Abstract.Arbutin je prirodni spoj ekstrahiran iz različitih biljaka, uključujući listove medvjeđe bobice, koji ima višestruke efekte uključujući izbjeljivanje kože, te protuupalna i oksidativna svojstva zaštite od stresa. Međutim, efekti arbutina na osteoblaste ostaju nepoznati. Ova studija je imala za cilj da istraži funkciju i mehanizme arbutina na proliferaciju i diferencijaciju MC3T3-E1 mišjih prekursorskih ćelija osteoblasta in vitro. Proliferacija MC3T3-E1 ćelija tretiranih arbutinom procijenjena je korištenjem Cell Counting Kit-8 testa i testa označavanja 5-etinil-2'-deoksiuridina. Dodatno, ćelijski ciklus i apoptoza su ispitani analizom protočne citometrije. Efekti arbutina na diferencijaciju osteoblasta istraženi su bojenjem alkalnom fosfatazom (ALP) i ispitivanjem nivoa ekspresije mRNA kolagena tipa I 1 lanca (COL1A1), koštanog karboksiglutamatnog proteina (BGLAP) i Sp7 transkripcionog faktora (SP7). Da bi se dalje istražio molekularni mehanizam koji leži u osnovi funkcije arbutina u promociji osteogeneze, nivoi ekspresije mRNA i proteina transkripcionog faktora 2 (RUNX2) i -katenina analizirani su lančanom reakcijom reverzne transkripcije i kvantitativne polimeraze i Western blottingom. Arbutin je značajno promovirao proliferaciju MC3T3-E1 ćelija i povećao omjer ćelija u S-fazi. Tretman arbutinom povećao je aktivnost ALP i nivoe ekspresije mRNA COL1A1, BGLAP i SP7 u MC3T3-E1 ćelijama. Nadalje, nivoi ekspresije proteina i mRNA RUNX2 i -katenina značajno su se povećali nakon tretmana arbutinom. Zajedno, sadašnji nalazi sugeriraju da je arbutin bio u stanju promovirati proliferaciju i diferencijaciju ćelija MC3T3-E1 putem signalnog puta Wnt/-catenin.
Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite efekte kao nprantioksidans, protuupalnoi unapređenje imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche iizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom dejstvu cistanche glikozida. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju kataliziratirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva učešće kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utiče na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu.inhibiranje proizvodnje melanina.
Za više informacija:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Uvod
Osteoporoza je zdravstveni i socioekonomski problem koji karakterizira niska koštana masa i narušena mikroarhitektura kostiju, što povećava rizik od fragilnih fraktura (1,2). U Evropskoj uniji (EU), stopa prevalencije osteoporoze kod osoba starijih od 50 godina procijenjena je na 6,6 odnosno 22,1 posto za muškarce i žene u 2010. godini. Ekonomski, ukupni trošak osteoporoze za EU bio je ~37,4 milijarde eura u 2010. (3). Zbog produženja očekivanog životnog vijeka i sve većeg starenja stanovništva, sve veći broj ljudi može patiti od osteoporotskih prijeloma u budućnosti (4). Osteoporoza je uzrokovana neravnotežom između formiranja kosti, posredovane osteoblastima, i resorpcije, posredovane osteoklastima (5). Dostupni tretmani za osteoporozu uključuju lijekove protiv resorpcije (kao što su bisfosfonati i denosumab), kalcitonin i estrogen. Međutim, ova jedinjenja pokazuju određena ograničenja; posebno smanjuju stopu osteogene preobrazbe, a smanjenjem procesa remodeliranja kostiju uzrokuju smanjenje formiranja kosti (6). Terapija estrogenom nije idealna za dugotrajnu terapiju osteoporoze, jer visoki nivoi estrogena mogu izazvati krvarenje iz materice, rak dojke i kardiovaskularne bolesti (7). Osim toga, lijekovi protiv resorpcije nisu u stanju vratiti izgubljenu strukturu kostiju. Međutim, anabolički agensi mogu stimulirati formiranje kostiju i povećati koštanu masu (8). Stoga je važno identificirati nove sigurne i efikasne lijekove koji mogu promovirati formiranje kostiju.
Arbutin (4-hidroksifenil--D-glukopiranozid; slika 1) je prirodni derivat hidrohinona (molekulska masa 272 Da) prisutan u različitim vrstama biljaka. Visoki nivoi arbutina su identificirani u biljkama uključujući mažuran (Origanum majorana, Lamiaceae) i kruške (Pyrus communis, Rosaceae), a posebno u porodici Ericaceae kao što su listovi medvjeđe bobice (Arctostaphylos uva‑ursi) (9). Arbutin ispoljava različite biološke aktivnosti. Na primjer, može se koristiti arbutin
kao sredstvo za izbjeljivanje kože; inhibiranjem aktivnosti tirozinaze u melanosomima, utvrđeno je da arbutin podstiče depigmentaciju (10,11). Prethodna studija je pokazala da arbutin može imati zaštitnu ulogu od apoptoze izazvane X-zračenjem tako što smanjuje intracelularne nivoe hidroksilnih radikala (12). Dodatno, arbutin može inhibirati diferencijaciju osteoklasta smanjenjem intracelularnog nivoa superoksida i smanjenjem nuklearnog faktora aktiviranih T ćelija 1 (13). Međutim, efekti arbutina na funkciju osteoblasta ostaju nepoznati. Stoga je ova studija imala za cilj da istraži efekte i mehanizme arbutina na proliferaciju i diferencijaciju prekursorskih stanica osteoblasta MC3T3-E1 miša.
