Lipidomics otkriva promjene bubrežnih lipida uzrokovane cisplatinom tijekom akutne ozljede bubrega i njihovo slabljenje cilastatinom
Feb 21, 2022
sažetak: Nefrotoksičnost je glavna komplikacija kemoterapije zasnovane na cisplatinu, što dovodi do akutnepovreda bubregau ca. 30 posto pacijenata, bez preventivnih intervencija ili tretmana dostupnih za kliničku upotrebu. Cilastatin je pokazao nefroprotektivni učinak za terapije cisplatinom u in vitro i in vivo modelima, nakon što je nedavno ušao u klinička ispitivanja. Dublje razumijevanje na molekularnom nivou induciranog cisplatinomoštećenje bubregaa učinak potencijalnih zaštitnih agenasa mogao bi biti ključan za razvoj uspješnih nefroprotektivnih terapija i uspostavljanje novih biomarkeraoštećenje bubregainefroprotekcija. Pristup ciljane lipidomije, korištenjem LC-MS/MS, korišten je za kvantifikaciju 108 vrsta lipida (koje sadrže fosfolipide, sfingolipide i slobodni i esterificirani kolesterol) ububregekstrakti korteksa i medule pacova tretiranih cisplatinom i/ili cilastatinom. Utvrđeno je da su do 56 i 63 vrste lipida promijenjene u korteksu i meduli nakon tretmana cisplatinom. Istodobno liječenje cilastatinom ublažilo je mnoge od ovih promjena lipida, bilo potpuno ili djelimično u odnosu na kontrolne nivoe. Multivarijantna analiza je otkrila da se lipidne vrste mogu koristiti za razlikovanjeoštećenje bubregainefroprotekcija, pri čemu su estri holesterola najodlučnija vrsta, zajedno sa sulfatima i fosfolipidima. Potencijalni dijagnostički biomarkeri izazvani cisplatinom oštećenje bubregai cilastatinnefroprotekcijatakođe su pronađeni.
Ključne riječi:lipidomika; cisplatin; akutna povreda bubrega; cilastatin; nefroprotekcija; biomarkeri; esteri holesterola; sfingolipidi; fosfolipidi; hemoterapije
Uvod Nefrotoksičnost je ozbiljna nuspojava kemoterapije cisplatinom [1], sa akutnimpovreda bubrega(AKI) razvija se ca. 30 posto liječenih pacijenata [2]. Ovo je također glavni faktor koji ograničava dozu i važan nedostatak terapija zasnovanih na cisplatinu, jednog od najrelevantnijih tretmana za solidne tumore [2]. Cisplatin se akumulira i uzrokuje ozljedebubrežniepitelne ćelije proksimalnih tubula (RPTEC), a oštećenje se posebno nalazi u segmentu S3 proksimalnog tubula, koji se spušta odbubrežnikorteksa prema kortikomedularnom spoju i vanjskoj meduli [3]. Međutim, sugerirano je i direktno oštećenje medularne Henleove petlje [4,5]. Niz ćelijskih događaja se dešava u vezi sabubrežniozljeda stanica tubula, nakon uzimanja cisplatina, uključujući oksidativni stres, nitrozativni stres, vaskularnu ozljedu, upalu, oštećenje mitohondrija ili inhibiciju Na plus, K plus - ATPaze u ćelijskoj membrani i stres endoplazmatskog retikuluma, nakon čega slijedi proksimalna smrt glavnog tubula apoptozu (i koja uključuje unutrašnje i vanjske puteve) ili nekrozu, što dovodi do gubitkabubrežna funkcija[2,6,7]. Ovo se manifestuje smanjenjem brzine glomerularne fifiltracije (GFR) i nivoa magnezijuma i kalijuma u serumu, uz povećanje azota uree u krvi (BUN) i serumskog kreatinina [2].
Istraženi su različiti pristupinefroprotekcijatokom terapije cisplatinom i in vitro i in vivo, na osnovu brojnih molekularnih ciljeva [7–9]. Međutim, mogući poremećaj citotoksičnog efekta cisplatina na tumorske ćelije i često nepotpuni zaštitni efekat ograničili su razvoj renoprotektora [9]. Kao rezultat toga, ne postoji intervencija za kliničku upotrebu koja uspješno sprječava ili liječi AKI izazvanu cisplatinom [7]. Dublje razumijevanje molekularnih puteva povezanih s AKI izazvanim cisplatinom i potencijalnim ciljevima zanefroprotekcijačini se ključnim u tom pogledu.
Cilastatin je dokazano djelotvorno štitibubregod oštećenja uzrokovanih nekoliko agenasa, uključujući cisplatin [10,11], gentamicin [12], vankomicin [13], ciklosporin A i takrolimus [14], u in vitro i in vivo modelima. Cilastatin ispoljava svoj zaštitni efekat selektivnim inhibiranjembubrežnidehidropeptidaza I (DHP-I) koja se nalazi u lipidnim splavovima na rubu četkice RPTEC-a [11]. Kao rezultat toga, procesi koji uključuju eksternalizaciju membrane kao što je ekstrinzična apoptoza posredovana Fas-om su oštećeni cilastatinom, a progresijaoštećenje bubreganakon što je toksična uvreda zadržana [11]. Osim vanjskog oštećenja apoptoze cilastatinom, utvrđeno je da su smanjeni oksidativni stres, upala i akumulacija nefrotoksičnih spojeva [10–13,15,16]. dakle,bubrežna funkcijaostaju sačuvani pri zajedničkom tretmanu cisplatinom i cilastatinom [11]. Nedavno je cilastatin uspješno završio klinička ispitivanja faze I za njegovu upotrebu kao nefroprotektora i uskoro će ući u fazu II ispitivanja. Obećavajuća nedavna studija je također otkrila da cilastatin (primijenjen kao imipenem plus cilastatin) može postići renoprotektivni efekat kod pacijenata sa peritonealnom karcinomatozom tokom hipertermične intraperitonealne terapije cisplatinom [17].
Poslednjih godina, tehnologije omike, posebno proteomika [18,19] i metabolomika [20-23], pokazale su se korisnim za otkrivanje novih ranih dijagnostičkih biomarkera AKI, osim BUN-a ili kreatinina u serumu [18,20]. Osim toga, metabolomska analiza može pružiti vrijedne informacije za razumijevanje mehanizama nefrotoksičnosti cisplatina [5,24] i terapijskog efekta potencijalnih nefroprotektora [25–27].
Konkretno, lipidomika također može pružiti relevantne informacije o tomebolest bubrega[28], s obzirom na to da lipidi predstavljaju ključne strukturalne, ćelijske signalne i metaboličke uloge, te da se mogu mijenjati u stanicama, tkivima i biofluidima podbubrežnipatološka stanja [29,30]. S tim u vezi, uočeni su povećani nivoi triglicerida i neesterifikovanih masnih kiselinabubregtokom tretmana cisplatinom [31], pored tal neutralnih lipida [32]. Povišeni nivoi sfingolipida—ceramida (Cer) i heksozil ceramida (HexCer)—takođe su uočeni ububrežnikorteksa tokom AKI izazvanog cisplatinom [33]. S druge strane, pronađeno je da su vrste fosfolipida, uključujući fosfatidilholin (PC), fosfatidiletanolamin (PE) i lizofosfatidilholin (LPC) promijenjene ububrežnog tkivaili ćelije tokom tretmana cisplatinom [26]. Utvrđeno je da se nivoi različitih LPC vrsta mijenjaju u serumu pacova nakon primjene cisplatina [23]. Štaviše, masovna spektrometrija koja prikazuje neciljani semi-kvantitativni pristup omogućila je poređenje distribucije lipida kod pacovabubregsekcije i sugerirao da je cis platina dovela do promjena na različitim fosfolipidima (PC, PE, fosfatidilgliceroli (PG), fosfatidilinozitoli (PI), fosfatidilserini (PS), fosfatidne kiseline (PA)), sulfatidi (Sulf) ili kardiolipini [34] (pokazuje različito ponašanje u korteksu i meduli), dok je istovremeni tretman sa cilastatinom imao tendenciju da ublaži neke od ovih promjena [4].
