALA. Prema objavljenim podacima, tubuli obogaćeni CML-om mogu biti najteže oštećeni bubrežni kompartment [38–40]. U suprotnosti sa našim rezultatom, opisani su ograničeni efekti ALA na sadržaj CML-a kod dijabetičkih štakora, detektovani i imunološkim bojenjem i hemijskom analizom [40] i ova nedoslednost može proizaći iz eksperimentalnog dizajna studije.

Histološka analiza strukture bubrega PAS bojenjem je potvrdila zaštitne efekte ALA kod dijabetesa. Blagotvorni antioksidativni efekti ALA protiv oksidativne povrede bubrega izazvane dijabetesom su dobro utvrđeni [22, 31, 32]. Utvrđeno je da liječenje ALA sprječava bubrežnu insuficijenciju i ublažava patološke promjene u strukturi bubrega uključujući ekspanziju glomerularnog mezangijalnog matriksa i glomerulosklerozu zbog njegovog kombiniranog antioksidativnog i hipoglikemijskog potencijala [21, 22]. Uzimajući u obzir da su visoka glukoza, oksidativni stres i stvaranje AGE-a priznati kao važni faktori za indukciju profibrotskih promjena u bubrezima [41], dobro utvrđeni antioksidativni i hipoglikemijski efekti, te sposobnost ALA da smanji sadržaj CML snažno zagovara potencijal ALA za ublažavanje fibroznog procesa u bubrezima dijabetičara. Međutim, naši rezultati su otkrili da se u Massonovom obojenim dijelovima bubrežnog tkiva stepen taloženja kolagenih vlakana nije značajno promijenio nakon tretmana ALA dijabetičkih štakora. Štaviše, tretman ALA pokazao je tendenciju povećanja sinteze/- sadržaja kolagena kod pacova bez dijabetesa. U skladu sa našim nalazima, prijavljeni su štetni efekti ALA na kontrolne/zdrave bubrege [42]. Proučavajući renoprotektivne mehanizme ALA kod dijabetičke nefropatije, autori su neočekivano otkrili da je liječenje ALA povezano s razvojem glomeruloskleroze, tubulointersticijske fibroze i opadanjem funkcije bubrega kod nedijabetičkih bubrega. Nezavisne studije su otkrile da veće doze ALA izazivaju oksidativno oštećenje proteina kod starijih štakora [43], pa čak i smanjenje bubrežne funkcije kod dijabetesa [40]. U skladu s tim, prooksidativni efekat ALA je dokazan ne samo u studijama na životinjama, već i kod pacijenata koji pate od završnog stadijuma bubrežne bolesti koji su primali intravenozno gvožđe [44].

U kontekstu uočenih efekata ALA na taloženje kolagena, naši rezultati su dodatno pokazali da ALA nije smanjila nivo dva fibrotična markera, TGF- 1 i -SMA, kod dijabetičkih štakora nakon 8 nedelja, pa čak ni inducirala TGF Ekspresija - 1 kod nedijabetičkih pacova nakon 8 sedmica liječenja. U skladu s tim, ekspresija gena kolagena tipa IV bila je značajno viša kod dijabetičara, kao i kod dijabetičkih i nedijabetičkih štakora liječenih ALA u odnosu na kontrolu. Ranije je pokazano da oksidativni stres inducira TGF- 1 i njegove nizvodne ciljne gene kao što su kolagen tipovi I, III i IV, kao i fibronektin [9, 45] i da antioksidansi potiskuju TGF{{ 10}} izraz [46]. Za razliku od opšte ideje o zaštitnoj i antifibrotičkoj ulozi antioksidansa, naši rezultati sugerišu da bi ALA mogla imati višestruke efekte na faktore uključene u fibrozni proces u bubrezima dijabetičara. Čini se da ALA specifično inducira ekspresiju nekih gena povezanih s fibrozom kao što su TGFB1 i posebno Col4a1 čija je povećana ekspresija otkrivena već nakon 4 sedmice liječenja ALA u dijabetičkim i nedijabetičkim bubrezima. Pojačana ekspresija i taloženje kolagena tipa I uočeno je nakon tretmana ALA u ljudskim dermalnim fibroblastima [24]. Studija je otkrila da je pojačana regulacija kolagena tipa I rezultat nizvodne signalizacije TGF-receptora I, što ukazuje na novi farmakološki učinak ALA koji je uključen u starenje kože. Uzimajući u obzir rezultate predstavljene ovdje, povećanje regulacije kolagena može biti uobičajeni ćelijski odgovor na ALA, a ne specifičan mehanizam karakterističan za dermalne fibroblaste.