Wnt signalni put može uticati na osteoblast i osteoklast, direktno i indirektno, povećavajući formiranje kosti i smanjujući resorpciju kosti (14). Canonical Wnt signalizacija može regulisati proliferaciju, diferencijaciju i funkciju osteoblasta na više nivoa (15). U životinjskim modelima, smanjenje aktivnosti inhibitora Wnt/-catenin signalnog puta korištenjem antitijela protiv izlučenog naboranog proteina povezanog s proteinom 1, sklerostina i dickkopfovog inhibitora 1 signalnog puta WNT (DKK1) i malih molekula inhibitora glikogen sintaze kinaza 3 (GSK-3) može povećati koštanu masu i smanjiti rizik od prijeloma(16). Stoga, Wnt signalni put predstavlja potencijalni terapeutski cilj za razvoj novih lijekova za liječenje osteoporoze (17). U ovoj studiji istraženi su efekti arbutina na proliferaciju i diferencijaciju MC3T3-E1 ćelija. Osim toga, ispitan je molekularni mehanizam koji je u osnovi funkcije arbutina u izazivanju diferencijacije MC3T3-E1 stanica.
materijali i metode
Hemikalije. Arbutin (čistoće, veća od ili jednaka 98 posto) je kupljen od Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Dalian, Kina), rastvoren u dimetil sulfoksidu (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka) i uskladišten u koncentracija 0.5 M. Rekombinantni ljudski DKK1 je kupljen od PeproTech, Inc. (Rocky Hill, NJ, SAD; kat. br. 120-30).
Ćelijska kultura. Preosteoblasti kalvarije miša MC3T3‑E1 kupljeni su od Centra za ćelijske resurse Šangajskog instituta za biološke nauke Kineske akademije nauka (Šangaj, Kina) i uzgajani su u -minimalnom osnovnom mediju (-MEM; HyClone; GE Healthcare Life Sciences, Logan, UT, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Izrael), 100 µg/ml streptomicina i 100 U/ml penicilin (HyClone; GE Healthcare Life Sciences). Ćelije su održavane u inkubatoru ćelijske kulture sa 5% CO2 na 37˚C. Medij se mijenjao svaki drugi dan. Ćelije na 80 posto konfluencije ponovo su posađene u tikvice za kulturu tkiva nakon tretmana sa 0,25 posto tripsina (HyClone; GE Healthcare Life Sciences) u trajanju od 1-2 minuta na 37°C. Za eksperimente osteoblastne diferencijacije, ćelije su tretirane osteogenim dodatkom koji je sadržavao 50 µg/ml L-askorbinske kiseline (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) i 10 mM -glicerofosfat dinatrijeva sol hidrata (Sigma-G9a3 za Merck-KAldrichA3 dana) ˚C. Za mehaničke studije, ćelije MC3T3‑E1 su prethodno tretirane DKK1 (0,5 µg/ml) tokom 6 h na 37˚C, a zatim su tretirane arbutinom (100 µM) 3 dana na 37˚C.
Proliferacija ćelija. Komplet za brojanje ćelija{{0}} test (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan) je korišten za procjenu efekata arbutina na proliferaciju ćelija. Ćelije su posađene u 96- ploče sa gustinom od 5x103 ćelija/jažici tokom 24 h na 37˚C. Nakon toga, ćelije su tretirane arbutinom u različitim koncentracijama (0, 10, 50 i 100 µM). Nakon 24, 48 ili 72 h, ćelije su tretirane sa 9,1-postotnim rastvorom CCK‑8 koji je sadržavao 10 µl CCK-8 i 100 µl ‑MEM tokom 1‑2 h na 37˚C. Vrijednost optičke gustine svake jažice izmjerena je pomoću čitača mikroploče (ELx808; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, SAD) na talasnoj dužini od 450 nm. Relativna ćelijska vijabilnost je izračunata kao odnos između srednje apsorbancije uzorka i kontrole.
Test označavanja 5-etinil-2'-deoksiuridina (EdU). Učinak arbutina na proliferaciju stanica mjeren je pomoću EdU Apollo®567 in vitro kompleta za snimanje (Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangzhou, Kina). Ćelije su inokulirane u pločicu sa 96-jažicom gustine 1x103 ćelije/jažici i inkubirane u -MEM koji sadrži 10 posto FBS-a sa 0, 10, 50 ili 100 µM arbutin. Nakon 72-h inkubacije, EdU je dodan u svaku jažicu u koncentraciji od 50 µM prije dodatne inkubacije od 2 h na 37˚C. Ćelije su dva puta isprane PBS-om i fiksirane sa PBS-om koji sadrži 4% paraformaldehida 30 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Nakon ispiranja sa glicinom (2 mg/ml) i PBS-om, ćelije su permeabilizirane sa Triton X-100 (0,5 posto) tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su inkubirane sa reakcionom tečnošću 1X Apollo bojenja na sobnoj temperaturi 30 minuta u mraku. Ćelijska jezgra su obojena sa 1X Hoechst 33342 tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. EdU-pozitivne ćelije su vizualizovane fluorescentnom mikroskopijom (uvećanje, x200; Eclipse Ti; Nikon Corporation, Tokio, Japan) u pet nasumično odabranih polja.