U ovom radu otišli smo korak dalje i pobliže pogledali važne strukturne lipide ububreg, kao što su fosfolipidi (PC, LPC i PE), sfingolipidi (Sulf, sfingomijelini (SM), dihidrosfingomijelini (dhSM), Cer, dihidroceramidi (dhCer), HexCer, dihidroheksozilceramidi (dhHexsterifCer)) i njegov slobodni holesterol oblici (estri holesterola (CE)), koji pokrivaju nove klase i vrste lipida i koriste pouzdaniji ciljani kvantitativni pristup zasnovan na tečnoj hromatografiji u kombinaciji sa tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) analizom. Ukupno 108 vrsta lipida je kvantifikovano na obabubrežniekstrakti korteksa i medule tretiranih pacova, kako bi se bolje razumio nefrotoksični učinak cisplatina i nefroprotektivni učinak cilastatina. Nove informacije o uticaju cisplatina povezanog sa AKI nabubrežnidobivene su vrste lipida i stečeni su dodatni uvidi u zaštitni učinak cilastatina, što je dovelo do slabljenja nekih specifičnih promjena lipida uzrokovanih cisplatinom bilo ububrežnikorteksa ili medule. Različiti potencijalni biomarkeri izazvani cisplatinomoštećenje bubregainefroprotekcijasa cilastatinom su takođe pronađeni.
Rezultati
Cilastatin Protective Effect protiv oštećenja bubrega izazvanog cisplatinom
Procjena odbubrežna funkcijakod pacova tretiranih cisplatinom i/ili cilastatinom prvo je provedeno korištenjem nekoliko biohemijskih indikatora u serumu i urinu. Kao što je prikazano u Tabeli 1, kreatinin u serumu, BUN, proteini u urinu, volumen urina i frakciono izlučivanje natrijuma i kalija su značajno povećani zahvaljujući liječenju cisplatinom u odnosu na kontrolnu grupu, dok je istodobna terapija cilastatinom i cisplatinom dovela do njihovog smanjenja u odnosu na sa nivoima kontrole. S druge strane, GFR je smanjen kod pacova tretiranih cisplatinom u odnosu na kontrolne uzorke, dok je istovremena primjena cilastatina umanjila ovaj efekat. Ovi rezultati potvrđujuoštećenje bubregainduciran cisplatinom i zaštita cilastatinom. Cilastatin sam nije pokazao nikakav učinak nabubrežna funkcijaparametri.
Histopatološka analiza je također urađena u hematoksilinom/eozinom obojenim rezovima radi proučavanja morfoloških promjena u vezi saoštećenje bubrega. Slika 1 prikazuje znakove oštećenja proksimalnog dijela uzrokovane cisplatinombubrežnitubule, uključujući oticanje tubula, odvajanje staničnih ostataka ili gubitak membrane četkice (Slika 1C,G,I). Akumulacija proteinskih gipsa takođe je uočena u tubulima korteksa i medule (Slika 1C, G, respektivno). Ovo je u suprotnosti sa normalnom morfologijom uočenom u kontrolnim ili cilastatinskim grupama u korteksu (Slika 1A, B, respektivno) i meduli (Slike 1E, F, respektivno). Zajedničko liječenje cilastatinom i cisplatinom rezultiralo je jasnim smanjenjem svih ovih cisplatinom induciranih promjena u korteksu i meduli (Slika 1D,H,J).
Cisplatin Alteracija globalnih klasa bubrežnih lipida u korteksu i meduli. Zaštitni efekat Cilastatina
Ukupni nivoi različitih klasa lipida, uključujući sterole (CE, FC), fosfolipide (LPC, PC, PE) i sfingolipide (Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, Sulf, SM, dhSM) su određeni ububrežnikorteksa i medule, kako bi se procenio globalni efekat cisplatina na lipide tokom AKI. Kompletni rezultati analize lipida nalaze se u Tabeli S1. Kao što se može vidjeti na slici 2A,B, prilično slični trendovi uočeni su u korteksu i meduli za sve grupe. CE i Cer su značajno povećani, dok su SM, dhSM i PE smanjeni, kako u korteksu tako iu meduli tokom tretmana cisplatinom, u odnosu na kontrolne grupe. Među njima, Cer i CE trpe najistaknutije uočene promjene izazvane cisplatinom. Štaviše, dhCer i HexCer su značajno povećani u meduli, dok je u korteksu povećan dhHexCer, a smanjeni LPC i Sulf tokom liječenja cisplatinom.
Slika 1. Histopatološka analiza obojenih hematoksilinom/eozinombubrežniodeljci prikazuje zaštitu cilastatina od oštećenja izazvanih cisplatinom. Slike su prikazane sa 20x uvećanjem za (A) kontrolni korteks; (B) cilastatin korteks; (C) cisplatin korteks; (D) cisplatin plus cilastatin korteks; (E) kontrolna medula; (F) cilastatin medulla; (G) cisplatin medula; i (H) cisplatin plus cilastatin medula. Skala od A do H predstavlja 100 µm. Detaljne slikebubrežnitubuli pri 60x uvećanju su prikazani za (I) cisplatin i (J) cisplatin plus cilastatin. Skala za I i J predstavlja 25 µm.Renalindikatori oštećenja su predstavljeni: →: nakupljanje proteinskih naslaga ububrežnitubule. & regija: oticanje tubula. *: gubitak membrane ivice četkice. #: odvajanje ćelijskih ostataka.
Istodobna primjena cilastatina i cisplatina imala je tendenciju da ublaži neke od ovih promjena lipida izazvanih cisplatinom, što je rezultiralo bez razlike u odnosu na kontrolne grupe u slučaju nivoa Cer i dhHexCer u korteksu, ili dhCer, HexCer, SM, dhSM i PE nivoa u meduli. Nadalje, u slučaju povećanja CE u korteksu izazvanog cisplatinom, cilastatin primijenjen zajedno sa cisplatinom doveo je do značajno sniženih nivoa u poređenju sa grupom koja je primala cisplatin, iako je oporavak bio djelomičan u odnosu na koiatrolne grupe. Ostatak lipidnih klasa izmijenjenih cisplatinom ostao je neoporavljen tokom zajedničkog liječenja cilastatisi. S druge strane, sam cilastatin nije imao efekta na lipikt korteksa i medule, osim na LPC i dhCer u korteksu, koji su izgledali smanjeni, odnosno povećani u poređenju sa kontrolnom grupom. Ukupni nivoi FC, PC i dhHexCer nisu pokazali značajnu promjenu u korteksu i meduli nakon tretmana cisplatinom.
Slika 2C,D prikazuje korelacione toplotne karte za klase lipida u korteksu i meduli, respektivno, nudeći slične trendove.
Individualna alitracija bubrežnih lipida tretmanom cisplatinom. Cilastatin Attenuating Egect
Cholestesol EstersAnaliza pet pojedinačnih vrsta CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 i CE 22:6) sprovedena ububrežnikorteks i medula otkrili su da je cisplatin značajno povećao svaki od njih u poređenju sa kontrolnim nivoima (Slika 3). S druge strane, istodobna primjena cilastatina i cisplatina dovela je do općeg smanjenja nivoa pojedinačnih CE vrsta u odnosu na liječenje cisplatinom, što je bilo statistički značajno za sve vrste CE u korteksu i CE 18:2 u meduli, kako se može vidi se na slici 3. Ovaj oporavak u korteks CE vrstama zbog cilastatina je bio djelimičan u poređenju sa nivoima kontrolne grupe, dok nije uočen statistički značajan oporavak kod većine vrsta medella CE (osim CE 18:2) za istodobnu primjenu cilastatina u poređenju sa cisplatinom. Kompletni rezultati statističke analize lipida korteksa i medule prikazani su u tabelama S2 i S3, respektivno.
