Cistanchetakođe ima funkcijupromicanje proizvodnje kolagena, što može povećati elastičnost i sjaj kože i pomoćiobnavljaju oštećene ćelije kože. CistanchePhenylethanol Glycosidesimaju značajan efekat smanjenja aktivnosti tirozinaze, a učinak na tirozinazu se pokazao kao kompetitivna i reverzibilna inhibicija, što može pružiti naučnu osnovu za razvoj i korištenje sastojaka za izbjeljivanje u Cistancheu. Stoga cistanche ima ključnu ulogu u kožiizbjeljivanje. Možeinhibiraju proizvodnju melaninaza smanjenje promjene boje i tuposti; i podstiču proizvodnju kolagena za poboljšanje elastičnosti i sjaja kože. Zbog široko rasprostranjenog prepoznavanja ovih učinaka cistanchea, mnogi proizvodi za izbjeljivanje kože počeli su da sadrže biljne sastojke kao što je Cistanche kako bi zadovoljili potražnju potrošača, čime se povećava komercijalna vrijednost Cistanchea u proizvodima za izbjeljivanje kože. Ukratko, uloga cistanchea u izbjeljivanju kože je ključna. Njegovoantioksidansefekat iefekat proizvodnje kolagenamože smanjiti promjenu boje i tupost, poboljšati elastičnost i sjaj kože i tako postići učinak izbjeljivanja. Također, široka primjena Cistanchea u proizvodima za izbjeljivanje kože pokazuje da se njegova uloga u komercijalnoj vrijednosti ne može potcijeniti.

Kliknite Organic Cistanche za izbjeljivanje

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Tirozinaza je enzim koji ograničava brzinu proizvodnje melanina i, shodno tome, najistaknutija je meta za inhibiciju hiperpigmentacije. Identifikovani su brojni inhibitori tirozinaze, ali većina njih nema kliničku efikasnost jer su identifikovani korišćenjem tirozinaze gljive kao mete. Stoga smo koristili rekombinantnu ljudsku tirozinazu da skriningiramo biblioteku od 50,000 jedinjenja i uporedimo aktivne rezultate skrininga sa dobro poznatim sastojcima za izbjeljivanje. Hidrohinon i njegov derivat arbutin samo su slabo inhibirali ljudsku tirozinazu sa pola maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) u milimolarnom opsegu, a kojična kiselina je pokazala slabu efikasnost (IC50 > 500 mmol/L). Najmoćniji inhibitori humane tirozinaze identifikovani u ovom pregledu bili su derivati ​​resorcinol-tiazola, posebno novoidentifikovani tiamidol (Beiersdorf AG, Hamburg, Nemačka) (izobutil amido tiazolil resorcinol), koji je imao IC50 od 1,1 mmol/L. Nasuprot tome, tiamidol je samo slabo inhibirao tirozinazu gljiva (IC50 =108 mmol/L). U kulturama melanocita, tiamidol je snažno, ali reverzibilno inhibirao proizvodnju melanina (IC50 =0.9 mmol/L), dok je hidrokinon ireverzibilno inhibirao melanogenezu (IC 50 = 16.3 mmol/L). Klinički, Thiamidol je vidljivo smanjio pojavu staračkih pjega u roku od 4 sedmice, a nakon 12 sedmica neke staračke pjege nisu se mogle razlikovati od normalne susjedne kože. Puni potencijal tiamidola za smanjenje hiperpigmentacije ljudske kože treba istražiti u budućim studijama.

UVOD

Melazma, aktinični i senilni lentigine te postinflamatorna hiperpigmentacija veliki su kozmetički problemi zbog kojih mnogi pacijenti traže savjet liječnika. Generalno, ovi poremećaji u većoj učestalosti i težini pogađaju populacije s tamnijom kožom (Stratigos i Katsambas, 2004). Mnogi lokalni proizvodi dostupni su za liječenje hiperpigmentiranih poremećaja, a sadrže različite aktivne sastojke za smanjenje proizvodnje i/ili distribucije melanina. Iako se hiperpigmentacija kože može smanjiti različitim mehanizmima (Briganti et al., 2003.), tirozinaza, enzim koji ograničava brzinu proizvodnje melanina, očigledna je meta inhibitora hiperpigmentacije (Kanteev et al., 2015; Lee et al., 2014; Ramsden i Riley, 2014). Mnoge supstance su opisane u literaturi kao inhibitori tirozinaze, ali većina njih nema kliničku efikasnost, a samo nekoliko jedinjenja se trenutno koristi u lokalnim dermatološkim proizvodima (Chang, 2009; Kim i Uyama, 2005; Rescigno et al., 2002 ). Među njima, kojična kiselina, hidrokinon i arbutin su najčešći (Solano et al., 2006).