Analiza ćelijskog ciklusa i apoptoze. MC3T3-E1 ćelije su zasijane u ploče sa šest jažica u gustini od 2x105 ćelija/jažici. Nakon 24-h inkubacije, ćelije su tretirane arbutinom u koncentracijama od 0, 10, 50 i 100 µM. Ćelije su sakupljene nakon 3 dana na sobnoj temperaturi i fiksirane sa 70 posto etanola 12 h na 4˚C. Ćelije su isprane tri puta sa PBS i obojene rastvorom za bojenje propidijum jodida (PI) (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina) tokom 30 minuta na 37˚C u mraku. Sadržaj DNK mjeren je pomoću FACSCalibur protočnog citometra (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) sa softverom CellQuest Pro (verzija 5.2; BD Biosciences) i softverom ModFit LT (verzija 3.0; Verity Software House, Inc., Topsham, ME, SAD). Za analizu apoptoze, ćelije tretirane arbutinom su sakupljene i obojene fluorescein izotiocijanatom označenim Aneksinom-V i P I (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) u mraku 15 minuta na sobnoj temperaturi. Stopa apoptoze ćelija je procenjena korišćenjem FACSCalibur protočnog citometra (BD Biosciences) sa softverom CellQuest Pro (verzija 5.2; BD Biosciences).
Test bojenja alkalnom fosfatazom (ALP). Osteoblasti su posađeni u {{0}} ploče sa gustinom od 5x104 ćelija/jažici inkubirani u -MEM koji sadrži osteogeni dodatak i tretirani sa 0 (kontrola), 10, 50 ili 100 µM arbutina. Nakon 9 dana na 37˚C, ćelije su isprane tri puta sa PBS-om i fiksirane u 4% paraformaldehida na sobnoj temperaturi 10 minuta. Ćelije su tri puta isprane destilovanom vodom i zatim obojene pomoću 5-bromo-4-hloro-3-indolil fosfata/nitro plavog tetrazolijum klorida ALP kompleta za razvoj boje (Beyotime Institute of Biotechnology) tokom 2 h na RT. Obojene ćelije su snimljene pomoću svetlosnog mikroskopa (uvećanje, x40; Eclipse Ti; Nikon Corporation).
Kvantitativna polimerazna lančana reakcija reverzne transkripcije (RT-qPCR). Ćelije su zasijane u 6-ploče sa gustinom od 2x105 ćelija/jažici. Nakon tretmana arbutinom u različitim koncentracijama tokom 3 dana na 37˚C, ukupna RNK je ekstrahirana iz MC3T3‑E1 ćelija korištenjem RNAiso Plus reagensa (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Kina). Ukupno, 1 µg RNK je reverzno transkribirano u cDNK korištenjem PrimeScript RT kompleta reagensa sa gDNA Eraser-om (Takara Biotechnology Co., Ltd.), prema uputama proizvođača. Uslovi reakcije su bili sledeći: 42˚C tokom 2 min, 37˚C tokom 15 min i 85˚C tokom 5 sekundi. qPCR je izveden korištenjem jednakih količina cDNK iz svakog uzorka u ukupnoj zapremini od 20 µl sa ABI 7500 Fast Real-Time PCR sistemom (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD) koristeći SYBR premiks Ex Taq II (Takara Biotechnology Co., Ltd.). Korišteni su sljedeći uvjeti termocikliranja: Početna denaturacija na 95˚C u trajanju od 30 sekundi, nakon čega slijedi 40 ciklusa na 95˚C u trajanju od 5 sekundi i 60˚C u trajanju od 34 sec. Specifičnost amplifikacije je procijenjena analizom krive topljenja, a -aktin je služio kao interna kontrola. Relativni nivoi ekspresije gena analizirani su metodom 2-ΔΔCq (18). Sekvence korištenih prajmera bile su sljedeće: Runt-related transkripcijski faktor 2 (RUNX2), naprijed 5'‑CCAACCGAGTCATTTAAGGCT-3', reversno 5'-GCTCACGTCGCTCATCTTG-3'; kolagen tip I 1 lanac (COL1A1), naprijed 5'-GCCTCCCAGAACATC ACCTA‑3', reversno 5'-GCAGGGACTTCTTGAGGTTG-3';kost -karboksiglutamat protein (BGLAP), naprijed 5'-CGCTACCTTGGAGCCTCAGT-3', obrnuto 5'‑AGGCGGTCTTCAAGCCATAC‑3'; Sp7 transkripcijski faktor (SP7), naprijed5'‑AAGGTGTACGGCAAGGCTTC‑3', revers 5'‑CGTCAGAGCGAGTGAACCTC‑3'; -catenin, napred 5'‑ATGGAGCCGGACAGAAAAGC‑3', revers 5'‑CTTGCCACTCAGGGAAGGA‑3'; -aktin, naprijed 5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3', obrnuto 5'‑CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'.