Sfingolipidi: Cer, dhCer, HexCer, dhHexCer, SM, dhSM i SulfUkupno 43 vrste sfingolipida su kvantificiranebubrežnikorteksa i medule kako bi se procijenio uticaj tretmana cisplatinom i cilastatinom na njihove nivoe, kao što je prikazano na slici 4. Što se tiče vrsta Cer (slika 4A), dhCer (slika 4B), HexCer (slika 4C) i dhHexCer (slika 4D), kao može se vidjeti, tretman cisplatinom je rezultirao značajnim porastom kod 19 vrsta iz ee četiri klase ububrežnikorteksa i medule. Opet, istovremeni tretman cisplatinom i cilastatinom pokazuje tendenciju ublažavanja efekta cisplatina, uz generalno smanjenje nivoa lipida promijenjenog cisplatinom u korteksu i meduli. Zapravo, za vrste dhCer (Slika 4B) i dhHexCer (Slika 4D) nije uočena razlika između grupa tretiranih cisplatinom plus cilastatinom i kontrolnih grupa za te vrste izmijenjene cisplatinom, što ukazuje na potpuni oporavak. U slučaju Cera (Slika 4A) i HexCer-a (Slika 4C), ovaj recoeery je također bio slučaj za neke izmijenjene vrste, kao što su HexCer 34:1 (korteks i medula) i HexCer 38:1 i HexCer 42:1 (medula ); Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 i Cer 42:2 u korteksu; i Cer 34:1 i Cer 42:2 u meduli, koji su potpuno ili djelimično obnovljeni. Suprotno tome, tretman cisplatinom i cilastatinom je i dalje pokazao značajne razlike u odnosu na kontrolne grupe za Cer 36:1, Cer 38:1, Cer 40:1, Cer 42:1 i HexCer 36:1 u meduli, bez oporavka, ukazujući na mnogo bolji efekat oporavka koji cilastatin ostvaruje u korteksu nego u meduli za Cer i HexCer.
U slučaju SM (Slika 4E) i dhSMt (Slika 4F) vrsta, cisplatin je doveo do smanjenja korteksa i medule kod najkraćih i najdužih lanaca, što je bilo statistički značajno za SM 34:1, dhSM 34:{{ 5}}, SM 42:2, SM 42:1 i dhSM 42:1. Za razliku od toga, efekat uočen za tretman cisplatinom na srednjelančane SM i dhSM vrste u korteksu i meduli bio je povećanje, što je bilo statistički značajno za dhSM 36:0 (i u korteksu i meduli) i dhSM 4{{ 15}}:0, SM 36:1, SM 38:1 i SM 40:1 u meduli. Istodobna primjena cisplatina i cilastatina imala je tendenciju normalizacije nivoa SM i dhSM vrsta u mnogim slučajevima, sa SM 34:1, SM 36:1, SM 38:1, SM 40:1, SM 42:2, SM 42:1, dhSM 36:0, dhSM 40:0 i dhSM 42:1 ne pokazujući nikakvu razliku u odnosu na kontrolne grupe u meduli. Konačno, neke vrste Sulf su također izmijenjene tretmanom cisplatinom ububrežnikorteksa i medule, kao što je prikazano na slici 4G. Dok je otkriveno da je Sulf 40:1 značajno povećan i u korteksu i u meduli nakon tretmana cisplatinom, druge vrste kao što su Sulf-OH 40:1 ili dugolančani Sulf-OH 42:2, Sulf-OH 42:2 su smanjeni u korteksu, pri čemu su Sulf 42:0 i Sulf-OH 42:1 takođe smanjeni u korteksu i meduli. Cilastatin istovremeno sa cisplatinom doveo je do blagog efekta oporavka, posebno za Sulf 40:1 (korteks i medula) i Sulf 40:2 i Sulf-OH 42:1 (medula), ne pokazujući razliku u poređenju sa kontrolnim grupama.
Fosfolipidi: PC, PE i LPCKvantifikacija 60 vrsta fosfolipida (28 PC, 20 PE i 12 LPC) izvršena je ububrežnikorteksa i medule za procjenu potencijalnih promjena uzrokovanih cisplatinom i renoprotektivnog efekta cilastatina. Rezultati za PC vrste prikazani su na slici 5A,B, respektivno. Kao što se može vidjeti, cisplatin je značajno izmijenio do 19 PC vrsta u korteksu ili meduli. Većina ovih PC vrsta je smanjena cisplatinom, sa izuzetkom PC 40:2, PC 40:4 i PC 34:2, koji su povećani u korteksu. Frakcija visoko neaturiranih PC vrsta značajno je smanjena i u meduli i u korteksu, dok je udio vrsta koje sadrže dvije dvostruke veze značajno povećan, kao što se može vidjeti na slici 5C,D. Tretman i cisplatinom i cilast atinom pokazao je slične efekte kao i ranije uočene, uz uočeno izvjesno slabljenje, u nekim slučajevima dovodeći do potpunog oporavka nivoa PCB, bez značajnih razlika u odnosu na kontrolnu grupu, ili do djelomičnog oporavka. Ovaj oporavak je uglavnom uočen u Rezultati za određivanje PE vrsta u korteksu i meduli prikazani su na slici 6A,B, respektivno. Ukupno 16 PE vrsta je značajno izmijenjeno cisplatinom u korteksu ili meduli, s najvećim brojem izmijenjenih vrsta pronađenim u meduli. U većini slučajeva, PE vrste su smanjene tretmanom cisplatinom, osim PE 38:2, PE 40:6 i PE 40:4, koji su povećani ili u korteksu, meduli, ili u korteksu i meduli, respektivno. Shodno tome, s obzirom na ukupnu dužinu lanaca masnih kiselina u PE vrsti u meduli, ukupna količina PE sa 34, 36 i 38 C je značajno smanjena sa cisplatinom, dok su vrste od 40 C povećane, kao što je prikazano na slici 6C. . Istodobno liječenje cilastatinom i cisplatinom ublažilo je većinu promjena izazvanih cisplatinom u pojedinačnim vrstama PE pronađenih u meduli, nudeći nivoe bez značajnih razlika u poređenju sa kontrolnim grupama u 11 od 15 vrsta u meduli koje su promijenjene cisplatinom, sa još 2 vrste PE djelimično oporavljena. Međutim, u korteksu, samo 2 od 11 vrsta izmijenjenih cisplatinom su pronađene cilastatinom do kontrolne razine, a 2 dodatne PE vrste su djelimično obnovljene. Slično zapažanjima za PC vrste, udio visoko nezasićenih PE vrsta je značajno smanjen u meduli, dok je udio vrsta koje sadrže 1-3 dvostruke veze značajno povećan, kao što je prikazano na slici 6D.
Što se tiče analize LPC vrsta, većina uočenih promjena izazvanih cisplatinom pronađena je ububrežnikorteksa, gde su LPC 16:1, LPC 16:0, LPC 18:1, LPC 18:0 , LPC 20:3, LPC 22:6 i LPC 22:5 značajno smanjeni sa u odnosu na kontrolne uzorke, kao što se može vidjeti na slici 7A. S druge strane, otkriveno je da su LPC 17:1 i LPC 18:2 povećani u meduli tokom tretmana cisplatinom (slika 7B). Istodobno liječenje cisplatinom i cilastatinom nije imalo učinak oporavka na LPC vrste korteksa. Nasuprot tome, LPC 17:1 i LPC 18:2 pronađeni su u meduli, bez značajnih razlika u poređenju sa kontrolnim uzorcima.