Nezadovoljavajuća klinička efikasnost trenutno korišćenih inhibitora tirozinaze je velika jer su ta jedinjenja testirana samo pomoću tirozinaze izolovane iz gljive Agaricus bisporus (mTyr) (Espin et al., 2000; Garcia-Molina i dr., 2005), koja je jedina aktivna tirozinaza komercijalno dostupna. Katalitičke aktivnosti i specifičnosti supstrata mTyr značajno se razlikuju od enzima sisara (Hearing et al., 1980). Nedavno su riješene trodimenzionalne strukture nekoliko tirozinaza, među kojima su strukture mTyr (Ismaya et al., 2011) i dva bakterijska enzima iz Streptomyces castaneoglobisporus (Matoba et al., 2006) i Bacillus megaterium (Sendovski i dr. , 2011). Nasuprot tome, vrlo je malo kinetičkih ili strukturnih informacija dostupno za ljudsku tirozinazu (hTyr), uglavnom zbog značajnih poteškoća u dobivanju dovoljnih količina hTyr iz prirodnih izvora ili heterolognom ekspresijom. hTyr je prolazno eksprimiran u različitim životinjskim ćelijskim linijama (Olivares et al., 2002; Schweikardt et al., 2007; Tripathi et al., 1992; Wendt, 2006), ali su prinosi uvijek bili preniski za detaljnu karakterizaciju rezultirajućeg hTyr preparati. Nedavno je nekoliko grupa razvilo efikasnije sisteme ekspresije za hTyr (Cordes et al., 2013; Fogal et al., 2015; Lai et al., 2016), ali podaci o trodimenzionalnoj strukturi hTyr ili kinetički podaci o hTyr inhibitori su još nedostajali.

REZULTATI

Inhibicija hTyr

A screen of 50,000 compounds in the library, which spans a wide chemical space, yielded several hit series of active and effective hTyr inhibitors. Among them, derivatives of thiazolyl-resorcinol were the most promising group. This lead compound was then optimized to develop derivatives with high activity and physicochemical properties compatible with topical formulations. Thiamidol (isobutyl amido thiazolyl resorcinol, compound 1) (Figure 1) was identified as one of the most potent derivatives. In addition to Thiamidol, 4-butyl resorcinol (compound 2) and the classical tyrosinase inhibitors kojic acid (compound 5), hydroquinone (compound 6), and arbutin (compound 7), as well as rhododendron (compound 9), were also tested as inhibitors of the diphenols (L-dopa oxidase) activity of hTyr over a wide range of concentrations (up to 4 orders of magnitude). The results are summarized in Figure 2a and Table 1. Among these actives, Thiamidol was by far the most efficient inhibitor of hTyr, with a half-maximal inhibitory concentration (IC50) of 1.1 mmol/L, with almost complete enzyme inhibition of hTyr occurring at concentrations above 10 mmol/L. The resorcinol derivatives 4-butylresorcinol, 4-hexylresorcinol, and 4-phenylethylresorcinol had IC50 values of 21mmol/L, 94mmol/L, and 131 mmol/L, respectively (Table 1). With an IC50 of about 500 mmol/L, kojic acid was 500 times less potent than Thiamidol. Hydroquinone and arbutin were both very poor inhibitors of hTyr, with IC50 values in the millimolar range. Kojic acid, arbutin, and hydroquinone were not able to completely inhibit hTyr in the concentration range tested. Racemic rhododendron was also rather ineffective as an inhibitor of L-dopa oxidation, with an IC50 >1.200 mmol/L (Slika 2a).

Detaljna kinetička analiza inhibicije hTyr pomoću tiamidola dala je strogo kompetitivni tip inhibicije sa konstantom inhibitora (Ki) od 0.25 mmol/L (Slika 2b, Tabela 1). Ova vrijednost je u skladu sa vrijednošću IC50 procijenjenom iz krivulja doza-odgovor (1,1 mmol/L) (uporedi sliku 2a) koja bi, za kompetitivnu inhibiciju, trebala biti oko 3 puta veća od Ki. Ki vrijednosti za 4-butil resorcinol (9 mmol/L), 4-heksilresorcinol (39 mmol/L) i 4- feniletilresorcinol (24 mmol/L) su također bile značajno veće od Ki vrijednost tiamidola (Tabela 1). Ovi podaci ilustriraju da tiazolil amidni dio tiamidola prenosi mnogo bolju inhibiciju hTyr nego što to čine bočni lanci ugljikovodika prisutni u tri druga derivata resorcinola (4-butil-, 4-heksil- i {{ 21}}fenil etil resorcinol). Kao što je napomenuto, efikasnost je značajno drugačija kod mTyr, gdje su 4-butil resorcinol, 4-heksilresorcinol i 4-feniletilresorcinol, pa čak i koična kiselina, superiorniji od tiamidola u inhibiciji enzima (tabela 1). Stoga, tiamidol ne bi bio identificiran kao pozitivan u skriningu koji koristi mTyr, a efikasnost 4-feniletilresorcinola bi bila jako precijenjena.

Garcia-Jimenez i dr. (2016) nedavno su izvijestili da mTyr polako oksidira određene resorcinole, pod uvjetom da se prevladavajući metform enzima prethodno pretvara u oksi ili deoksi oblik pomoću aditiva kao što su H2O2 i askorbat i da se reakcija održava pomoću o-difenola. . Stoga smo koristili kvantitativnu analizu tečne hromatografije visokih performansi (Ito i Wakamatsu, 2015.) kako bismo utvrdili da li bi tiamidol mogao biti i supstrat hTyr-a. U našim normalnim uslovima testa (tj. u odsustvu aditiva koje su spomenuli Garcia-Jimenez et al., 2016.), nije došlo do uočljive oksidacije tiamidola unutar nekoliko sati od inkubacije sa hTyr, dok je rododendron lako oksidirao u tom vremenskom okviru. (pogledajte dodatnu sliku S1 na mreži). Dakle, pretpostavljamo da je reakcija koju su opisali Garcia-Jimenez et al. nije relevantno za tiamidol i hTyr u fiziološkim uslovima.