Western blot analiza. MC3T3‑E1 ćelije su posađene u 6-ploče sa gustinom od 2x105 ćelija/jažici. Ćelije su tretirane arbutinom u različitim koncentracijama 3 dana i isprane tri puta ledeno hladnim PBS-om. Ukupni ćelijski protein je ekstrahovan iz MC3T3-E1 ćelija korišćenjem pufera za lizu radioimunoprecipitacije (Beyotime Institute of Biotechnology) koji sadrži 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida. Proteini su izolovani nakon centrifugiranja na 13,800 xg tokom 15 minuta na 4˚C. Koncentracija proteina je kvantificirana korištenjem kompleta za analizu proteina bicinhoninske kiseline (Beyotime Institute of Biotechnology). Jednake količine proteina (20-30 µg) u svakom uzorku su odvojene sa 10 posto SDS-PAGE tokom 2 h pri konstantnom naponu (110 V) i prebačene na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF) (EMD Millipore, Billerica, MA, SAD). Membrane su blokirane u TBS plus Tween-20 (TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7,5 i 0,1 posto Tween-20) koji sadrži 5 posto nemasnog mlijeka na sobnoj temperaturi 2 h, a zatim inkubirano preko noći na 4˚C sa odgovarajućim primarnim antitelima. Korištena su sljedeća antitijela: zečji monoklonski anti- -katenin (1:5,000; kat. br. ab32572; Abcam, Cambridge, MA, SAD), zečji poliklonalni anti-RUNX2 (1: 1,000; kat.br. ab23981; Abcam) i mišji poliklonalni anti- -aktin (1:1,000; kat. br. AF0003; Beyotime Biotehnološki institut). Nakon toga, membrane su tri puta isprane sa TBST, a PVDF membrane su inkubirane sa kozjim anti-zečjim imunoglobulinom G (IgG; 1:10,000; kat. br. ZB{{) konjugiranim s peroksidazom hrena (HRP) 52}}; OriGene Technologies, Inc., Peking, Kina) ili HRP-konjugirani kozji antimišji IgG (1:10,000; kat. br. ZB-2305; OriGene Technologies, Inc.) na RT tokom 2 h . Proteini su vizualizovani korišćenjem reagensa za poboljšanu hemiluminiscenciju (Thermo Fisher Scientific, Inc.) i detektovani sistemom za detekciju hemiluminiscencije (Amersham Imager 600; GE Healthcare Life). Proteini su kvantificirani pomoću softvera ImageJ (verzija 1.52; National Institutes of Health, Bethesda, MD, SAD). Nakon normalizacije, relativni nivoi ekspresije proteina su izračunati sa -aktinom kao internom kontrolom.
Statistička analiza. Svi eksperimenti su ponovljeni nezavisno najmanje tri puta. Statističke analize su obavljene pomoću GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija, a značajne razlike su analizirane jednosmjernom analizom varijanse u kombinaciji sa Dunettovim post hoc testom. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
Rezultati
Arbutin potiče proliferaciju ćelija MC3T3-E1. Efekti arbutina na proliferaciju ćelija MC3T3-E1 ispitani su pomoću CCK-8 testa. Arbutin je davan u različitim koncentracijama (0, 10, 50 i 100 µM) tokom 24, 48 i 72 h, a izvršena je i CCK-8 analiza (slika 2A). Nakon 24 h nisu utvrđene statističke razlike u proliferaciji osteoblasta u poređenju sa netretiranim kontrolnim ćelijama. Međutim, proliferacija MC3T3-E1 ćelija značajno je povećana nakon tretmana arbutinom pri 100 µM nakon 48 i 72 h. Test označavanja EdU obavljen je nakon 72 h, a rezultati su pokazali da je postotak EdU-pozitivnih MC3T3-E1 ćelija tretiranih arbutinom u koncentraciji od 50 i 100 µM značajno povećan u poređenju sa netretiranom kontrolom (sl. 2B i C) .
Arbutin ubrzava progresiju ćelijskog ciklusa. Efekti arbutina na progresiju ćelijskog ciklusa procenjeni su analizom ćelijskog ciklusa (slika 3). Tretman arbutinom od 50 i 100 µM doveo je do povećanja procenta ćelija u S-fazi (sl. 3A i C), a 100 µM arbutina je doveo do smanjenja procenta ćelija u G1-fazi ( Slika 3D). Nisu identifikovane statistički značajne razlike u grupi od 10 µM u poređenju sa kontrolnom grupom. Efekti arbutina na apoptozu MC3T3-E1 takođe su procenjeni pomoću protočne citometrije (slike 3B i E). Stopa apoptoze nije značajno promijenjena nakon tretmana arbutinom pri 10, 50 i 100 µM u poređenju sa kontrolom.
Efekti arbutina na aktivnost ALP. Efekti arbutina na diferencijaciju osteoblasta analizirani su ALP bojenjem. Nakon 9 dana, tretman različitim koncentracijama arbutina (0, 10, 50 ili 100 µM) značajno je povećao aktivnost ALP u poređenju sa kontrolnom grupom (slika 4A). Sadašnji nalazi sugeriraju da arbutin može povećati aktivnost ALP u MC3T3-E1 ćelijama.
Efekti arbutina na nivoe ekspresije mRNA COL1A1, ‑katenina, RUNX2, BGLAP i SP7. Nivoi ekspresije mRNA COL1A1, -catenina, RUNX2, BGLAP i SP7 procijenjeni su u MC3T3-E1 ćelijama pomoću RT-qPCR nakon tretmana arbutinom u različitim koncentracijama (0, 10, 50 ili 100 µM) za 3 dana. Nivoi ekspresije COL1A1 i -katenina su povećani u osteoblastima tretiranim sa 10, 50 i 100 µM arbutina u poređenju sa netretiranim ćelijama (Slika 4B i C). Nivoi ekspresije RUNX2, BGLAP i SP7 su značajno povećani nakon tretmana arbutinom pri 50 i 100 µM (slika 4D-F).