Bubrežni lipidi kao klasifikacione varijable zaOštećenje bubregai Zaštita
Multivarijantna analiza je izvršena korištenjem svih varijabli lipida izmjerenih u korteksu i meduli kako bi se procijenilo da li ove vrste mogu poslužiti za grupnu klasifikaciju i razlučivanje uzrokovano cisplatinom.oštećenje bubregainefroprotekcijaod strane cilastatina. Analiza glavnih komponenti (PCA) i ortogonalne projekcije na analizu diskriminacije latentnih struktura (OPLS-DA) provedene su korištenjem odvojeno lipida korteksa ili medule, kao što je prikazano na slici 8. PCA analiza korteksa (slika 8A) i medule (slika 8B) lipidi su modelima ponudili mogućnost da pokažu jasno razdvajanje grupe cisplatina u odnosu na kontrolnu i cilastatinsku grupu, pri čemu se posljednje dvije usko grupišu. S druge strane, grupa tretirana cisplatinom plus cilastatinom imala je tendenciju da se odvoji od grupe cisplatina i nalazi se između kontrolne i cisplatinske grupe, što ukazuje na razlike između grupa. Svi PCA modeli su predstavili R2 veće od 0.7 i Q2 vrijednosti veće od 0.5.
Višegrupna OPLS-DA analiza je takođe pokazala jasno odvojeno grupisanje različitih grupa koristeći varijable lipida u korteksu (slika 8C) ili meduli (slika 8D). OPLS-DA modeli su prikazali prihvatljive Q2 vrijednosti i R2 vrijednosti veće od 0.7 i pokazali su se validnim tokom permutacijskog testiranja za 100 iteracija, kao što je prikazano na slici 8E,F. Karakteristike s promjenjivom važnosti u projekcijama (VIP) skorima višim od 1 mogu se naći na slici 8G,H, što ukazuje na lipide korteksa ili medule, koji imaju veći utjecaj na razdvajanje grupa. Oni su uključivali različite vrste lipida iz klasa CE, sfingolipida i fosfolipida. Odrediti specifične razlike u lipidima između pojedinih grupa koje se odnose na liječenje cisplatinom inefroprotekcija, dalja OPLS-DA analiza je izvršena odvojeno sa lipidima korteksa i medule, kao što se može vidjeti na slikama 9 i 10, respektivno. OPLS-DA modeli su napravljeni za cisplatin u poređenju sa kontrolnom grupom, cisplatin plus cilastatin u poređenju sa cisplatinom, kao i cisplatin plus cilastatin u poređenju sa kontrolnom grupom. Najdiskriminantniji OPLS-DA modeli bili su oni između kontrolnih i grupa koje su bile tretirane cisplatinom ili cisplatinom plus cilastatinom, s obzirom na njihove najveće vrijednosti R2 i Q2, uz odgovarajuću validaciju zasnovanu na rezultatima testa permutacije sa 100 ciklusa (Slika 9A,B,D, E i slika 10A,B,D,E).
S druge strane, OPLS-DA modeli za grupe cisplatina plus cilastatina i cisplatina, koji koriste lipide korteksa (slika 9C) ili medule (slika 10C), također su dozvoljavali grupnu diskriminaciju, sa razumnim vrijednostima R2 i Q2 i odgovarajući rezultati validacije iz testova permutacije ciklusa 100- (Slike 9F i 10F), pri čemu su lipidi medule oni koji predstavljaju bolju predvidljivost. S-grafovi za različite OPLS-DA modele uključeni su na Slici 9G,H,I i Slici 10G,H,I, za karakteristike lipida korteksa ili medule. Vrste sa |p(corr)| viši od 0,5 i VIP rezultati veći od 1 označeni su u S-grafovima kao najrelevantnije karakteristike za grupnu diskriminaciju. Kompletni podaci uključujući p(corr) i VIP vrijednosti iz OPLS-DA modela, zajedno sa univarijantnom statistikom za svaku vrstu lipida, mogu se naći u dopunskim tabelama S2 (lipidi korteksa) i S3 (lipidi medule). Čini se da je to jasnobubrežnilipidi korteksa i medule mogu poslužiti kao diskriminirajući kriteriji za cisplatin induciraneoštećenje bubregai za cilastatinnefroprotekcijatokom lečenja cisplatinom.
Bubrežni lipidi kao potencijalni biomarkeri bubrežnog oštećenja izazvanog cisplatinom Kako bi se odabrali potencijalni lipidni biomarkeri oštećenja bubrega
uzrokovano cisplatinom, korišćena je kombinacija više kriterijuma statistički značajnih p-vrednosti iz univarijantne analize cisplatina u odnosu na kontrolne grupe, kao i p(corr) i VIP vrednosti pronađenih u odgovarajućem OPLS-DA modelu. Odabrani lipidi sa p-vrijednostima < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(ispravka)|=""> 0,5 i VIP > 1 mogu se naći u tabeli 2 (lipidi korteksa) i tabeli 3 (lipidi medule), gde su takođe uključene promene nabora (FC) i površine ispod krive (AUC) za krive operativnih karakteristika prijemnika (ROC).
Kao što se može vidjeti, do 40 lipida iz medule i 27 lipida iz korteksa, uključujući CE, sfingolipide i fosfolipidne vrste, odabrano je u tabelama 2 i 3, respektivno. AUC vrijednosti za ROC krivulje dobijene za svaki lipid bile su veće od 0.85 i, u većini slučajeva, blizu 1, što ukazuje na dobru sposobnost razlikovanja vrste između cisplatina i kontrolnih grupa. Izvanredno, CE vrste sa povećanom cisplatinom (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 i CE 22:6) izgledaju najdiskriminatornije karakteristike i u meduli i u korteksu, pokazujući najviše vrijednosti FC, VIP, p(corr) i AUC. dhHexCer 34:0 je još jedan povećani lipid u korteksu sa visokim FC i relevantnim rezultatima. S druge strane, sulfatidi kao što su Sulf 42:0, Sulf-OH 40:1 ili Sulf-OH 42:1 su takođe prilično relevantni u korteksu, dok PE 36:5, PE 38:6, PE 38:5 PC 36:5 ili PC 36:6 su takođe veoma važni u meduli, a svi se smanjuju tokom lečenja cisplatinom.
Bubrežni lipidi kao potencijalni biomarkeri cilastatinske nefroprotekcije
Za odabir potencijalnih lipidnih biomarkera zaštite cilastatina od nefrotoksičnosti cisplatina, primijenjen je isti pristup višestrukim kriterijima kao u Odjeljku 2.5 korištenjem univarijantne analize cisplatina plus cilastatina u odnosu na grupe cisplatina, i p(corr) i VIP vrijednosti pronađene u odgovarajućim OPLS- DA model. Odabrani lipidi sa p-vrijednostima < 0.05;="" fdr="">< 0.1;="" |p(ispravka)|=""> 0,5, a VIP > 1 može se naći u tabeli 4 (lipidi korteksa) i tabeli 5 (lipidi medule), gde su takođe izračunati FC i AUC za ROC krive.