Inhibicija proizvodnje melanina

Zatim smo testirali potencijalne inhibitorne efekte ovih spojeva koristeći trodimenzionalni model za ljudsku kožu. Kao što je uočeno sa pročišćenim hTyr, arbutin je pokazao samo zanemarljivu efikasnost u inhibiciji proizvodnje melanina u modelima kože MelanoDerm (MatTek Corporation, Ashland, MA) (IC50 > 4,000 mmol/L) (Slika 2c) . Kojična kiselina je inhibirala proizvodnju melanina sa IC50 od w400 mmol/L, pokazujući iznenađujuće strmu krivulju doza-odgovor, sa koncentracijama ispod 200 mmol/L samo neznatno inhibirajući proizvodnju melanina (tj. za 5 posto pri 150 mmol/L). Rododendron je pokazao samo marginalne efekte na melanogenezu, sa očiglednim IC50 za inhibiciju od w1,200 mmol/L. Hidrokinon je inhibirao proizvodnju melanina u modelima kože MelanoDerm s IC50 od 15 mmol/L, što sugerira da ima mehanizam koji nije inhibicija tirozinaze. 4-Butilresorcinol je inhibirao sintezu melanina sa IC50 od 13,5 mmol/L. Opet, tiamidol je bio daleko najsnažniji inhibitor proizvodnje melanina u modelima kože MelanoDerm, sa IC50 od 0,9 mmol/L, au jednoslojnim kulturama, tiamidol je vidno smanjio stvaranje melanina (slika 3a).

Hidrokinon i tiamidol su zatim testirani u dugotrajnim monoslojnim kulturama melanocita kako bi se provjerila potencijalna reverzibilnost inhibicije. Iako je 1 mmol/L tiamidola smanjio proizvodnju melanina na manje od 60 posto nakon 2 sedmice, 1 mmol/L hidrokinona je smanjio proizvodnju melanina na samo 85 posto (slika 3b). Međutim, nakon daljeg uzgoja bez aktivnih spojeva, melanociti koji su bili inhibirani tiamidolom brzo su ponovo pokrenuli proizvodnju melanina, dostižući nivoe prije tretmana u roku od 1 sedmice. Nasuprot tome, ćelije tretirane hidrohinonom nisu povratile svoj puni kapacitet za proizvodnju melanina u 2-nedeljnom periodu kulture, a proizvodnja melanina je nastavljena na 85 posto nivoa prije tretmana.

Molekularno modeliranje

Mogući načini vezivanja tiamidola za hTyr ispitani su virtuelnim studijama spajanja. Slika 4a prikazuje aktivno mjesto homološkog modela hTyr u metformi, sa spojenim tiamidolskim ligandom u konformaciji najniže energije. Di-bakar centar sa kisikom za premošćivanje vidljiv je na lijevoj strani. Prikazani su samo ostaci aminokiselina neposredno uz vezani inhibitor. (Numeracija ostataka uključuje signalni peptid). Unutrašnja površina džepa za vezivanje obojena je prema hidrofobnosti na skali od plave za hidrofilnu do smeđe za hidrofobnu. Iako je okruženje di-bakarnog centra izrazito hidrofilno, snažno hidrofobni poddžep formiraju uglavnom bočni lanci I368, V377 i F347. U prikazanoj prostornoj orijentaciji, 1-hidroksi grupa aromatičnog prstena liganda ostvaruje ekstenzivne kontakte sa di-bakarnim centrom, a 3-hidroksi grupa je uključena u vodonične veze sa bočnim lancem S380 i glavni karbonil M374. Tiazolilni prsten se drži na mjestu hidrofobnim interakcijama s nepolarnim džepom (slika 4b), formiranim od bočnih lanaca aminokiselina, od kojih se većina razlikuje između mTyr i hTyr (slika 4c).

Uporedivi rezultati su dobijeni kada je Thiamidol spojen na nedavno objavljenu rendgensku strukturu strukturno sličnog TRP1, melanogenog enzima koji sadrži Zn2þ i još uvijek nepoznate funkcije kod ljudi (Ghanem i Fabrice, 2011; Lai et al., 2017), što sugerira da enzim TYRP1 inhibira i tiamidol (pogledajte dodatnu sliku S2 na mreži).

Kliničke studije

Efikasnost tiamidola in vivo je zatim ispitana u kliničkim studijama u kojima su stariji subjekti tretirali staračke pjege na svojoj koži dva puta dnevno formulom koja sadrži {{0}}.2 posto tiamidola ili samo sa vehikulumom kao kontrolom. Već nakon 4 sedmice liječenja, tretirane staračke pjege su bile značajno svjetlije od neliječenih kontrolnih starosnih pjega (Slika 5a). Poboljšanje se nastavilo tokom cijelog perioda tretmana, a nakon 12 sedmica neke od staračkih pjega nisu se razlikovale od okolne normalno pigmentirane kože (Slika 5b). EpiFlash (Canfifield Scientifific Inc., Parsippany, NJ) fotografije su pokazale vidljivo poboljšanje u izgledu staračkih pjega, a neliječene kontrolne staračke pjege su ostale nepromijenjene (nije prikazano). Studija praćenja pokazala je da koncentracije tiamidola od samo 0,1 posto efektivno smanjuju vidljivost staračkih pjega (pogledajte dodatnu sliku S3 na mreži).