Efekti arbutina na nivoe ekspresije proteina -katenina i RUNX2. Da bi se istražili osnovni mehanizmi diferencijacije osteoblasta izazvane arbutinom, nivoi ekspresije proteina RUNX2 i -katenina ispitani su u MC3T3-E1 ćelijama Western blottingom (slike 5A i B). Tretman arbutinom pri 100 µM značajno je povećao nivoe ekspresije proteina -katenina i RUNX2 u osteoblastima u poređenju sa kontrolama (sl. 5C i D, respektivno). Sadašnji rezultati sugeriraju da arbutin može utjecati na diferencijaciju osteoblasta regulacijom nivoa ekspresije proteina -katenina i RUNX2. Da bi se ispitalo da li arbutin stimuliše osteoblastičku diferencijaciju putem signalnog puta Wnt/-katenina, ćelije MC3T3-E1 su tretirane sa 0,5 µg/ml DKK1 tokom 6 sati pre tretmana sa 100 µM arbutina.
DKK1 je značajno inhibirao ekspresiju proteina RUNX2 izazvanu arbutinom (slika 5E). Sadašnji rezultati sugeriraju da arbutin može utjecati na diferencijaciju osteoblasta putem Wnt/-catenin signalnog puta.
Diskusija
Osteoporoza može dovesti do ozbiljnih fraktura i invaliditeta i predstavlja problem vezan za uzrast širom svijeta (19). Akumulirani dokazi su pokazali da neravnoteža između osteoklasta i osteoblasta u formiranju i resorpciji kosti može dovesti do osteoporoze (20). Primjetno, formiranje kosti ovisi o proliferaciji i diferencijaciji osteoblasta (21,22).
Više dostupnih lijekova koji se koriste za liječenje osteoporoze su antiresorptivni lijekovi (23); međutim, ovi tretmani nisu u stanju da preokrenu gubitak koštane mase (24). Anabolički agensi koji stimulišu formiranje kostiju mogu obnoviti ozbiljno oštećenu mikrostrukturu skeleta i gubitak koštane mase (24). Teriparatid je jedan anabolički agens za koji je dokazano da stimulira stvaranje kosti, a klinička ispitivanja su pokazala da liječenje teriparatidom smanjuje rizik od novih prijeloma kralježaka i povećava mineralnu gustoću kostiju u kuku, lumbalnoj kralježnici i vratu femura (25). Posebno, teriparatid je skup tretman. Stoga je važno razviti nove lijekove koji mogu djelotvorno promovirati formiranje kostiju.
Arbutin je citoprotektivno sredstvo i ne ispoljava značajne citotoksične efekte u visokim koncentracijama (26). Iako je koncentracija arbutina u krvi nejasna (13), arbutin se koristi kao urinarni antimikrobni lijek i smatra se sigurnim oralnim sredstvom (27,28). Prethodne studije su pokazale da arbutin može pokazati višestruke aktivnosti, uključujući izbjeljivanje kože (10,11), antiinflamatorno (29), antikancerogeno (30) i supresiju diferencijacije osteoklasta (13). Međutim, potrebne su daljnje studije kako bi se istražili učinci arbutina na osteoblaste i njegov potencijal da se koristi kao novo jedinjenje za liječenje osteoporoze. Stoga je ova studija istraživala efekte arbutina na proliferaciju i diferencijaciju MCET3-E1 ćelija i mehanizme koji su u osnovi funkcije arbutina in vitro.
Formiranje kostiju povezano je sa brojem osteoblasta i aktivnošću pojedinačnih osteoblasta (31). Broj osteoblasta može se povećati promoviranjem preosteoblastne replikacije ili diferencijacije, ili smanjenjem stanične smrti zrelih osteoblasta (32). U ovoj studiji, arbutin je povećao proliferaciju MC3T3-E1 ćelija bez uticaja na brzinu apoptoze. Pored toga, arbutin je povećao progresiju ćelijskog ciklusa pomicanjem ćelija iz G1-faze u S-fazu. Ovi rezultati sugeriraju da arbutin može inducirati osteoblastnu proliferaciju.
ALP je rani marker osteogene diferencijacije (33). ALP je povezan sa kalcifikacijom skeleta tokom formiranja kosti (34). U ovoj studiji, rezultati ALP bojenja sugeriraju da su osteoblasti tretirani arbutinom u koncentraciji od 10, 50 i 100 µM, i sa osteogenim dodatkom tokom 9 dana, pokazali povećanu aktivnost ALP, što sugerira da arbutin može promovirati ranu diferencijaciju osteoblasta.