Kao što se može vidjeti u tabeli 4, sve vrste CE (CE 18:1, CE 18:2, CE 18:0, CE 20:4 i CE 22:6) u korteks se može smatrati najmoćnijim indikatorom zaštite koju pruža cilastatin, značajno smanjujući, u isto vrijeme, promjene izazvane cisplatinom. PE 36:5 i dhHexCer 34:0 u korteksu su također važni potencijalni biomarkeri zaštite cilastatina, posebno potonjeg, koji se podvrgava potpunom oporavku zahvaljujući cilastatinu prema kontrolnim nivoima. Što se tiče lipida medule, kao što je prikazano u tabeli 5, pronađena je veća količina potencijalnih biomarkera zaštite cilastatina nego u korteksu. Značajno je da je Sulf 40:2 najdiskriminatornija vrsta u meduli, s obzirom na njene najviše FC i VIP rezultate. Pronađene su i različite vrste PC i PE, uključujući PE 36:5, PE 38:5, PE 38:6, PE 36:4, PE 34:3 i PC 36:6, da spomenemo samo neke, pored Cer 42:2, dhHexCer 36:0 i HexCer 34:1, kao značajni biomarkeri zaštite cilastatina u meduli. U svim slučajevima, ovi lipidi su bili povezani ili sa djelomičnim ili potpunim cilastatinom indukovanim oporavkom kontrolnih nivoa u poređenju sa njihovim izmijenjenim nivoima cisplatinom. Za sve vrste, AUC vrijednosti za ROC krivulje su bile veće od 0,85, što dokazuje njihovu dobru sposobnost diskriminacije
DiskusijaU ovom radu kvantificirali smo ukupno 108 vrsta lipida koje sadrže važne strukturne lipide kao što su fosfolipidi, sfingolipidi i holesterol zajedno sa njegovim esterifikovanim oblicima, nabubregkorteksa i medule pacova tretiranih cisplatinom i/ili cilastatinom. Ovo je urađeno kako bi se bolje razumio nefrotoksični učinak cisplatina i zaštitni učinak cilastatina. Utvrđeno je da su do 63 vrste lipida bile značajno izmijenjene u meduli tretmanom cisplatinom, dok je 56 vrsta lipida zahvaćeno u korteksu, reflektirajućioštećenje bubregau oba regiona. Iako se, tradicionalno, većina studija AKI izazvanih cisplatinom fokusira na ćelije proksimalnih tubula ibubrežnioštećenje korteksa, gdje je akumulacija lijeka uglavnom fokusirana, nedavne studije ukazuju na činjenicu da ozljeda u meduli može biti čak ozbiljna kao i u korteksu, na osnovu TUNEL testova apoptoze [5]. Ovo bi moglo biti povezano sa akumulacijom cisplatina u segmentu S3 proksimalnih tubula [3,5], koji se spušta prema vanjskoj meduli, osim potencijalnog direktnog i sekundarnog oštećenja Henleove petlje [4]. Pored toga, medula je istaknuta kao najosetljivijabubrežnipodručje za promatranje globalnih promjena metabolita povezanih s cisplatinom u poređenju sa korteksom [5]. Naši prethodni rezultati također su ukazali na direktno oštećenje ćelija medule (osim sekundarnog oštećenja) cisplatinom, što se odražava u različitim fosfolipidnim i kardiolipinskim alteracijama [4]. Ovi novi rezultati proširuju ta opažanja s dodatnim vrstama i klasama lipida koje je promijenio cisplatin i pojačavaju relevantnost oštećenja medule u AKI izazvanom cisplatinom.
Iako je FC inbubregnije značajno izmijenjen tretmanom cisplatinom, i ukupni CE i sve izmjerene pojedinačne vrste CE su značajno povećane i u korteksu (osam puta povećanje za ukupni CE) i u meduli (četvorostruko povećanje za ukupni CE) u vezi s induciranim cisplatinomoštećenje bubrega.Kolesterol je ključna komponenta plazma membrana, koja se nalazi među fosfolipidima i utiče na fluidnost, površinski naboj i interakcije grupa polarnih glava [35,36]. Njegovo prisustvo je takođe fundamentalno u lipidnim splavovima, uspostavljajući hidrofobne interakcije sa SM, i neophodno je za segregaciju molekula i za kontrolu njihove interakcije sa drugim komponentama u membrani [37]. Ćelije održavaju ravnotežu holesterola između de novo sinteze u endoplazmatskom retikulumu (ER) i LDL posredovanog unosa. Većina holesterola se nalazi u plazma membrani, ali se takođe može vratiti u ER gde se FC može pretvoriti (kroz ACAT posredovanu esterifikaciju) u CE, što se smatra citosolnim oblikom skladištenja holesterola [36]. CE se također može hidrolizirati natrag u FC, čineći ciklus estera holesterola [36]. Činjenica da je FC ostao nepromijenjen tokom liječenja cisplatinom, ali je CE povećan i u korteksu i u meduli, sugerira izmijenjenibubrežnimetabolizam holesterola povezan sa AKI izazvanom cisplatinom. Prethodne studije su pokazale prilično slična zapažanja u HK-2 ljudskim ćelijama proksimalnih tubula i u korteksu bubrega kod miševa, tokom akutne ishemijepovreda bubrega, sa nepromijenjenim FC i povećanim nivoima CE [36]. U tom slučaju, povreda plazma membrane, koja je izazvala povećan promet FC sa membrane u ER, izgledala je kao najvjerovatnije objašnjenje, što je rezultiralo eskalacijom CE generacije. U tom smislu, oštećenje lipidnih splavova bogatih holesterolom, a ne plazma membrane, čini se efikasnijim u povećanom prometu holesterola u ER [36]. Citoprotektivna uloga CE je također implicirana u takvim prethodnim studijama. Povećanje nivoa CE je takođe prijavljeno kod pacovabubrežnikorteksa u ranoj fazi dijabetičke nefropatije [29]. Rezultati su također u skladu s globalnim povećanjem neutralnih lipida ububrežniproksimalni tubuli prijavljeni tokom liječenja cisplatinom [32]. Naši rezultati po prvi put ukazuju na globalno povećanje ukupnog CE pored pojedinačnih CE vrsta, kako ububrežnikorteksa i medule, tokom AKI izazvanog cisplatinom. Cilastatin je, s druge strane, malo povećao CE 18:0 i CE 22:6 samo u korteksu, iako su ukupni nivoi FC ili CE bili nepromijenjeni. Ovaj blagi efekat mogao bi biti posledica činjenice da se njegova meta, DHP-I, nalazi u lipidnim splavovima u proksimalnom tubulu (uglavnom u korteksu), a neki mali poremećaj membrane može biti impliciran tokom njegove interakcije. Istodobna primjena cisplatina i cilastatina, s druge strane, dovela je do smanjenja svih vrsta CE povećanih cisplatinom u korteksu, dok u meduli nije uočen gotovo nikakav učinak oporavka, uz samo djelomični oporavak CE18:2 . Ovo ukazuje na specifično djelovanje cilastatina u stanicama proksimalnih tubula, pružajući značajnu zaštitu od širenja ćelijske smrti usljed direktnog oštećenja cisplatina na plazma membrani i lipidnih splavova u korteksu, dok se čini da oštećenje stanica povezano s disbalansom kolesterola u cijeloj meduli. ostati uglavnom nezaštićen.
Sfingolipidi su aktivni lipidi koji se uglavnom nalaze u ćelijskim membranama i prilično su bogati lipidnim splavovima [37]. Ceramidi su centralni metaboliti metabolizma sfingolipida, koji uključuju različite molekule i enzime s važnom ulogom u ćelijskim procesima, uključujući rast stanica, apoptozu, diferencijaciju, otpornost na lijekove i starenje [38,39]. Dodatno, sfingolipidi učestvuju u putevima povezanim sa smrću ćelija raka cisplatina i AKI [33]. Ceramidi se mogu generirati na nekoliko puteva, uključujući de novo sintezu, hidrolizu sfingomijelina ili recikliranje složenih sfingolipida [38]. De novo sinteza je glavni put i odvija se u ER, od palmitoil-CoA i serina, kroz niz enzimskih puteva za proizvodnju sfinganina, koji dovodi do dihidroceramida preko dihidroceramid sintaze (CerS). Konačno, desaturacija dhCer-a stvara Cer [40]. SM se također može hidrolizirati sfingomijelinazama, stvarajući Cer. Cer se može transformisati u složenije sfingolipide u Golgijevom aparatu: fosforiliran da generiše Cer-1-P, signalni molekul; pretvoren u SM djelovanjem SM sintaze; ili glikozilirani da bi se proizveli hesoksilceramidi (glukozil- ili galaktozilceramidi), prekursori sulfatida [38]. Cer se također može razgraditi do sfingozin, prekursora sfingozin{11}}fosfata (S1P), sa važnom ulogom u preživljavanju i proliferaciji ćelija, upali i rezistenciji na lijekove [39]. Konačno, degradacija S1P na etanolamin i heksadecenal je izlazni put ovog puta [38].