DISKUSIJA

Najsigurniji i najefikasniji način za liječenje kožne hiperpigmentacije je smanjenje proizvodnje melanina inhibicijom aktivnosti tirozinaze. Međutim, većina inhibitora tirozinaze opisanih u literaturi nema kliničku efikasnost kada se inkorporira u lokalne proizvode. Gotovo svi su testirani samo protiv mTyr (Espin et al., 2000; Garcia-Molina et al., 2005) i stoga su se, iako efikasni protiv mTyr, pokazali kao loši inhibitori hTyr. Komercijalno dostupan mTyr nije homogen preparat, već je mješavina nekoliko izoenzima tirozinaze i malih količina dodatnih enzimskih aktivnosti koje mogu utjecati na studije inhibicije na nepredvidive načine (Pretzler et al., 2017). Izoenzimi AbPPO3 i AbPPO4, glavne komponente komercijalno dostupnog mTyr, imaju sekvence aminokiselina u području aktivnog mjesta koje se značajno razlikuju od hTyr (slika 4c). Oba mTyr izoenzima sadrže dodatne petlje između Asn371 (jednog od mjesta glikozilacije hTyr) i Gly372. Nekoliko ostataka koji stupaju u interakciju sa tiamidolom u hTyr (vidi sliku 4b) nisu konzervirani u mTyr, na primjer, Ile368, Ser375 i Ser380. Phe207 je strukturno konzerviran u mTyr, dok Phe347 nije. Budući da čak i male promjene u interakcijama enzim-ligand mogu imati dramatične efekte na afinitete vezivanja, različiti profili inhibicije hTyr i mTyr (sažeti u Tabeli 1) nisu bili iznenađenje.

Glavni cilj ove studije bio je da se uporede efekti arbutina, hidrokinona i kojične kiseline sa različitim derivatima resorcinola na katalitičku funkciju hTyr i na proizvodnju melanina in vivo. Osim tiamidola, sve ispitivane supstance su opisane kao inhibitori tirozinaze (Kim et al., 2012); međutim, njihove prijavljene inhibitorne aktivnosti su izuzetno divergentne. U medicinskoj literaturi, hidrokinon se smatra standardom kriterija za liječenje hiperpigmentacije kože, iako postoji velika zabrinutost u pogledu njegove sigurnosti. Hidrokinon je zabranjen u Evropskoj uniji za upotrebu u kozmetici, ali se još uvijek prodaje u Sjedinjenim Državama kao lijek bez recepta u formulacijama koje sadrže do 2 posto hidrokinona. Nedavno je Američka uprava za hranu i lijekove (2006.) izrazila zabrinutost zbog hidrokinona; međutim, još uvijek se čeka konačna odluka. Objavljene vrijednosti IC50 za hidrohinonsku inhibiciju mTyr pokrivaju raspon od 1,1 mmol/L (Kang et al., 2003) do 680 mmol/L (Abu Ubeid et al., 2009). U našoj analizi, hidrokinon je bio izuzetno neefikasan protiv hTyr, samo ga je inhibirao, dostigavši ​​samo 50 posto inhibicije pri približno 4,000 mmol/L. Iako se hidrokinon smatra inhibitorom tirozinaze od ranih 1990-ih (Palumbo et al., 1991), naši rezultati sugeriraju da su njegova citotoksična svojstva važnija, ne samo zbog štetnih učinaka na melanocite, već i zbog njegove efikasnosti kao inhibitora melanogeneze. (Jimbow et al., 1974; Penney et al., 1984; Smith et al., 1988). Ovo gledište je potkrijepljeno ne samo našim rezultatima s hTyr i činjenicom da hidrokinon značajno smanjuje proizvodnju melanina u modelima kože, već i našim eksperimentima s kulturama melanocita. Ovdje je hidrokinon smanjio proizvodnju melanina, ali tretirane stanice nisu povratile puni kapacitet za proizvodnju melanina nakon uklanjanja aktivne tvari.

Although arbutin is generally considered an effective tyrosinase inhibitor, the published IC50 values of arbutin for mTyr range from 40 mmol/L (Ying et al., 1999) to more than 30,000 mmol/L (Sugimoto et al., 2005). In our test system, we found very high IC50 values (>4,000 mmol/L) za arbutin sa pročišćenim hTyr i modelom kože MelanoDerm. Objavljeni su podaci o efikasnosti i a-arbutina i b-arbutina (Garcia-Jimenez et al., 2017). Međutim, oba spoja su prolijekovi hidrokinona, čija biološka aktivnost zavisi od oslobađanja hidrokinona iz molekula (Briganti et al., 2003). Naučni komitet Evropske unije za potrošačke proizvode (2008) objavio je kritičko mišljenje o arbutinu. S obzirom na oslobađanje hidrokinona iz molekule, upotreba arbutina u kozmetičkim proizvodima nije sigurna.

Objavljene vrijednosti IC50 za inhibiciju tirozinaze pomoću kojične kiseline kreću se od 6 mmol/L (Curto et al., 1999) do više od 100 mmol/L (Jeon et al., 2005). Kao inhibitor hTyr, kojična kiselina je mnogo manje efikasna, sa IC50 od oko 500 mmol/L. Kojična kiselina pokazuje mešoviti tip inhibicije, sa Ki od 145 mmol/L, što ukazuje da se vezuje za deoksi oblik tirozinaze (Sun et al., 2014). Kada se koristi za liječenje MelanoDerm modela, kojična kiselina pokazuje izuzetno strmu krivulju doza-odgovor, uz relativnu inhibiciju koja se povećava sa 5 posto pri 150 mmol/L na više od 75 posto inhibicije pri 900 mmol/L (vidi sliku 2c). Ova činjenica može biti glavni razlog za vrlo ograničenu efikasnost kojične kiseline in vivo. Što se tiče sigurnosti kojične kiseline, Evropski naučni komitet za sigurnost potrošača (2012.) sada smatra kojičnu kiselinu u koncentracijama do 1,0 posto bezbednom za kozmetičke proizvode kada se nanosi na zdravu kožu, što je stajalište koje deli Stručna komisija za pregled kozmetičkih sastojaka ( Burnett et al., 2010).