Pokazalo se da je osteogeneza regulirana različitim faktorima transkripcije, uključujući RUNX2 i SP7, i višestrukim proteinima matriksa specifičnim za kosti, uključujući ALP,BGLAP i COL1A1 (35). RUNX2 i SP7 su važnitranskripcijski faktori uključeni u diferencijaciju osteoblastatokom formiranja kosti (36). COL1A1 je ekstracelularnamatriks protein koji potiče regeneraciju kostiju i osteodiferencijacija blasta (37). BGLAP je nekolagenProtein koštanog matriksa koji reguliše promet kostiju i kostimineralizacija (38). Ova studija je identifikovala taj arbutinmože izazvati nivoe ekspresije mRNA važnihosteogeni regulatori, uključujući RUNX2, BGLAP, SP7 iCOL1A1. Dodatno, nivo ekspresije -catenin je biopovećana. Ovi rezultati sugeriraju da arbutin može promoviratiosteoblastna diferencijacija kroz mehanizam koji uključujeWnt/ -catenin signalizacija.
Wnt signalni put utiče na formiranje kosti tokom razvoja i na remodeliranje kostiju tokom obnove tkiva (39). Kanonski Wnt signalni put je bioidentificirano da je inicirano signalizacijom Wnt liganda u ćelijipovršine kroz receptore lipoproteina niske gustineprotein 5 ili 6 (Lrp5/6) i sedmoprolaznu transmembranuReceptor za kovrče (40). Interakcija između Wnt ligandaa njihov receptor može inhibirati GSK3- u citoplazmi,što dovodi do oslobađanja -katenin, transkripcioni medijator kanonske Wnt signalizacije. Nakon objavljivanja, -cateninmože ući u jezgro, kontrolirajući tako ekspresijunivoe njegovih ciljnih gena (41). RUNX2 pripada Runtufamilija gena domena i transkripcijski je faktor uključen uosteoblastična diferencijacija (42). RUNX2 služi kao važanulogu u koordinaciji više signalnih puteva tokomdiferencijacija osteoblasta (43). Demon iz prethodne studijesmatra da kanonska Wnt signalizacija može direktno regulisatiRUNX2. Konkretno, the -catenin/HNF1 homeobox Akompleks može aktivirati nivo ekspresije RUNX2,čime se potiče formiranje kostiju (44). DKK1 je moćaninhibitor Wnt/ -catenin kanonski put, vezivanjemdo Lrp5/6 (45,46). Rezultati ove studije sugerirajuda je tretman arbutinom značajno povećao proteinnivoi ekspresije RUNX2 i -katenin u MC3T3‑E1ćelije, a DKK1 je značajno smanjio ekspres proteinanivo RUNX2. Sadašnji rezultati ukazuju na toarbutin može promovirati diferencijaciju MC3T3-E1 stanica putem kanonskog Wnt/-kateninski put.
Zajedno, prema najboljem saznanju autora, ova studija je prva koja ukazuje na to da arbutin može stimulirati proliferaciju i diferencijaciju MC3T3-E1 ćelija putem Wnt/-catenin signalnog puta. Stoga, arbutin može predstavljati novi potencijalni kandidat za liječenje osteoporoze. Međutim, potrebne su dalje studije da bi se identifikovala specifična uloga Wnt/-katenin signalnog puta u osteogenezi izazvanoj arbutinom, uključujući fosforilaciju -katenina u Ser675 (47); dalje informacije o ulozi Wnt/-katenin signalizacije mogu se dobiti upotrebom Wnt agonista. U budućnosti, daljnje studije bi mogle istražiti sposobnost arbutina da promovira formiranje kosti in vivo.
Priznanja
Nije primjenjivo.
Finansiranje
Ovaj rad je podržan od strane Glavnog programa Nacionalne fondacije za nauku o prirodi Kine (grant br. 81370981) i Izuzetnog naučnog fonda bolnice Shengjing.
Dostupnost podataka i materijala
Skupovi podataka korišteni i/ili analizirani tokom tekuće studije dostupni su od odgovarajućeg autora na razuman zahtjev.
Doprinosi autora
QF, XM i LiY su osmislili i dizajnirali eksperimente. XM je izveo eksperimente i napisao rukopis. SL, LiY, LeY i ML analizirali su podatke i kritički revidirali rukopis. QF je nadgledao sva istraživanja i revidirao rukopis. Svi autori su pročitali i odobrili konačni rukopis.
Etičko odobrenje i saglasnost za učešće
Nije primjenjivo.
Pristanak pacijenata za objavljivanje
Nije primjenjivo.
Konkurentni interesi
Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljene interese.
Reference
1. Das S i Crockett JC: Osteoporoza – trenutni pogled na farmakološku prevenciju i liječenje. Drug Des Devel Ther 7435-448.2013.
2.Rachner TD, Khosla S i Hofbauer LC: Osteoporoza: Sada i budućnost.Lancet 377: 1276-1287. 2011.
3.Hernlund E, Svedbom A, Ivergard M, Compston J, Cooper CStenmark JMcCloskey EVJOnsson B i Kanis JA: Osteoporoza u Evropskoj uniji: Medicinski menadžment, epidemiologija i ekonomsko opterećenje. Izvještaj pripremljen u saradnji sa međunarodnom fondacijom za osteoporozu (IOF) i Evropskom federacijom udruženja farmaceutske industrije (EFPIA). Arch Osteoporos 8: 136.2013.
4. Cauley JA: Uticaj osteoporoze na javno zdravlje. J Gerontol ABiol Sci Med Sci 68: 1243-1251.2013.
5. Manolagas SC i Jilka RL: Koštana srž, citokini i remodeliranje kostiju. Novi uvidi u patofiziologiju osteoporoze. N Engl J Med 332: 305-311. 1995.