Tokom kvantifikacije sfingolipidnih vrsta, uočeno je globalno povećanje ukupnih nivoa Cer, dhCer, HexCer i dhHexCer tokom tretmana cisplatinom, što je posebno bilo relevantno za Cer. Razlike u pogledu kontrolebubregbili su očigledniji kada su pojedinačne podvrste kvantificirane, pri čemu je 19 od 22 vrste povećano bilo u korteksu (11 vrsta) i/ili meduli (18 vrsta) tretmanom s cisplatinom. Ovo je u skladu sa prethodnim zapažanjima koja ukazuju na povećanje Cer i HexCer kod mišabubrežnikorteksa povezanog s liječenjem cisplatinom [33], ali smo ovdje otkrili da je ovim efektom pogođena i medula.
Ova zapažanja mogu odražavati povećanu metaboličku proizvodnju Cer/dhCer i HexCer/dhHexCer. S jedne strane, to bi se moglo dogoditi kroz povećanu aktivnost CerS-a, u svjetlu prethodnih zapažanja ububrežnikorteksa, gdje je mjerena dugolančana aktivnost CerS-a tokom liječenja cisplatinom, a inhibicija CerS-a je dovela do smanjenja uočene akumulacije Cer/HexCer-a [33]. Štaviše, cisplatinom izazvano smanjenje nivoa SM/dhSM pronađenih u korteksu i meduli sugerira dodatno povećanu proizvodnju Cer/dhCer hidrolizom SM/dhSM putem sfingomijelinaznog (SMase) puta [38], s posebnim utjecajem na dugolančani Cer/dhCer, što je sve štetno u modelima AKI [40]. Ovo bi također bilo u skladu s činjenicom da dugolančane vrste Cer izgleda relevantne tokom AKI [40] i s prethodnim zapažanjima povećane aktivnosti SMase ububrežnikorteksa tokom lečenja cisplatinom [33]. Cer je uključen u apoptozu indukovanu cisplatinom putem signalizacije i na unutrašnjim i na ekstrinzičnim putevima [39]. U intrinzičnom mitohondrijskom putu, cisplatin uzrokuje permeabilizaciju vanjske membrane mitohondrija. Povećanje Cera, zajedno sa njegovim nizvodnim metabolitima, može doprinijeti ovoj permeabilizaciji, a formiranje kanala Cerom olakšava apoptozu u mitohondrijalnoj membrani, omogućavajući ulazak Baxa u vanjsku membranu mitohondrija, kao i odljev citokrom C [39]. Nadalje, ekstrinzična apoptoza posredovana Fas-om koristi Fas receptor lociran u lipidnim splavovima, pri čemu je njegovo grupisanje posredovano aktivacijom SMase uzrokovanom cisplatinom i elevacijom Cera [39]. Stoga, Cer određuje apoptozu u AKI izazvanoj cisplatinom, dok se čini da je njihovo nivelisanje putem njihove transformacije u HexCer protektivno [33] i povezano je sa rezistencijom na cisplatin [39]. Cer koji se stvara u velikim količinama također može utjecati na fizička svojstva membrana i može istisnuti kolesterol i pokrenuti njegovu esterifikaciju [35]. S druge strane, SM je uglavnom prisutan u plazma membranama i ima direktnu vezu sa molekulima holesterola, posebno važnim u lipidnim splavovima [41]. Nedostatak regeneracije SM mogao bi biti negativan za pravilnu funkciju membrane [41].
Sulfa ima u izobiljububreg,posebno u apikalnoj membrani distalnih tubula [42]. Iako nisu neophodni za normalnofunkciju bubrega, utvrđeno je da se nedostatak Sulfa nadoknađuje povećanim stvaranjem sulfatiranih glikolipida i holesterola [42]. Sulfatid je ključni ligand L-selektina ububreg,sa vitalnom ulogom u infifiltraciji monocita ububregintersticij [42]. S druge strane, mijelin povezan s lipidnim splavom i protein limfocita (MAL) formira komplekse sa sulfatidima i glikosfingolipidima ububrežnimembrane, doprinoseći stabilizaciji i sortiranju mikrodomena obogaćenih glikosfingolipidima [42]. Naši rezultati o promenama sulfa u korteksu i meduli potvrđuju prethodne studije u kojima se takođe smatralo da su različite vrste sulfata izmenjene cisplatinom u bubregu [34].
Sve vrste Cer, dhCer, HexCer i dhHexCer koje su u korteksu izmijenjene cisplatinom bile su djelomično ili potpuno oporavljene istovremenom primjenom cilastatina, dok u meduli nije pronađena velika količina Cer vrsta, uz gotovo potpuni oporavak dhCer-a. , HexCer i dhHexCer. Uzimajući u obzir uključenost Cer vrsta u Fas posredovanu ekstrinzičnu apoptozu i njeno blokiranje vezivanjem cilastatina za DHP-I u lipidnim splavovima u proksimalnom tubulu, ovo bi moglo objasniti zaštitni efekat i oporavak Cera koji se odvija uglavnom u ćelijama korteksa. Što se tiče SM, dhSM i Sulfa, činilo se da je oporavak cilastatina važniji u meduli nego u korteksu, što sugerira da je sekundarno oštećenje narušeno djelovanjem cilastatina u proksimalnim tubulima koji dopiru do vanjske moždine, gdje većinaoštećenje bubregaje koncentriran [4].
Fosfolipidi su najzastupljenije vrste u ćelijskim membranama, gde dominiraju PC i, u manjoj meri, PE, sa većim prisustvom PC na luminalnoj strani, a PE u većoj količini u citosolnom listiću [35,43]. Lizofosfolipidi su, s druge strane, signalne vrste koje se mogu generirati hidrolizom glicerofosfolipida uključujući LPC [35]. Utvrđeno je da je većina od 60 kvantitificiranih PC, PE i LPC vrsta promijenjena liječenjem cisplatinom, bilo u korteksu ili meduli, pri čemu su PC i LPC predstavljali veći iznos promjena u korteksu, dok su promjene povezane s PE bile brojnije. i istaknut u meduli. Alterations ofbubrežniPC, PE ili LPC vrste kao rezultat tretmana cisplatinom su u skladu s prethodnim prijavljenim zapažanjima ububregtokom AKI [4,5,26,34,44]. Naši rezultati pokazuju da je većina izmijenjenih vrsta PE, PC i LPC smanjena cisplatinom u korteksu i meduli. Što se tiče nefroprotektivnog efekta cilastatina, zapanjujuće je da je veći stepen djelomičnog ili potpunog efekta oporavka uočen u meduli za cisplatin-promijenjene lipide nego u korteksu. Još jedna interesantna činjenica je da su sve one vrste PC, PE i LPC u korteksu i meduli koje su povećane cisplatinom bile oporavljene uz pomoć cilastatina, dok je većina vrsta sa smanjenim nivoom cisplatina u korteksu još uvijek izmijenjena tokom zajedničkog liječenja sa cilastatinom. Ovo bi moglo ukazivati na veći stepen direktnog oštećenja uzrokovanog akumulacijom cisplatina u korteksu, koji ostaje nezaštićen cilastatinom i dovodi do smrti ćelije i povezanog PC, PE (glavne komponente ćelijske membrane) i LPC oslobađanja u apoptotičkim tijelima i, dakle, smanjenje njihovog nivoa. Nasuprot tome, sekundarno oštećenje povezano s vanjskom apoptozom i posljedičnom akumulacijom proteina u proksimalnim tubulima može biti zaštićeno cilastatinom. To bi impliciralo da su se vrste PC, PE i LPC smanjile u meduli i da su više povezane sa sekundarnim oštećenjem ćelija izazvanim cisplatinom. S druge strane, povećane vrste PC, PE i LPC mogu biti povezane ili s regeneracijom ćelijske membrane ili s procesima signalizacije, što bi, prema ovim rezultatima, moglo biti više povezano sa sekundarnom ekstrinzičnom apoptozom uzrokovanom oštećenjem cisplatinom zaštićenim cilastatinom.