Rododendron je u Japanu dobio status kvazi lijeka 2008. godine i korišten je kao sastojak za izbjeljivanje u kozmetičkim proizvodima. Pretpostavlja se da je kompetitivni inhibitor tirozinaze. Međutim, 2013. godine proizvodi koji sadrže rododendrone povučeni su iz 10 azijskih zemalja kada je blizu 20,000 potrošača razvilo leukodermu nakon upotrebe proizvoda. Pokazalo se da rododendron nije samo inhibitor već je i supstrat za hTyr (Ito et al., 2014a) i mTyr (Ito et al., 2014b). Akumulacija stresa endoplazmatskog retikuluma ovisno o tirozinazi i/ili aktivacija apoptotičkog puta može doprinijeti citotoksičnosti melanocita rododendrona (Sasaki et al., 2014).

Motiv 4-supstituisanog resorcinola je već neko vrijeme poznat kao efikasan hemijski dio koji inhibira tirozinazu (Khatib et al., 2005). Mnoga prirodna jedinjenja koja su identifikovana kao sredstva za izbeljivanje, uglavnom flavonoidi, sadrže ovaj motiv (Shimizu et al., 2000, 2011). Budući da je bioraspoloživost flavonoida općenito niska, naš cilj je bio identificirati derivate rezorcinola s boljom djelotvornošću i biodostupnošću. 4-Butilresorcinol je već bio identificiran kao inhibitor mišje i ljudske tirozinaze (Kim et al., 2005; Kolbe et al., 2013) i aktivnosti oksidaze dihidroksi indol karboksilne kiseline miša TYRP1 (Katagiri et al. , 2001), a komercijalno je dostupan za medicinsko i kozmetičko liječenje hiperpigmentacije (Bohnsack et al., 2012; Jimenez i Garcia-Carmona, 1997; Kim et al., 2005). Ipak, još uvijek nedostaju detaljni kinetički podaci 4-butil rezorcinola. U hTyr testu, pronašli smo striktno kompetitivnu vrstu inhibicije 4-butil resorcinolom sa Ki od 9,1 mmol/L, što se odlično slaže sa utvrđenom vrijednošću IC50 (Tabela 1).

U našim in vitro eksperimentima, tiamidol, sa IC50 od 1,1 mmol/L u testu enzima hTyr i 0,9 mmol/L u modelu kože MelanoDerm, bio je daleko najefikasniji od svih testiranih supstanci. Dalji eksperimenti su potvrdili da je tiamidol strogo kompetitivni inhibitor (slika 2b), a ne supstrat za tirozinazu (vidi dodatnu sliku S1), te se stoga tiamidol ne pretvara u toksični kinon koji potencijalno izaziva leukodermu. Stoga je Thiamidol odabran za klinička ispitivanja kako bi se procijenila njegova efikasnost in vivo. Studija Thiamidola korištenjem tačkastog aplikatora pokazala je kontinuirano poboljšanje izgleda staračkih pjega tokom cijelog 12-nedeljnog perioda tretmana, dostižući statističku značajnost već nakon 4 sedmice. Ovi rezultati pokazuju snažnu efikasnost testa Thiamidol u smanjenju pigmenta i jasnu kliničku korist u liječenju hiperpigmentacije kože.

MATERIJALI I METODE

Ljudska tirozinaza

Skraćeni, His-označeni oblik hTyr (hTyr-DHis) koji se sastoji od katalitičkog domena hTyr eksprimiran je u HEK 293 ćelijama i pročišćen metalnom afinitetnom hromatografijom na Ni2þ-Sepharose (GE Healthcare, Minhen, Njemačka) kako je opisano na drugom mjestu ( Cordes et al., 2013). Dobijeni preparat imao je ista katalitička svojstva kao divlji tip hTyr.

Izvori inhibitora

Iz Evotec biblioteke jedinjenja (Evotec, Hamburg, Nemačka), 50,000 jedinjenja, koja pokrivaju širok hemijski prostor, odabrano je za sprovođenje HTS za hTyr inhibitore, procenjeno korišćenjem Tyr testa opisanog u sledećem odeljku. Zatim su sintetizirani derivati ​​obećavajućih jedinjenja olova za dalju optimizaciju. Ostali inhibitori su kupljeni od različitih dobavljača (pogledajte dodatne materijale na mreži za detalje).

Test tirozina i HTS postupak

Puni detalji o aktivnosti L-dopa oksidaze i korištenim HTS procedurama skrininga mogu se naći u Dodatnim materijalima.

Molekularno modeliranje

In silico docking je baziran na novom homološkom modelu hTyr, opisanom na drugom mjestu (Mann et al., 2017). Simulacije su izvedene pomoću Molegro Virtual Docker-a (Molegro, Aarhus, Danska). Za vizuelnu analizu i prezentaciju podataka korišten je Discovery Studio Visualizer 4.0 (Accelrys, San Diego, CA). Sekvence su preuzete iz UniProt baze podataka (UniProt Consortium, 2017).