6. Baron R i Hesse E: Ažuriranje o koštanim anabolicima u liječenju osteoporoze: Obrazloženje, trenutno stanje i perspektive. J ClinEndocrinol Metab 97: 311-325.2012.
7.TangDZ, Hou WZhou Q, ZhangM, HolzJ, SheuTJ, LiTF ChengSDShi O. Harris SE.et al: Osthole stimulira diferencijaciju osteoblasta i formiranje kosti aktivacijom beta-catenin-BMP signalizacije Bone Miner Res 25: 1234-1245 . 2010.
8. Canalis E: Ažuriranje novih anaboličkih terapija za osteoporozu. J Clin Endocrinol Metab 95: 1496-1504.2010.
9. Lamien-Meda A, Lukas B, Schmiderer C, Franz C i Novak J: Validacija kvantitativne analize arbutina upotrebom gasne hromatografije u ekstraktima Origanum majorana i Arctostaphylos uva-ursi. Phytochem Anal 20: 416-420.2009. .
10.Lim YJ, Lee EH, Kang TH, Ha SK, Oh MS, Kim SM, Yoon TJ.Kang C, Park JH i Kim SY: Inhibicijski efekti arbutina na biosintezu melanina hiperpigmentacije izazvane alfa-melanocitnim hormonom u kultivisanim braonkastim tkivima kože zamorca. Arch Pharm Res 32: 367-373.2009.
11. Maeda K i Fukuda M: Arbutin: Mehanizam njegovog depigmentirajućeg djelovanja u kulturi ljudskih melanocita. J Pharmacol ExpTher 276: 765-769.1996.
12. Wu LH Li P Zhao OL. Piao JL Jiao YF Kadowaki M i Kondo T: Arbutin. intracelularni čistač hidroksilnih radikala štiti apoptozu izazvanu zračenjem u ćelijama humanog limfoma U937. Apoptoza 19: 1654-1663.2014
13. Omori A Yoshimura Y. Deyama Y i Suzuki K: Rosmarinska kiselina i arbutin potiskuju diferencijaciju osteoklasta inhibiranjem superoksida i smanjenja NFATela u ćelijama RAW 264.7 Biomed Rep 3: 483-490.2015.
14. Baron R i Kneissel M: WNT signalizacija u homeostazi i bolesti kostiju: od ljudskih mutacija do tretmana. Nat Med 19.179-197.2013
15. Baron R i Rawadi G: Usmjeravanje na put Wnt/beta-catenin za regulaciju formiranja kostiju u skeletu odrasle osobe. Endokrinologija 148: 2635-2643.2007.
16. Hoeppner LH Secreto FJ i Westendorf JJ: Wnt signalizacija kao terapeutska meta za bolesti kostiju. Expert Opin TherTargets 13: 485-496.2009.
17. Williams BO i Insogna KL: Gdje je Wnts otišao: Eksplodirajuće polje Lrp5 i Lrp6 signalizacije u kosti. J Bone Miner Res 24:171-178.2009
18. Livak KJ i Schmittgen TD: Analiza relativnih podataka o ekspresiji gena korištenjem kvantitativne PCR u realnom vremenu i 2(-Delta DeltaC(T) metode Metode 25:402-408.2001.
19.Lin X. Xiong D. Peng YO. Sheng ZF. Wu XY Wu XP Wu FYuan LO i Liao EY: Epidemiologija i upravljanje osteom. poroza u Narodnoj Republici Kini: Trenutne perspektive. Clin Interv Aging 10: 1017-1033.2015.
20. Manolagas SC: Rađanje i odumiranje koštanih ćelija: Osnovni regulatorni mehanizmi i implikacije za patogenezu i liječenje osteoporoze. Endocr Rev 21: 115-137.2000.
21. Liu S. Fang T. Yang L. Chen Z. Mu S i Fu O: Gastrodin štiti MC3T3-El osteoblaste od deksametazonom izazvane ćelijske disfunkcije i potiče formiranje kosti putem indukcije NRF2 signalnog puta. Int J Mol Med 41: 2059-2069.2018.
22. Yun HM Park KR. Quang TH Oh H. Hong JT. Kim YC i Kim EC: 2.4.5-Trimethox yldalbergiquinol promovira osteoblastnu diferencijaciju i mineralizaciju putem BMP i Wnt/B-catenin puta. Cell Death Dis 6: el819. 2015.
23. Cosman F Nieves JW i Dempster DW: Slijed tretmana1718.22.matters: Anabolička i antiresorptivna terapija za osteoporozu Bone Miner Res 32: 198-202.2017
24.Uihlein AV i Leder BZ: Anaboličke terapije za osteoporozu.Endocrinol Metab Clin North Am 41: 507-525.2012.
25. Nakamura T. Sugimoto T. Nakano T. Kishimoto H. Ito MFukunaga MHaginoH Sone T. Yoshikawa Nishizawa Y.eral Randomizirani teriparatid (humani paratiroidni hormon (PTH1-341) jednom tjedno smanjenje efikasnosti istraživanja triala (TOWER) nove frakture pršljenova kod osoba sa primarnom osteoporozom i visokim rizikom od prijeloma J Clin Endocrinoetab 97: 3097-3106.2012.