Pored toga, cisplatinom indukovano smanjenje procenta PC i PE vrsta sa visoko nezasićenim masnim lancima je takođe uočeno, što se može povezati sa procesima peroksidacije lipida, a smanjilo bi se cilastatinom [4,10,11].
U globalu, unutar lipidnih vrsta koje su ovdje kvantificirane, učinak oporavka cilastatina uočen je u 26 od 56 lipida izmijenjenih cisplatinom u korteksu i u 50 od 63 lipida izmijenjenih cisplatinom u meduli. Možda ovo odražava visok stupanj promjena lipida povezanih sa nezaštićenim direktnim oštećenjem mitohondrija koje cisplatin izaziva uglavnom u korteksu u poređenju sa medulom, s više promjena lipida povezanih sa zaštitom od sekundarnog oštećenja otkrivenih u cijeloj meduli. Štaviše, multivarijantna analiza je omogućila identifikaciju potencijalnih novih lipidnih biomarkera za AKI indukovanu cisplatinom i cilastatinnefroprotekcija, uključujući vrste CE, Sulf, PE, PC, Cer ili HexCer, kao što je opisano u odjeljcima 2.5 i 2.6. Prema našim nalazima, CE 18:2 i PE 36:5 su mogući kandidati za biomarkere koji u isto vrijeme mogu prepoznati oštećenje cisplatina i cilastatina.nefroprotekcijai u korteksu i u meduli. Međutim, kako je oporavak ove dvije vrste cilastatinom djelomičan, prikladnije vrste kao biomarkeri bi bili dhHexCer 34:0 u korteksu i Sulf 42:0 u meduli, koji bi mogli razlikovati obaoštećenje bubregai zaštitu, pri čemu je cilastatin u potpunosti vratio svoje nivoe izmijenjene cisplatinom u odnosu na one u kontrolnoj grupi. Ovo bi se moglo ekstrapolirati na bilo koju povredu bubrega posredovanu Fas/Fas ligandom, ali bi trebalo biti potvrđeno u budućim studijama. Nekoliko novih biomarkera AKI je predloženo posljednjih godina, uglavnom proteini (npr. KIM-1 [45] ili NGAL [46]). Činjenica da smo pronašli potencijalne nove biomarkere AKI izazvanog cisplatinom i pridružene zaštite cilastatina, lipidne prirodebubregtkiva, proširuje postojeće znanje i pruža komplementarne opcije za bolju dijagnozu, prognozu i praćenje. Zapravo, kombinacija detekcije biomarkera može se čak potencijalno koristiti kao indikacija specifičnog AKI uzrokovanog određenim nefrotoksičnim sredstvom (kao što je cisplatin) ili drugim uzrokom, pa čak i razlikovati stanje/progresiju bolesti. Još jedan korak dalje bilo bi utvrđivanje da li su se naši rezultati promijenilibubrežnilipidni obrasci se također odražavaju u cirkulirajućim lipidima u krvi ili u urinu. Ovo bi omogućilo detekciju biomarkera za AKI izazvan cisplatinom i cilastatinnefroprotekcijaizvodljivije kod pacijenata.
Promjene u nivou lipida uzrokovane AKI izazvane cisplatinom su brojne i raznolike, uključujući važne strukturne lipide u kompletnojbubrežnistruktura: korteks i medula. Slabljenje mnogih od ovih promjena cilastatinom pokazuje njegov veliki potencijal za poboljšanjebubrežna funkcijai smanjenje strukturnih promjena povezanih s lipidima, u korelaciji sa normaliziranimbubrežnimorfologija. Opet, cilastatin se pokazao korisnim za uočavanje nezaštićenog direktnog oštećenja stanica uzrokovanog cisplatinom i sekundarnih promjena povezanih s primarnim oštećenjem, koje može biti narušeno u proksimalnim tubulima cilastatinom blokadom Fas-posredovanog apoptotičkog puta.
Materijali i metode
ReagensiUpotrijebljeni su cilastatin (ljubazno obezbjeđen od strane Merck Sharp i Dohme SA, Madrid, Španija) i cisplatin (Pharmacia Nostrum (Madrid, Španija). {{0}}.9 posto otopina NaCl (Braun Medical SA, Barcelona, Španija) je korišćen za pripremu rastvora lekova za primenu N-dodekanoil-D-eritro-sfingosilfosforilholin [SM 30:1 (d18:1/12:0)], D-glukozil- ß-1,10-N-dodekanoil-D-eritro-sfingozin [HexCer 30:1 (d18:1/12:0)], N-dodekanoil D -eritro sfinganilfosforilholin [dhSM 3{{50}}:0 (d18:0/12:0)], 1,2-dimiristoleoil-sn glicero-3- fosfoholin [PC 28:2 (14:1/14:1)], 1-heptadekanoil-2-hidroksi-sn-glicero-3- fosfoholin [LPC (17:0)], i 1, 2- dipalmitoleoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamin [PE 32:2 (16:1/16:1)] su kupljeni od Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, SAD). Deuterirani N-tetrakozanoil- D-eritro-sfingozin [Cer 42:1-d7 (d18:1/24:0)], N-stearoil D-eritro-dihidrosfingozin [dhCer (36:0-d3)] , i C16-30-sulfogalaktozilceramid [Sulf 34:1(d18:1/16:0)] su nabavljeni od Matreya LLC (State College, PA, SAD). Holesterol-d7 (FC-d7) i holesterol-d7 palmitat [CE (16:0-d7)] su iz Sigma-Aldrich.
Isključivo su korišćeni rastvarači i reagensi za HPLC ili LC-MS, uključujući metanol (MeOH), acetonitril (ACN) i izopropanol (iPrOH) (VWR International Eurolab, Barselona, Španija), kao i hloroform, dihlorometan i amonijum za mate (NH4COOH) (Sigma-Aldrich, Merck Life Science SL, Madrid, Španija). Ultračista voda je dobijena iz Milli-Q sistema za prečišćavanje (Millipore, Merck Life Science SL, Madrid, Španija).
Animal ModelOdrasli mužjaci pacova Wistar (WKY, Criffa, Barcelona, Španija) su uzgajani u Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón (IiSGM, Madrid, Španija). Oni su držani pod kontrolisanim uslovima temperature, svetlosti i vlažnosti sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Tretmani su davani intraperitonealno kao što je prethodno opisano [4,11] na četiri grupe pacova (n=6 životinja po grupi): Grupa 1: Kontrola (CNT)—0.9 posto NaCl je ubrizgan u štakori na isti način kao tretmani za grupe 3 i 4; Grupa 2: Cilastatin (CIL) - ubrizgan (150 mg kg 1 tjelesne težine (tw) dnevno); Grupa 3: Cisplatin (CISPL)-injektiran (jedinstvena doza od 5 mg kg 1 tw na dan 0); i Grupa 4: Cisplatin plus cilastatin (CISCIL) - injektirano 5 mg kg 1 tw na dan 0 i ubrizgano cilastatin (150 mg kg 1 tw dnevno). Životinje su žrtvovane pet dana nakon početka tretmana. Prije toga, 24 h urin je sakupljen u metaboličke kaveze od svakog štakora. Krvni serum je također izolovan centrifugiranjem. Bubrezi su uklonjeni nakon perfuzije sa 0,9 posto fiziološkog rastvora na 4 ◦C, nakon čega je uslijedila dekapsulacija. Korteks i medula lijeve stranebubregi poprečno presječena polovina desnebubregsu izrezani, brzo zamrznuti u tečnom N2 i konačno pohranjeni na t 80 ◦C. Druga polovina desnobubregfiksiran je u 4 posto paraformaldehida i ugrađen u parafin za histološke studije.