Sinteza kolagena tipa IV regulisana je na dobro utvrđenom transkripcionom, posttranskripcionom i posttranslacionom nivou, ali se sve više podataka o ulozi metilacije DNK u ekspresiji Col4a1 pojavljuje. Studija obavljena prije 40 godina otkrila je da tretman F9 ćelija teratokarcinoma agensom za demetilaciju DNK 5-azacitidinom dovodi do povećane ekspresije Col4a1, sugerirajući po prvi put da metilacija DNK može igrati važnu ulogu u njegovoj ekspresiji [47]. Studije humanog metiloma i transkriptoma otkrile su korelaciju metilacije promotora Col4a1 s njegovom ekspresijom u zdravim i ćelijama jetre koje su aktivirane da proizvode ECM proteine ​​[20, 48]. Isto je pronađeno u mezangijalnim ćelijama gdje su se nakon tretmana 5-azacitidinom, nivoi mRNA Col4a1 značajno povećali [49]. Štaviše, kod pacijenata sa hroničnom bolešću bubrega, utvrđeno je da je nivo metilacije DNK gena Col4a1 i Col4a2 značajno niži u poređenju sa zdravim subjektima iu korelaciji sa povećanom ekspresijom mRNA i proteina [50]. Naši rezultati su potvrdili jake dokaze o regulaciji ekspresije Col4a1 kroz metilaciju DNK jer smo otkrili da ekspresija Col4a1 korelira sa statusom metilacije njegovog promotora u bubrezima. Treba napomenuti da uočene promjene u statusu metilacije Col4a1 promotora najvjerovatnije utiču i na ekspresiju Col4a2, budući da su dva gena regulirana putem međusobnog dvosmjernog promotorskog regiona. MSP prajmeri korišteni u našim eksperimentima dizajnirani su tako da se djelomično preklapaju sa dva mjesta vezanja Sp1 i smanjenje metilacije DNK koje smo primijetili nakon tretmana ALA moglo bi se odraziti na poboljšano vezivanje Sp1 i povećanje ekspresije Col4a1.

Naši nalazi da su ekspresija Col4a1 i njegov status metilacije skloni dejstvu ALA kod nedijabetičkih životinja nakon 8 nedelja tretmana ALA dodatno sugerišu potencijal ALA da deluje i kao epigenetski regulator. Prema našim rezultatima, ALA je utjecala na enzim Tet1 nakon 8 sedmica tretmana, u pravcu njegove povećane ekspresije, što ukazuje na mogućnost da se gen-specifična demetilacija može dogoditi bez vidljivog neto efekta na metilaciju DNK u cijelom genomu. Iako postoji korelacija između povećane ekspresije Col4a1 i smanjene metilacije njegovog promotora nakon 8 nedelja tretmana ALA, ipak je teško nedvosmisleno uzeti u obzir da je demetilacija DNK jedina uzročna veza između tretmana ALA i povećane ekspresije gena za kolagen dala je da nakon 4 sedmice, povećana ekspresija Col4a1 nije bila povezana s promjenom njegovog statusa metilacije. Sposobnost ALA da epigenetski reguliše određene gene je predložena za IL-1 i IL-6 gene čiji su smanjeni nivoi mRNA i proteina povezani sa hipermetilacijom njihovih promotorskih regija [51, 52]. Iako je hipermetilacija predložena kao jedan od mehanizama djelovanja ALA, detaljni putevi epigenetske regulacije koje pokreće ALA još uvijek nisu razjašnjeni i čekaju da budu potvrđeni i za druge gene. Dakle, veza između povećane sinteze/taloženja kolagena koja može rezultirati patološkim fenotipom i Tet-posredovanom DNK demetilacijom Col4a1 promotora izazvanom ALA tretmanom zahtijeva dodatno dokazivanje i trebala bi pružiti platformu za buduća istraživanja.

5. Zaključci

Zaštitna uloga ALA protiv poremećaja rada različitih organa, uključujući bubrege, uzrokovana dijabetesom, uglavnom se pripisuje njenim antioksidativnim i hipoglikemijskim efektima. Međutim, rezultati predstavljeni u ovoj studiji sugeriraju da bi zaštita bubrega kod dijabetesa pomoću ALA mogla biti ograničena zbog povećanja sinteze/taloženja kolagena u bubrezima. Analizirajući efekte ALA na profibrotičke procese u bubrezima dijabetičkih pacova, otkrili smo da ALA ne smanjuje ni sintezu kolagena ni profibrotske markere. Štaviše, tretman sa ALA je doprineo profibrotskim događajima i sintezi kolagena čak i u bubrezima pacova bez dijabetesa, što je delimično povezano sa promenama u statusu metilacije DNK gena Col4a1. Shodno tome, kod pacijenata sa renalnom fibrozom potreban je oprez u pogledu upotrebe ALA kako bi se izbjeglo pogoršanje postojeće bubrežne komplikacije. Štaviše, potreban je oprez kada se ALA koristi za povećanje antioksidativnog potencijala kod zdrave osobe ili u liječenju drugih dijabetičkih komplikacija jer bi korisni efekti za jednu komplikaciju mogli biti štetni za drugu.