26. Jurica K Brčić Karabonji l, Mikolić A, Milcjković-Opsenica DBenković V, i Kopjar N: In vitro procena bezbednosti ekstrakta vodenog lista drveta jagode (Arbrrfus redo L) i limfocita humane periferne krvi arbutina. Citotehnologija 70: 1261-1278.2018
27. Schindler G. Patzak U Brinkhaus B. pobijedio Niecieck A. Wittig JKrihmer N Glockl land Veit M: Izlučivanje urina i Metabo. lista arbutina nakon oralne primjene ekstrakta Arctosfaphylos reversi u obliku filmom obloženih tableta i vodene otopine kod zdravih ljudi. J Clin Pharmacol 42: 920-927.2002.
28. Genowese C Davinelli S. Mangano K, Tempera G, Nicolosi D.Corsello S.Vergalito F Tartaglia E. Scapagnini G i Di Marco R: Efekti nove kombinacije biljnih ekstrakata plus d-manoze za liječenje nekompliciranih recidivnih urinarnog trakta infekcije. J Chemother 30: 107-114. 2018
29. Lee HJ i Kim KW: Protuupalni efekti arbutina u BV2 mikroglijalnim ćelijama stimulisanim lipopolisaharidom. InfiammRes 61: 817-825.2012.
30. Jiang L. Wang D Zhang Y. Li J. Wu Z. Wang Z i Wang D. Istraživanje pro-apoptotičkih efekata arbutina i njegovog acetiliranog derivata na ćelije melanoma miša. Int J Mol Med 41:1048-1054.2018
31. Marie PJ i Kassem M: Osteoblasti u osteoporozi: Pastemerging i budući anabolički ciljevi. Eur J Endocrinol 165:1-10.2017
32. Canalis E: Menadžment endokrinih bolesti: Novi anabolički tretmani za osteoporozu. Eur J Endocrinol 178: R33-R44. 2018
33. Weinreb M Shinar D i Rodan GA: Različiti obrazac ekspresije alkalne fosfataze, osteopontina i osteokalcina u razvoju kosti pacova vizualiziran hibridizacijom in situ. J BoneMiner Res 5: 831-842.1990.
34. Kim YJ. Lee MH Wozney JM Cho JY i Ryoo HM: Ekspresija alkalne fosfataze izazvana morfogenetskim proteinom kosti-2- stimulisana je Dlxsom i potisnuta od strane Msx2. J BioChemm 279: 50773-50780.2004
35. An JYang H Zhang O. Liu C. Zhao J. Zhang L i Chen B. Prirodni proizvodi za liječenje osteoporoze: efekti i mehanizmi na promicanje života formiranja kostiju posredovane osteoblastom Sci 147: 46-58.2016
36. Kobavashi T i K ronenbere H: Mini pregled: Regulacija transkripcije u razvoju kosti.Endokrinoloey 146: 1012-1017.2005.
37. Cathev i Reddy ABaltordal.oiczThrombospondin-2 olakšavaju sklapanje matriksa bogatog kolagenom tipa I u stromalnim stanicama srži koje prolaze kroz različite osteoblastične stanice. Connect Tissue Res 54: 275-782.2013
38. Neve A. Corrado A i Cantatore FP: Osteokalcin: Skeletni i ekstra-skeletni efekti J Cell Physiol 228: 1149-1153.2013.
39. Wang Y.Li YP Paulson C, Shao Jz, Zhang X Wu M i Chen su prošli i Wnt signalni put u razvoju kostiju i bolesti. Front Biosci (Landmark Ed) 19: 379-407.2014
40.MacDonald BT. Tamai K i He X: Wnt/beta-catenin signalne komponente. mehanizama. i bolesti. Dev Cell1 17: 9-26. 2009
41. Kramer l. Halleux C, Keller H, Pegurri M, Gooi JHWeber PB. Feng JO. Bonewald LF i Kneissel M: OsteocytWnt/beta-catenin signalizacija je potrebna za normalnu homeostazu kosti. Mo Cel1 Biol 30: 3071-3085.2010
42. Ducy P Schinke T i Karsenty G: Osteblast: Sofisticirani fibroblast pod centralnim nadzorom. Science 289:1501-1504.2000
43. Franceschi RI i Xiao G: Regulacija transkripcionog faktora specifičnog za osteoblast. RUNX2: Reakcija na višestruke puteve signalne transdukcije. J Cell Biochem 88: 446-454.2003
44. Gaur T, Lengner Cl, Howhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVKomm BS. Javed A. van Wijnen AJ. Stein JL. Stein GS Lian JB: Canonical WNT signalizacija promovira osteogenezu direktno stimulirajući ekspresiju gena Runx2. J Biol Chem 280:33132-33140.2005
45. Kawano Y i Kypta R: Izlučeni antagonisti Wnt signalnog puta. J Cel1 Sci 116: 2627-2634.2003
46. Daoussis D i Andonopoulos AP: Nova uloga otDickkopf-l u biologiji kostiju: da li je to glavni prekidač koji kontroliše remodeliranje kostiju i zglobova? Semin Arthritis Rheum 41: 170-177.2011
47. Taurin S.Sandbo N. Qin Y. Browning D i Dulin NO: Fosforilacija beta-katenina cikličnom AMP-ovisnom protein kinazom. J Biol Chem 281: 9971-9976.2006
Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