Testovi modela kože

Puni detalji MelanoDerm tkiva korištenih kao model kože i količina n njihovog sadržaja melanina mogu se pronaći u Dodatnim materijalima.

Kulture melanocita

Puni detalji o kulturama melanocita i kvantifikacija njihovog sadržaja melanina mogu se naći u Dodatnim materijalima.

Kliničke studije

Sprovedene su dvije randomizirane in vivo studije (zaslijepljene za testirane proizvode, otvorene za netretiranu kontrolu). U jednu studiju uključeno je 18 žena (56 do 71 godina starosti), sa 17 ispitanika koji su završili studiju. Druga studija je sprovedena sa 19 ispitanika (18 žena, 1 muškarac; 58e7{{10}} godina starosti), sa svih 19 ispitanika koji su završili studiju. Svaki ispitanik je nanosio dvije različite formulacije dva puta dnevno na staračke pjege na svojim volarnim podlakticama koristeći tački aplikator. Formulacije su se razlikovale samo u aktivnom sastojku: 0,2 posto tiamidola u odnosu na vehikulum u prvoj studiji i 0,1 posto tiamidola u odnosu na vehikul u drugoj studiji. Jedna starosna pjega po subjektu tretirana je formulom koja je sadržavala aktivni sastojak, a kontrolno mjesto tretirano je samo nosačem. Pigmentacija staračkih pjega je analizirana kako je opisano u Dodatnim materijalima. In vivo studije su sprovedene u skladu sa preporukama aktuelne verzije Helsinške deklaracije i smernicama Međunarodne konferencije o harmonizaciji dobre kliničke prakse. Svi učesnici u ovim studijama dali su pismeni informirani pristanak. Osim toga, studije je odobrio i odobrio institucionalni odbor za reviziju Beiersdorf AG (Hamburg, Njemačka).

SUKOB INTERESA

DODATNI MATERIJAL

Dodatni materijal je povezan s internetskom verzijom rada.

REFERENCE

1. Abu Ubeid A, Zhao L, Wang Y, Hantash BM. Oligopeptidi kratke sekvence sa inhibitornom aktivnošću protiv gljiva i humane tirozinaze. J Invest Dermatol 2009;129:2242e9.

2. Bohnsack K, Koop U, Hiddemann S, Kolbe L, Rippke F. Pigmentacija smanjuje efikasnost i podnošljivost šest novih formulacija za njegu lica koje sadrže 4-n-butil resorcinol, poster br. P864. Poster predstavljen na 21. EADV kongresu, septembar 27-30, 2012; Prag, Češka Republika.

3. Briganti S, Camera E, Picardo M. Hemijski i instrumentalni pristupi liječenju hiperpigmentacije. Pigment Cell Res 2003;16:101e10.

4. Burnett CL, Bergfeld WF, Belsito DV, Hill RA, Klaassen CD, Liebler DC, et al. Konačni izvještaj o procjeni sigurnosti kojiće kiseline koja se koristi u kozmetici. Int J Toxicol 2010; 29 (6 Suppl.). 244Se73.

5. Chang TS. Ažurirani pregled inhibitora tirozinaze. Int J Mol Sci 2009;10: 2440e75.

6. Chen QX, Ke LN, Song KK, Huang H, Liu XD. Inhibicijski efekti heksilresorcinola i dodecil resorcinola na tirozinazu gljiva (Agaricus bisporus). Protein J 2004;23:135e41.

7. Cordes P, Sun W, Wolber R, Kolbe L, Klebe G, Ro¨hm KH. Ekspresija u nemelanogenim sistemima i prečišćavanje rastvorljivih varijanti humane tirozinaze. Biol Chem 2013;394:685e93.

8. Curto EV, Kwong C, Hermersdo¨rfer H, Glatt H, Santis C, Virador V, et al. Inhibitori melanocitne tirozinaze sisara: in vitro poređenja alkil estera gentizinske kiseline sa drugim navodnim inhibitorima. Biochem Pharmacol 1999;57:663e72.

9. Espin JC, Varon R, Fenoll LG, Gilabert MA, Garcia-Ruiz PA, Tudela J, et al. Kinetička karakterizacija specifičnosti supstrata i mehanizam tirozinaze gljiva. Eur J Biochem 2000;267:1270e9.

10. Fogal S, Carotti M, Giaretta L, Lanciai F, Nogara L, Bubacco L, Bergantino E. Ljudska tirozinaza proizvedena u ćelijama insekata: orijentir za skrining novih lekova koji se bave njenom aktivnošću. Mol Biotechnol 2015;57:45e57.

11. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Canovas F. Djelovanje tirozinaze na alfa i beta-arbutin: kinetička studija. PLoS One 2017;12:e0177330.

12. Garcia-Jimenez A, Teruel-Puche JA, Berna J, Rodriguez-Lopez JN, Tudela J, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F. Karakterizacija djelovanja tirozinaze na resorcinole. Bioorg Med Chem 2016;24:4434e43.

13. Garcia-Molina F, Hiner AN, Fenoll LG, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Ruiz PA, Garcia-Canovas F, et al. Tirozinaza gljiva: aktivnost katalaze, inhibicija i samoubilačka inaktivacija. J Agric Food Chem 2005;53:3702e9.