1Katedra za molekularnu biologiju, Institut za biološka istraživanja "Siniša Stanković", Nacionalni institut Republike Srbije, Univerzitet u Beogradu, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Beograd, Srbija

2Odeljenje za citologiju, Institut za biološka istraživanja "Siniša Stanković", Nacionalni institut Republike Srbije,

Univerzitet u Beogradu, Bulevar Despota Stefana 142, 11060 Beograd, Srbija

Prepisku uputiti Aleksandri Uskoković; auskokovic@ibiss.bg.ac.rs

Primljeno 4. novembra 2020.; Revidirano 19. februara 2021.; Prihvaćeno 27. februara 2021.; Objavljeno 12. marta 2021

Akademski urednik: Alin Ciobica

Copyright © 2021 Nevena Grdović i dr. Ovo je članak otvorenog pristupa distribuiran pod licencom Creative Commons Attribution, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju pod uvjetom da je originalno djelo pravilno citirano.

Dostupnost podataka

Svi relevantni podaci koji se koriste kao podrška nalazima ove studije uključeni su u članak.

Sukobi interesa

Autori izjavljuju da ne postoji sukob interesa u vezi sa objavljivanjem ovog rada.

Prilozi autora

Koncepcija i dizajn eksperimenata: MM, NG, AU; Rukovanje životinjama i tretmani: MĐ, JAJ, AU, SD; Urađena histološka analiza, imunobojenje i kvantifikacija rezultata: JAJ, MĐ, ST. Obavljena Western blot analiza: AU, SD, NG; Izvodili RTqPCR eksperimente: JR, MĐ; Izvodili eksperimente metilacije DNK: JR, AT, MV; Statistička analiza: NG; Interpretacija podataka i priprema slika: NG, MM; Napisao rad: NG, AU; Kritička revizija rukopisa: MV, SD. Svi autori su odobrili konačnu verziju za objavljivanje.

Priznanja

Ovaj rad je podržalo Ministarstvo prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (Grant br. 451-03-9/2021-14/200007).

Dopunski materijali

Dodatna tabela S1: Sekvence prajmera koji se koriste za kvantitativnu PCR analizu u realnom vremenu Col4a1 (kolagen tip IV alfa 1 lanac), Dnmt1 (DNK metiltransferaza 1), Dnmt3a (DNK metiltransferaza 3 alfa), Dnmt3b (DNK metiltatransferaza 1 metiltatransferaza) (Tet metilcitozin dioksigenaza 1) i ekspresija gena Actb (Actin, beta). Dodatna tabela S2: Sekvence prajmera za MSP analizu metilacije DNK promotorske regije gena Col4a1. Dodatna slika S1: Reprezentativne slike imunoblotinga. Nivoi proteina TGF- 1 (A) i SMA (B), dva proteina povezana s fibrozom, u bubrezima liječenih ili neliječenih ALA, kontrolnih i dijabetičkih štakora, 4 i 8 sedmica nakon indukcije dijabetesa, određen Western blot analiza. (Dopunski materijali)

Reference

[1]RC Atkins, "Epidemiologija hronične bolesti bubrega", Kidney International. Dodatak, knj. 67, str. S14–S18, 2005.

[2]AB Oyenihi, AO Ayeleso, E. Mukwevho i B. Masala, "Antioksidantske strategije u liječenju dijabetičke neuropatije", BioMed Research International, vol. 2015, ID članka 515042, 15 strana, 2015.

[3]M. Lv, Z. Chen, GY Hu i QB Li, "Terapeutske strategije dijabetičke nefropatije: nedavni napredak i buduće perspektive", Drug Discovery Today, vol. 20, br. 3, str. 332–346, 2015.

[4]A. Karihaloo, "Terapija protiv fibroze i dijabetička nefropatija," Current Diabetes Reports, vol. 12, br. 4, str. 414–422, 2012.

[5]S. Yamagishi i T. Matsui, "Napredni krajnji proizvodi glikacije, oksidativni stres i dijabetička nefropatija," Oksidativna medicina i ćelijska dugovječnost, vol. 3, br. 2, str. 414–108, 2010.