Histološke studijeBojenje hematoksilinom/eozinom (Sigma-Aldrich, Steinhem, Njemačka) obavljeno je na sagitalnom štakoru od 5 µmbubregsekcije. Obrnuti mikroskop IX70 (Olympus, Hamburg, Njemačka) korišten je za snimanje mikrofotografija pri 20× i 60× uvećanju, za histološki pregled.
Indikatori bubrežne funkcijeAutoAnalyzer Cobas 711 (Roche, Basel, Švicarska) je korišten za određivanje BUN, kreatinina, natrijuma i kalija u uzorcima seruma. Stopa klirensa kreatinina je korištena za izračunavanje GFR. Ukupni protein je određen u urinu metodom sulfosalicilne kiseline [47].
Homogenizacija tkiva Bubregtkiva korteksa i medule (otprilike 50 mg svaki) dodani su u plastične epruvete od 1,5 mL sa poklopcem koji sadrže 800 µL puferske otopine za lizu: 50 mM Tris–HCl pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM NaCl, 5 mM NaF, 1 mM, 4 mM Na414M. i inhibitor proteaze (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, SAD) i zrnca od 1,5 mm od cirkonija. Tkiva su razdvojena na BeadBug-6 Homogenizer (Benchmark D1036-E, Bechmark Scientifific, Sayreville, NY, SAD) pri 4500 o/min, u tri ciklusa od 90 s. Homogenat je dalje obrađen ultrazvukom 40 s pri 10 posto amplitude i centrifugiran na 600 × g 1 min na 4 ◦C. Alikvot dobivenog supernatanta je razrijeđen 1:10 za određivanje ukupnog proteina pomoću proteinskog testa bicinhoninske kiseline (BCA) (Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL, SAD). Ostatak proteinskog ekstrakta je čuvan na t 80 ◦C do lipidomske analize.
Lipidomska analiza pomoću LC-MS/MSLipidi su ekstrahovani iz tkiva (ekvivalentno 250 µg ukupnog proteina) prema Folch-ovom metodu [48]. Deset mikrolitara mješavine internog standarda (IS) dodano je prije ekstrakcije lipida da bi se dobila relativna molarna kvantifikacija vrsta lipida, kao što je prethodno opisano [49]. IS-mješavina se sastojala od sljedećeg: CE (16:0-d7), FC-d7, Cer (42:{{10}} d7), HexCer (30 :1), LPC (17:0), PC (28:2), PE (32:2), SM (30:1), dhSM (30:0), dhCer (35:0) i Sulf (34 :1), u koncentracijama datim u tabeli S4. Lipidni ekstrakti su osušeni u struji azota i rekonstituisani u 250 µL acetonitril/izopropanola (1:1, vol:vol), sonikirani 10 minuta, a zatim prebačeni u bočicu za injekcije.
Pet mikrolitara lipidnog ekstrakta je ubrizgano na LC sistem Eksigent UltraLC{{0}} (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, USA). Vrste su odvojene na Kinetex C18 koloni (100 × 2,1 mm, 1,7 µm; Phenomenex, Macclesfifield, UK) koja radi na 55 ◦C. Eluacija je primijenjena korištenjem binarne mješavine rastvarača A (60 posto acetonitrila u vodi, 10 mM NH4COOH) i rastvarača B (90 posto izopropil alkohola u acetonitrilu, 10 mM NH4COOH) i linearnog gradijenta od 60 posto A do 100 posto B u 12 min i 100 posto B do 60 posto A za 8 minuta, pri brzini protoka od 0,4 mL min悆 1 . Za detekciju lipida korišćen je instrument QTrap 4000 (AB-Sciex LLP, Framingham, MA, SAD), sa softverom Analyst 1.6.2. Azot je korišćen i kao gas za sušenje (T: 500 ◦C, pritisak: 30 psi) i kao gas za raspršivanje (50 psi). Detekcija je postavljena u pozitivnom modu elektrosprej (ESI) za sve klase lipida sa izuzetkom Sulfa, koji je analiziran u ESI negativnom modu. CE i FC su analizirani korišćenjem izvora hemijske jonizacije atmosferskog pritiska (APCI) u režimu pozitivnih jona. Za detekciju lipida korišten je ciljani pristup koji je postavio prelaze praćenja višestrukih reakcija (MRM) za svaku vrstu lipida u vremenima njihovog zadržavanja (Tabela S5). LC-MS/MS vršni hromatogrami su obrađeni korišćenjem softvera Skyline verzije 4.1 (MacCoss Lab, Seattle, WA, USA) [50]. Lipidne vrste su kvantifikovane direktnim poređenjem površine za svaku vrstu sa površinom IS za njihovu klasu lipida, kao što je prethodno opisano [49]. Rezultati su izraženi kao nmol/mg proteina. Ukupni nivoi klase lipida određeni su kao zbir kvantifikovanih vrsta pojedinačnih klasa lipida. Lipidne vrste su označene prema preporučenoj notaciji [51].
Statistička analizaVrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. SPSS 11.5 (SPSS, Chicago, IL, USA) korišten je za deskriptivnu statistiku i evaluaciju statističkih razlika u varijablama između grupa analizom varijanse. Za poređenje lipidnih varijabli u dvije neuparene grupe, parametarski (dvostrani neupareni Studentov t) ili neparametarski (Mann-Whitney) testovi su izvedeni nakon testiranja normalnosti (Shapiro-Wilk). Benjamini–Hochbergova metoda je korištena za korekciju stope lažnog otkrivanja (FDR) p-vrijednosti prilikom poređenja više pojedinačnih vrsta lipida. Dvostrana p-vrijednost < 0.05="" i="" fdr="">< 0,1="" su="" uzeti="" u="" obzir="" za="" identifikaciju="" statistički="" značajnih="" razlika="" kako="" bi="" se="" izbjeglo="" nedostajanje="" potencijalnih="" kandidata="" za="" biomarker.="" promena="" preklopa="" grupe="" x="" u="" odnosu="" na="" grupu="" y="" izračunata="" je="" kao="" odnos="" srednjih="" vrednosti="" za="" varijable="" odgovarajućih="" grupa="">
Multivarijantna analiza podataka (MVDA) izvršena je korištenjem SIMCA verzije 14.1 (MKS Umetrics, Uppsala, Švedska) i MetaboAnalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca (pristupljeno 30 2. septembra) {{20}}21)) [52], uključujući nenadzirani PCA i nadzirani OPLSDA. Vrijednosti koje nedostaju su zamijenjene metodom k-najbližih susjeda. Varijable su bile log-transformirane i pareto-skalirane prije MVDA. Modeli su ocijenjeni prema njihovim vrijednostima R2 i Q2. OPLS-DA je validiran permutacijskim testom (100 ciklusa). VIP rezultati i S-grafovi iz OPLS-DA modela korišćeni su za identifikaciju relevantnih varijabli u CISPL naspram CNT, CISCIL naspram CNT i CISCIL naspram CISPL grupne diskriminacije. Istovremena usklađenost sa VIP > 1, opterećenja skalirana kao koeficijent korelacije |p(corr)| > 0,5, i dvostrana p-vrijednost < 0,05="" i="" fdr="">< 0,1="" za="" poređenje="" u="" dvije="" grupe="" bili="" su="" kriteriji="" korišteni="" za="" odabir="" potencijalnog="" biomarkera.="" auc="" vrijednosti="" su="" dobijene="" iz="" roc="">
PatentiSljedeći patenti su djelimično povezani sa radom predstavljenim u ovom rukopisu: "Upotreba cilastatina za smanjenje nefrotoksičnosti različitih jedinjenja" (broj patenta EP2,143,429 B1; US 9,216,185 B2; US 9,522,128 B2; i US9,757,349). Oni su dodijeljeni Fundación para la Investigación Biomédica Hospital Gregorio Marañón (FIBHGM) i licencirani od strane FIBHGM Telara Pharma SL Telara Pharma SL trenutno je sklopila ugovor o licenciranju sa Arch Biopartners.