14. Ghanem G, Fabrice J. Protein 1 povezan s tirozinazom (tyrp1/gp75) u melanomu kože kod ljudi. Mol Oncol 2011;5:150e5.

15. Hearing VJ Jr, Ekel TM, Montague PM, Nicholson JM. Tirozinaza sisara. Stehiometrija i mjerenje produkta reakcije. Biochim Biophys Acta 1980;611:251e68.

16. Ismaya WT, Rozeboom HJ, Weijn A, Mes JJ, Fusetti F, Wichers HJ, Dijkstra BW. Kristalna struktura tirozinaze gljive Agaricus bisporus: identitet tetramerskih podjedinica i interakcija s tropolonom. Biochemistry 2011;50:5477e86.

17. Ito S, Gerwat W, Kolbe L, Yamashita T, Ojika M, Wakamatsu K. Ljudska tirozinaza može oksidirati oba enantiomera rododendrona. Pigment Cell Melanoma Res 2014a;27:1149e53.

18. Ito S, Ojika M, Yamashita T, Wakamatsu K. Oksidacija rododendrona katalizirana tirozinazom proizvodi 2-metilhroman-6,7-dion, navodni krajnji otrovni metabolit: implikacije na toksičnost melanocita . Pigment Cell Melanoma Res 2014b;27:744e53.

19. Ito S, Wakamatsu K. Pogodna metoda skrininga za razlikovanje fenolnih inhibitora tirozinaze za izbjeljivanje kože od fenola koji izazivaju leukodermu. J Dermatol Sci 2015;80:18e24.

20. Jeon SH, Kim KH, Koh JU, Kong KH. Inhibicijski efekti l-Dopa oksidacije tirozinaze sredstvima za izbjeljivanje kože. Bull Korean Chem Soc 2005;26:1135e7.

21. Jimbow K, Obata H, Pathak MA, Fitzpatrick TB. Mehanizam depigmentacije hidrohinonom. J Invest Dermatol 1974;62:436e49.

22. Jimenez M, Garcia-Carmona F. 4-supstituisani resorcinoli (sulfitne alternative) kao sporovezujući inhibitori aktivnosti tirozinaze kateholaze. J Agric Food Chem 1997;45:2061e5.

23. Kang HH, Rho HS, Hwang JS, Oh SG. Depigmentirajuća aktivnost i niska citotoksičnost alkoksi benzoata ili alkoksi cinamata u uzgojenim melanocitima. Chem Pharm Bull (Tokio) 2003;51:1085e8.

24. Kanteev M, Goldfeder M, Fishman A. Korelacije strukture i funkcije u tirozinazama. Prot Sci 2015;24:1360e9.

25. Katagiri T, Okubo T, Oyobikawa M, Futaki K, Shaku M, Kawai M, et al. Inhibitorno djelovanje 4-n-butil resorcinola na melanogenezu i njegov efekat izbjeljivanja kože. J Soc Cosmet Chem Jpn 2001;35:42e9.

26. Khatib S, Nerya O, Musa R, Shmuel M, Tamir S, Vaya J. Chalcones kao moćni inhibitori tirozinaze: značaj 2,4-supstituiranog rezorcinolnog dijela. Bioorg Med Chem 2005;13:433e41.

27. Kim DS, Kim SY, Park SH, Choi YG, Kwon SB, Kim MK, et al. Inhibicijski efekti 4-n-butil resorcinola na aktivnost tirozinaze i sintezu melanina. Biol Pharm Bull 2005; 28:2216e9.

28. Kim H, Choi HR, Kim DS, Park KC. Lokalni hipopigmentirani agensi za pigmentne poremećaje i njihovi mehanizmi djelovanja. Ann Dermatol 2012; 24:1e6.

29. Kim YJ, Uyama H. ​​Inhibitori tirozinaze iz prirodnih i sintetičkih izvora, struktura, mehanizam inhibicije i perspektiva za budućnost. Cell Mol Life Sci 2005;62:1707e23.

30. Kolbe L, Mann T, Gerwat W, Batzer J, Ahlheit S, Scherner C, et al. 4-n-butil resorcinol, visoko efikasan inhibitor tirozinaze za lokalni tretman hiperpigmentacije. J Eur Acad Dermatol Venereol 2013; 27: 19e23.

31. Lai X, Soler-Lopez M, Wichers HJ, Dijkstra BW. Velika rekombinantna ekspresija i pročišćavanje humane tirozinaze pogodna za strukturne studije. PLoS One 2016;11:e0161697. 32. Lai X, Wichers HJ, Soler-Lopez M, Dijkstra BW. Struktura humanog proteina 1 povezanog s tirozinazom otkriva binuklearno aktivno mjesto cinka važno za melanogenezu. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:9812e5.

33. Lee SY, Baek N, Nam TG. Prirodni, polusintetski i sintetički inhibitori tirozinaze. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;31:1e13.

34. Mann T, Gerwat W, Wenck H, Ro¨hm KH, Kolbe L. Izobutilamido tiazolil resorcinol novi moćni inhibitor humane tirozinaze. Pigment Cell Melanoma Res 2017:e85.

35. Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Kristalografski dokazi da je dinuklearni bakarni centar tirozinaze FL fleksibilan tokom katalize. J Biol Chem 2006;281:8981e90.

35. Nesterov A, Zhao J, Minter D, Hertel C, Ma W, Abeysinghe P, et al. 1-(2,4- dihidroksi fenil)-3-(2,4-dimetoksi-3-metil fenil)propan, novi inhibitor tirozinaze sa jakim depigmentirajućim efektima. Chem Pharm Bull (Tokio) 2008;56:1292e6.

36. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikacija aktivnih ostataka uključenih u vezivanje metalnog kofaktora i stereospecifično prepoznavanje supstrata u tirozinazi sisara. Implikacije na katalitički ciklus. Biochemistry 2002;41:679e86.

37. Palumbo A, d'Ischia M, Misuraca G, Prota G. Mehanizam inhibicije melanogeneze hidrohinonom. Biochim Biophys Acta 1991;1073:85e90.

38. Penney KB, Smith CJ, Allen JC. Depigmentirajuće djelovanje hidrokinona ovisi o poremećaju osnovnih ćelijskih procesa. J Invest Dermatol 1984;82:308e10.

39. Pretzler M, Bijelić A, Rompel A. Heterologna ekspresija i karakterizacija funkcionalne tirozinaze gljiva (AbPPO4). Sci Rep 2017;7:1810.

40. Ramsden CA, Riley PA. Tirozinaza: četiri oksidaciona stanja aktivnog mesta i njihov značaj za enzimsku aktivaciju, oksidaciju i inaktivaciju. Bioorg Med Chem 2014;22:2388e95.

41. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. Inhibicija tirozinaze, opći i primijenjeni aspekti. J Enzyme Inhib Med Chem 2002;17:207e18.

42. Sasaki M, Kondo M, Sato K, Umeda M, Kawabata K, Takahashi Y, et al. Rododendron, fenolno jedinjenje koje izaziva depigmentaciju, ispoljava citotoksičnost melanocita putem mehanizma ovisnog o tirozinazi. Pigment Cell Melanoma Res 2014;27:754e63.

43. Schweikardt T, Olivares C, Solano F, Jaenicke E, Garcia-Borron JC, Decker H. Trodimenzionalni model aktivnog mjesta tirozinaze kod sisara koji uzima u obzir gubitak mutacija funkcije. Pigment Cell Res 2007;20: 394e401.

44. Naučni odbor za proizvode široke potrošnje. Mišljenje o b-arbutinu; 2008 (pristupljeno 21. novembra 2017).

45. Naučni odbor za sigurnost potrošača. Mišljenje o kojičnoj kiselini; 2012 (pristupljeno 21. novembra 2017).

46. ​​Sendovski M, Kanteev M, Ben-Yosef VS, Adir N, Fishman A. Prve strukture aktivne bakterijske tirozinaze otkrivaju plastičnost bakra. J Mol Biol 2011;405: 227e37.

47. Shimizu K, Kondo R, Sakai K. Inhibicija tirozinaze flavonoidima, stilbenima i srodnim 4-supstituisanim resorcinolima: istraživanja strukture i aktivnosti. Planta Med 2000;66:11e5.

48. Shimizu MM, Melo GA, Brombini Dos Santos A, Bottcher A, Cesarino I, Araujo P, et al. Karakterizacija enzima, izolacija i cDNK kloniranje polifenol oksidaze u srcima palmi tri komercijalno važne vrste. Plant Physiol Biochem 2011;49:970e7.

49. Smith CJ, O'Hare KB, Allen JC. Selektivna citotoksičnost hidrokinona za ćelije izvedene iz melanocita je posredovana aktivnošću tirozinaze, ali nezavisno od sadržaja melanina. Pigment Cell Res 1988;1:386e9.

50. Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G. Sredstva za hipopigmentiranje: ažurirani pregled bioloških, hemijskih i kliničkih aspekata. Pigment Cell Res 2006;19:550e71.

51. Stratigos AJ, Katsambas AD. Optimalno liječenje neposlušnih poremećaja hiperpigmentacije kod tamnoputih pacijenata. Am J Clin Derm 2004; 5: 161e8.

52. Sugimoto K, Nomura K, Nishimura T, Kiso T, Sugimoto K, Kuriki T. Sinteze a-arbutin-a-glikozida i njihovi inhibitorni efekti na ljudsku tirozinazu. J Biosci Bioeng 2005;99:272e6.

53. Sun W, Wendt M, Klebe G, Ro¨hm KH. O tumačenju kinetike inhibicije tirozinaze. J Enzyme Inhib Med Chem 2014;29:92e9.

54. Tripathi RK, Hearing VJ, Urabe K, Aroca P, Spritz RA. Mutacijsko mapiranje katalitičkih aktivnosti ljudske tirozinaze. J Biol Chem 1992;267:23707e12.

55.UniProt konzorcijum. UniProt: univerzalna baza znanja o proteinima. Nukleinske kiseline Res 2017;45:D158e69.

56. US Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services. Proizvodi lijekova za izbjeljivanje kože za ljudsku upotrebu bez recepta; predloženo pravilo. 71 Federalni registar 51146-5115521 (kodificiran u 21 CFR dio 310); 2006.

57. Vielhaber G, Schmaus G, Jacobs K, Franke H, Lange S, Herrmann M, et al. 4-(1-fenilmetil)1,3-benzendiol: novo, visoko efikasno sredstvo za posvjetljivanje. Int J Cosmet Sci 2007;29:65e6. 58. Wendt M. Rationales design neuer tyrosinase-inhibitoren. dr.sc. teza. Marburg, Njemačka: Medicinski fakultet Univerziteta u Marburgu; 2006.

59. Ying YH, Lee SJ, Chung MH, Ying HJ, Suk JL, Myung HC, et al. Aloezin i arbutin sinergistički inhibiraju aktivnost tirozinaze putem različitog mehanizma djelovanja. Arch Pharm Res 1999; 22:232e6.

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501