[6]F. Genovese, AA Manresa, DJ Leeming, MA Karsdal, i P. Boor, "Ekstracelularni matriks u bubregu: izvor novih neinvazivnih biomarkera bubrežne fibroze?", Fibrogenesis & Tissue Repair, vol. 7, br. 1, str. 4, 2014.

[7]S. Chen, SW Hong, MC Iglesias-dela Cruz, M. Isono, A. Casaretto, i FN Ziyadeh, "Ključna uloga transformirajućeg faktora rasta-beta sistema u patogenezi dijabetičke nefropatije", Renal Failure, vol. 23, str. 471–481, 2001.

[8]BB Hoffman, K. Sharma, Y. Zhu, i FN Ziyadeh, "Transkripcijska aktivacija transformirajućeg faktora rasta- 1 u kulturi mezangijalnih ćelija visokom koncentracijom glukoze," Kidney International, vol. 54, br. 4, str. 1107–1116, 1998.

[9]M. Gonzalez-Ramos, S. de Frutos, M. Griera, et al., "Integrin-vezana kinaza posreduje u regulaciji transformacionog faktora rasta zavisnog od vodonik peroksida- 1", Free Radical Biology & Medicine, vol. 61, str. 416–427, 2013.

[10]K. Sharma i TA McGowan, "TGF- u dijabetičkoj bubrežnoj bolesti: uloga novih signalnih puteva," Cytokine & Growth Factor Reviews, vol. 11, br. 1-2, str. 115–123, 2000.

[11]FJ Lopez-Hernandez i JM Lopez-Novoa, "Uloga TGF-a u hroničnoj bubrežnoj bolesti: integracija tubularnih, glomerularnih i vaskularnih efekata", Istraživanje ćelija i tkiva, vol. 347, br. 1, str. 141–154, 2012.

[12]PD Yurchenco i JJ O'Rear, "Basal lamina Assembly," Current Opinion in Cell Biology, vol. 6, br. 5, str. 674–681, 1994.

[13]A. Nerlich i E. Schleicher, "Imunohistohemijska lokalizacija komponenti ekstracelularnog matriksa u ljudskim dijabetičkim glomerularnim lezijama," The American Journal of Pathology, vol. 139, br. 4, str. 889–899, 1991.

[14]RM Mason i NA Wahab, "Metabolizam ekstracelularnog matriksa u dijabetičkoj nefropatiji," Journal of the American Society of Nephrology, vol. 14, br. 5, str. 1358–1373, 2003.

[15] RE Gilbert, A. Cox, LL Wu et al., "Ekspresija transformirajućeg faktora rasta-beta 1 i kolagena tipa IV u bubrežnom tubulointersticijumu kod eksperimentalnog dijabetesa - efekti ACE inhibicije," Diabetes, vol. 47, br. 3, str. 414–422, 1998.

[16]MS Razzaque, T. Koji, Y. Horita, et al., "Sinteza kolagena tipa III i kolagena tipa IV od strane tubularnih epitelnih ćelija u dijabetičkoj nefropatiji", Patologija, istraživanje i praksa, vol. 191, br. 11, str. 1099–1104, 1995.

[17]JP Grande, DC Melder, DL Kluge i ED Wieben, "Struktura promotora kolagena IV štakora", Biochimica et Bio-Physica Acta, vol. 1309, br. 1-2, str. 85–88, 1996.

[18]E. Verdura, D. Hervé, F. Bergametti, et al., "Poremećaj miR-29 veznog mjesta što dovodi do regulacije COL4A1 uzrokuje pontinsku autozomno dominantnu mikroangiopatiju sa leukoencefalopatijom," Annals of Neurology, vol. 80, br. 5, str. 741–753, 2016.

[19]M. Griffiths, M. Van Sinderen, K. Rainczuk i E. Dimitriadis, "prekomerna ekspresija miR-29c i smanjenje COL4A1 u neplodnom ljudskom endometriju smanjuje adhezivni kapacitet epitelnih ćelija endometrijuma _in vitro_ implicirajući uloge u prijemčivosti“, Scientific Reports, vol. 9, br. 1, str. 8644, 2019.

[20]A. El Taghdouini, AL Sørensen, AH Reiner, et al., "Genomska analiza metilacije DNK i obrazaca ekspresije gena u pročišćenim, nekulturnim ćelijama ljudske jetre i aktiviranim zvezdastim ćelijama jetre", Oncotarget, vol. 6, br. 29, str. 26729–26745, 2015.